Kommissionens förordning (EU) nr 640/2012 av den 6 juli 2012 om ändring, för anpassning till den tekniska utvecklingen, av förordning (EG) nr 440/2008 om testmetoder enligt Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach) (Text av betydelse för EES)
EUROPEISKA KOMMISSIONEN HAR ANTAGIT DENNA FÖRORDNING
med beaktande av fördraget om Europeiska unionens funktionssätt,
med beaktande av Europaparlamentets och rådets förordning nr 1907/2006 av den 18 december 2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach), inrättande av en europeisk kemikaliemyndighet, ändring av direktiv 1999/45/EG och upphävande av rådets förordning (EEG) nr 793/93 och kommissionens förordning (EG) nr 1488/94 samt rådets direktiv 76/769/EEG och kommissionens direktiv 91/155/EEG, 93/67/EEG, 93/105/EG och 2000/21/EG, särskilt artikel 13.3, och
1 I kommissionens förordning (EG) nr 440/2008 fastställs testmetoder som ska användas för tillämpning av förordning (EG) nr 1907/2006 när det gäller bestämning av ämnens fysikalisk-kemiska egenskaper, toxicitet och ekotoxicitet.
2 Det är nödvändigt att uppdatera förordning (EG) nr 440/2008 för att med prioritet införa nya och uppdaterade testmetoder som nyligen har antagits av OECD, i syfte att minska användningen av djur för försöksändamål, i enlighet med Europaparlamentets och rådets direktiv 2010/63/EU av den 22 september 2010 om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål och rådets direktiv 86/609/EEG av den 24 november 1986 om tillnärmning av medlemsstaternas lagar och andra författningar om skydd av djur som används för försök och andra vetenskapliga ändamål. Samråd har förts med berörda parter om detta utkast.
3 Förordning (EG) nr 440/2008 bör därför ändras i enlighet med detta.
4 De åtgärder som föreskrivs i denna förordning är förenliga med yttrandet från den kommitté som inrättats genom artikel 133 i förordning (EG) nr 1907/2006.
HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.
Artikel 1
Bilagan till förordning (EG) nr 440/2008 ska ändras i enlighet med bilagan till den här förordningen.
Artikel 2
Denna förordning träder i kraft den tredje dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning.
1 EUT L 396, 30.12.2006, s. 1.
2 EUT L 142, 31.5.2008, s. 1.
3 EUT L 276, 20.10.2010, s. 33.
4 EGT L 358, 18.12.1986, s. 1.
BILAGA
Bilagan till förordning (EG) nr 440/2008 ska ändras på följande sätt:
1 Kapitel B.42 ska ersättas med följande:
2 Kapitel B.46 ska ersättas med följande:
3 Följande kapitel ska läggas till:
2 Dessa referenskemikalier är en underuppsättning av de referenskemikalier som användes i valideringsstudien.
3 In vivo-gradering enligt B.4 och OECD:s testriktlinje 404 (4).
4 I denna testmetod betraktas FN:s valfria GHS-kategori 3 (svagt irriterande ämnen) (1) som ingen kategori.
5 FN:s valfria GHS-kategori 3 är inte tillämplig enligt CLP-förordningen.
Tillägg 1
Prestandastandarder för bedömning av föreslagna liknande eller modifierade LLNA-testmetoder för hudsensibilisering
INLEDNING
1. Syftet med prestandastandarder är att tillhandahålla en grund när man fastställer att nya testmetoder, både äganderättsligt skyddade (dvs. metoder med upphovsrätt, varumärke eller registrering) och allmänt tillgängliga metoder, är tillräckligt exakta och tillförlitliga för specifika testningsändamål. Dessa prestandastandarder, som grundar sig på validerade och godtagna testmetoder, kan användas för att utvärdera tillförlitligheten och exaktheten hos andra liknande metoder (vardagligt kallade me too-test) som grundar sig på liknande vetenskapliga principer och som mäter eller förutser samma biologiska eller toxikologiska effekt (14).
2. Innan man antar modifierade metoder (dvs. föreslagna potentiella förbättringar av en godkänd testmetod) krävs en utvärdering för att fastställa de föreslagna ändringarnas inverkan på testets prestanda och i vilken utsträckning sådana förändringar påverkar den tillgängliga informationen för de andra komponenterna i valideringsprocessen. Beroende på de föreslagna ändringarnas antal och karaktär, genererade data och stödjande dokumentation för ändringarna, bör de antingen vara föremål för samma valideringsprocess som gäller för nya testmetoder eller, där det är lämpligt, för en begränsad bedömning av tillförlitlighet och relevans med användning av etablerade prestandastandarder (14).
3. När liknande eller modifierade metoder föreslås för användning inom denna testmetod bör deras tillförlitlighet och exakthet utvärderas med hjälp av kemikalier som representerar hela skalan av LLNA-utfall. För att omotiverad användning av djur ska undvikas rekommenderas starkt att de som utvecklar modeller först konsulterar lämpliga myndigheter innan valideringsstudier inleds enligt de prestandastandarder och den vägledning som anges i denna testmetod.
4. Dessa prestandastandarder baserar sig på de harmoniserade prestandastandarderna, US-ICCVAM (Förenta staterna), EC ECVAM (EG) och JaCVAM (Japan) (12), för utvärdering av validiteten hos liknande eller modifierade versioner av LLNA. Prestandastandarderna består av testmetodens grundläggande komponenter, rekommenderade referenskemikalier samt de standarder för exakthet och tillförlitlighet som en föreslagen metod minst måste uppfylla.
I. Testmetodens grundläggande komponenter
5. För att se till att liknande eller modifierade LLNA-metoder är funktionellt och mekaniskt analoga med LLNA och mäter samma biologiska verkan, måste testmetodprotokollet innehålla följande komponenter: Testämnet ska appliceras på mössens båda öron. Proliferationen av lymfocyter ska mätas i de lymfnoder som dränerar det område där testämnet appliceras. Proliferationen av lymfocyter ska mätas under hudsensibiliseringens induktionsfas. Den högsta dosen som väljs för ett testämne ska vara den högsta koncentrationen som inte inducerar systemisk toxicitet och/eller särskilt kraftig lokal hudirritation hos mössen. För positiva referenskemikalier ska den högsta dosen vara minst lika hög som LLNA EC3-värdena för motsvarande referenskemikalier (se tabell 1) utan att det uppstår systemisk toxicitet och/eller särskilt kraftig hudirritation hos mössen. Varje försök ska omfatta en parallell vehikelkontrollgrupp och, där det är lämpligt, en parallell positiv kontrollgrupp. Varje dosgrupp ska omfatta minst fyra djur. Insamlingen av data kan ske på individuell eller poolad grund. Om något av dessa kriterier inte uppfylls kan dessa prestandastandarder inte användas för validering av en liknande eller modifierad metod.
II. Minimiförteckning över referenskemikalier
6. I de harmoniserade prestandastandarderna US-ICCVAM, EC-ECVAM och JaCVAM (12) anges 18 referenskemikalier som minst måste användas och 4 alternativa referenskemikalier (dvs. ämnen som ger antingen falska positiva eller falska negativa resultat i LLNA, jämfört med resultat från människor och marsvin [B.6 eller OECD:s testriktlinje 406] (13) och som därför ger möjlighet att påvisa samma eller bättre prestanda än LLNA) som ingår i prestandastandarderna för LLNA. För kemikalierna användes följande urvalskriterier: Förteckningen över referenskemikalier representerar de typer av ämnen som typiskt testas för sin hudsensibiliseringspotential och den responsskala som kan mätas eller förutses med LLNA. Ämnena har en väldefinierad kemisk struktur. LLNA-data från test på marsvin (dvs. B.6; OECD:s testriktlinje 406) (13) och (där det är möjligt) data från människor finns att tillgå för varje ämne. Ämnena kan enkelt införskaffas på marknaden. De rekommenderade referenskemikalierna förtecknas i tabell 1. När de föreslagna referenskemikalierna används i ett försök ska de utvärderas i den vehikel som de förtecknas med i tabell 1. I situationer där ett förtecknat ämne inte finns att tillgå kan man använda andra ämnen som uppfyller urvalskriterierna, förutsatt att tillbörlig motivering kan ges. Tabell 1 Rekommenderade referenskemikalier för prestandastandarder för LLNA Förkortningar: AOO = aceton:olivolja (4:1, volym/volym), CAS-nummer = Chemical Abstracts Service-nummer, DMF = N,N-dimetylformamid, DMSO = dimetylsulfoxid, DNCB = 2,4-dinitroklorbensen, EC3 = uppskattad koncentration som krävs för att få stimulationsindex 3, Fast = fast ämne, GP = testresultat från marsvin (dvs. B.6 eller OECD:s testriktlinje 406) (13), HCA = hexylkanelaldehyd, LLNA = resultat från murint lokalt lymfnodtest (dvs. B.42 eller OECD:s testriktlinje 429) (1), MEK = metyletylketon, NA = inte tillämpligt eftersom stimulationsindex < 3, NC = ej beräknat eftersom data erhölls från ett enskilt försök, Veh = testvehikel, Vätska = ämne i vätskeform. Nummer Kemikalie CAS-nummer Form Veh EC3 % N 0,5x – 2,0x EC3 Faktisk EC3-skala LLNA vs GP LLNA vs människa 1 5-klor-2-metyl-4-isotiazolin-3-on (CMI)/2-metyl-4-isotiazolin-3-on (MI) 26172-55-4/2682-20-4 Vätska DMF 0,009 1 0,0045–0,018 NC +/+ +/+ 2 DNCB 97-00-7 Fast AOO 0,049 15 0,025–0,099 0,02–0,094 +/+ +/+ 3 4-fenylendiamin 106-50-3 Fast AOO 0,11 6 0,055–0,22 0,07–0,16 +/+ +/+ 4 Koboltklorid 7646-79-9 Fast DMSO 0,6 2 0,3–1,2 0,4–0,8 +/+ +/+ 5 Isoeugenol 97-54-1 Vätska AOO 1,5 47 0,77–3,1 0,5–3,3 +/+ +/+ 6 2-merkaptobensotiazol 149-30-4 Fast DMF 1,7 1 0,85–3,4 NC +/+ +/+ 7 Citral 5392-40-5 Vätska AOO 9,2 6 4,6–18,3 5,1–13 +/+ +/+ 8 HCA 101-86-0 Vätska AOO 9,7 21 4,8–19,5 4,4–14,7 +/+ +/+ 9 Eugenol 97-53-0 Vätska AOO 10,1 11 5,05–20,2 4,9–15 +/+ +/+ 10 Fenylbensoat 93-99-2 Fast AOO 13,6 3 6,8–27,2 1,2–20 +/+ +/+ 11 Kanelalkohol 104-54-1 Fast AOO 21 1 10,5–42 NC +/+ +/+ 12 Imidazolidinylurea 39236-46-9 Fast DMF 24 1 12–48 NC +/+ +/+ 13 Metylmetakrylat 80-62-6 Vätska AOO 90 1 45–100 NC +/+ +/+ 14 Klorbensen 108-90-7 Vätska AOO 25 1 NA NA –/– –/ 15 Isopropanol 67-63-0 Vätska AOO 50 1 NA NA –/– –/+ 16 Mjölksyra 50-21-5 Vätska DMSO 25 1 NA NA –/– –/ 17 Metylsalicylat 119-36-8 Vätska AOO 20 9 NA NA –/– –/– 18 Salicylsyra 69-72-7 Fast AOO 25 1 NA NA –/– –/– Alternativa ämnen för att påvisa bättre prestanda jämfört med LLNA 19 Natriumlaurylsulfat 151-21-3 Fast DMF 8,1 5 4,05–16,2 1,5–17,1 +/– +/– 20 Etylenglykoldimetakrylat 97-90-5 Vätska MEK 28 1 14–56 NC +/– +/+ 21 Xylen 1330-20-7 Vätska AOO 95,8 1 47,9–100 NC +/ +/– 22 Nickelklorid 7718-54-9 Vätska DMSO 5 2 NA NA –/+ –/+
III. Definierad tillförlitlighet och standarder för exakthet
7. Exaktheten hos en liknande eller modifierad LLNA-metod ska vara samma som eller högre än för prestandastandarderna för LLNA när utvärderingen görs med det minsta tillåtna antalet (18) referenskemikalier. Den nya eller modifierade metoden bör ge korrekt klassificering enligt en ja-/nej-beslutsväg. Det kan dock hända att den nya eller modifierade metoden inte ger korrekt klassificering av alla de kemikalier som minst måste användas. Om t.ex. ett av de svaga sensibiliserande ämnena klassificeras fel, kan en motivering för felklassificeringen och lämpliga tilläggsuppgifter (t.ex. testresultat som ger korrekt klassificering för andra ämnen med liknande fysikaliska, kemiska och sensibiliserande egenskaper) anses påvisa likvärdiga prestanda. Under sådana omständigheter utvärderas valideringsstatus för den nya eller modifierade LLNA-testmetoden från fall till fall.
Reproducerbarhet inom laboratoriet
8. För bestämning av reproducerbarheten inom ett laboratorium ska en ny eller modifierad LLNA-metod utvärderas med ett sensibiliserande ämne som är väl karakteriserat i LLNA. Prestandastandarderna för LLNA grundar sig därför på hur resultaten varierar mellan upprepade testningar av hexylkanelaldehyd. För bedömning av tillförlitligheten inom laboratoriet bör värden för uppskattad koncentrationströskel (ECt) för hexylkanelaldehyd härledas vid fyra separata tillfällen med minst en vecka mellan testningarna. Reproducerbarheten inom laboratoriet anses vara godtagbar om varje hexylkanelaldehydtest ger ECt-värden mellan 5 % och 20 %, vilket representerar skalan 0,5–2,0 gånger det medelvärde för EC3 som specificeras för hexylkanelaldehyd (10 %) i LLNA (se tabell 1).
Reproducerbarhet mellan laboratorier
9. För bestämning av reproducerbarheten mellan laboratorier bör en ny eller modifierad LLNA-metod utvärderas med två sensibiliserande ämnen som är väl karakteriserade i LLNA. Prestandastandarderna för LLNA grundar sig på variationerna i resultat från testning av hexylkanelaldehyd och 2,4-dinitroklorbensen (DNCB) i olika laboratorier. ECt-värdena bör tas fram genom enskilda fristående försök i minst tre separata laboratorier. Reproducerbarheten mellan laboratorier anses vara godtagbar om varje laboratorium får ECt-värden som är 5–20 % för hexylkanelaldehyd och 0,025–0,1 % för 2,4-dinitroklorbensen, vilket representerar skalan 0,5–2,0 gånger det EC3-medelvärde som specificeras för hexylkanelaldehyd (10 %) och 2,4-dinitroklorbensen (0,05 %) i LLNA (se tabell 1).
1 Antas inte vara sensibiliserande för människor eftersom inga resultat från kliniska lapptest kunde fås fram, ämnet ingår inte som en allergen i lapptest och inga rapporter om sensibilisering hos människa kunde fås fram.
2 GP-data finns inte att tillgå.
3 Kemikalierna ska beredas dagligen utom om stabilitetsdata visar att lagring kan accepteras.
4 Eftersom olika vehiklar potentiellt kan påverka LLNA-testprestanda bör endast den rekommenderade vehikeln för respektive referenskemikalie användas (24) (32).
5 Medelvärde i fall där flera EC3-värden fanns att tillgå. För negativa ämnen (dvs. med stimulationsindex < 3) anges den högsta testade koncentrationen.
6 Antalet LLNA-försök från vilka data erhållits.
7 Kommersiellt tillgängligt som Kathon CG (CAS-nummer 55965-84-9), som är en 3:1-blandning av CMI and MI. De relativa koncentrationerna för varje komponent varierar från 1,1 % till 1,25 % (CMI) och 0,3 % till 0,45 % (MI). De inaktiva komponenterna är magnesiumsalter (21,5 % till 24 %) och kopparnitrat (0,15 % till 0,17 %), och den återstående formuleringen är 74–77 % vatten. Kathon CG fås från Sigma-Aldrich och Rohm and Haas (numera Dow Chemical Corporation).
Tillägg 2
Definitioner
Tillägg 1
Definitioner
Tillägg 2
Prestandastandarder för bedömning av föreslagna liknande eller modifierade in vitro-metoder med rekonstruerad human hud (RhE) för att testa hudirritation
INLEDNING
1. Syftet med prestandastandarder är att tillhandahålla en grund för att fastställa att nya testmetoder, både äganderättsligt skyddade (dvs. metoder med upphovsrätt, varumärke, registrering) och allmänt tillgängliga metoder är tillräckligt exakta och tillförlitliga för specifika testningsändamål. Dessa prestandastandarder, som grundar sig på validerade och godtagna testmetoder, kan användas för att utvärdera tillförlitligheten och exaktheten hos andra analoga metoder (vardagligt även kallade me too-test) som grundar sig på liknande vetenskapliga principer och som mäter eller förutser samma biologiska eller toxikologiska effekt (9).
2. Innan man antar modifierade metoder (dvs. föreslagna potentiella förbättringar av en godkänd metod) krävs en utvärdering för att fastställa de föreslagna ändringarnas inverkan på testets prestanda och i vilken utsträckning förändringarna påverkar den information som finns att tillgå för de andra komponenterna i valideringsprocessen. Beroende på de föreslagna ändringarnas antal och karaktär, genererade data och stödjande dokumentation för ändringarna, bör de antingen vara föremål för samma valideringsprocess som gäller för nya testmetoder eller, där det är lämpligt, för en begränsad bedömning av tillförlitlighet och relevans med användning av etablerade prestandastandarder (9).
3. Liknande (me too-metoder) eller modifierade metoder av någon av de tre validerade metoderna (EpiSkin™ [validerad referensmetod], EpiDerm™ SIT [EPI-200] och SkinEthic™ RHE) som föreslås för användning inom denna testmetod bör utvärderas för tillförlitlighet och exakthet när man använder kemikalier som representerar hela skalan av Draizes irritationspoäng. Vid utvärderingen med användning av de 20 rekommenderade referenskemikalierna enligt prestandastandarden (tabell 1) bör de föreslagna liknande eller modifierade metodernas värden för tillförlitlighet och exakthet vara jämförbara med eller bättre än de värden som fås med den validerade referensmetoden (tabell 2) (2) (16). De värden för tillförlitlighet och exakthet som bör nås anges i punkterna 8–12 i detta tillägg. Kemikalier i kategorin inte klassificerad (ingen kategori enligt FN:s GHS eller CLP-förordningen) och kategorin klassificerad (kategori 2 enligt FN:s GHS eller CLP-förordningen) (1) som representerar olika kemiska klasser ingår, så att den föreslagna metodens tillförlitlighet och exakthet (känslighet, specificitet och totala exakthet) kan jämföras med motsvarande värden för den validerade referensmetoden. Metodens tillförlitlighet, såväl som metodens förmåga att korrekt identifiera irriterande kemikalier i kategori 2 enligt FN:s GHS eller CLP-förordningen och, beroende på den rättsliga ram som gäller för de uppgifter som tas fram, även metodens förmåga att korrekt identifiera ingen kategori-kemikalier enligt FN:s GHS eller CLP-förordningen, bör bestämmas innan metoden används för testning av nya kemikalier.
4. Dessa prestandastandarder baserar sig på EC-ECVAM:s prestandastandarder (8) som uppdaterats enligt FN:s GHS eller CLP-förordningens system för klassificering och märkning (1) (3). De ursprungliga prestandastandarderna fastställdes efter att valideringsstudien hade slutförts (21) och baserade sig på EU-klassificeringssystemet enligt kommissionens direktiv 2001/59/EG av den 6 augusti 2001 om anpassning till tekniska framsteg för tjugoåttonde gången av rådets direktiv 67/548/EEG om tillnärmning av lagar och andra författningar om klassificering, förpackning och märkning av farliga ämnen. Till följd av att FN:s GHS-system för klassificering och märkning antogs i EU (CLP-förordningen) (3), vilket gjordes mellan slutförandet av valideringsstudien och slutförandet av denna testmetod (8), har prestandastandarderna uppdaterats. Uppdateringen gäller främst ändringar av i) uppsättningen referenskemikalier för prestandastandarderna och ii) de värden som fastställts för tillförlitlighet och exakthet (2) (23).
PRESTANDASTANDARDER FÖR IN VITRO-TESTMETODER MED RhE FÖR HUDIRRITATION
5. Prestandastandarderna består av följande tre element (9): I. Testmetodens grundläggande komponenter II. En minimiförteckning med referenskemikalier. III. Definierade värden för tillförlitlighet och exakthet.
I. Testmetodens grundläggande komponenter
6. Dessa består av de grundläggande strukturella, funktionella och förfarandemässiga delarna i en validerad metod som bör ingå i protokollet för en föreslagen mekaniskt och funktionellt liknande eller modifierad metod. Dessa komponenter omfattar metodens unika egenskaper, kritiska förfarandemässiga detaljer och åtgärder för kvalitetskontroll. Att följa testmetodens grundläggande komponenter hjälper till att säkerställa att liknande eller modifierade metoder baserar sig på samma koncept som den motsvarande validerade referensmetoden (9). Testmetodens grundläggande komponenter beskrivs i detalj i punkterna 16–21 i testmetoden och testningen bör utföras enligt följande: Allmänna villkor (punkt 16). Funktionella villkor, som omfattar viabilitet (punkt 17), barriärfunktion (punkt 18), morfologi (punkt 19), reproducerbarhet (punkt 20), och kvalitetskontroll (punkt 21).
II. Minimiförteckning över referenskemikalier
7. Referenskemikalier används för att bestämma tillförlitligheten och exaktheten hos en föreslagen liknande eller modifierad metod som har påvisats vara strukturellt och funktionellt tillräckligt motsvarande den validerade referensmetoden eller som representerar en mindre modifiering av en av de tre validerade metoderna, är jämförbar med eller är bättre än den validerade referensmetoden (2) (8) (16) (23). De 20 rekommenderade referenskemikalierna som förtecknas i tabell 1 omfattar kemikalier som representerar olika kemiska klasser (dvs. kemiska kategorier på grundval av funktionella grupper) och är representativa för hela skalan av Draizes irritationspoäng (från icke-irriterande till kraftigt irriterande). Kemikalierna i denna förteckning består av tio kemikalier i kategori 2 enligt FN:s GHS eller CLP-förordningen och tio icke-kategoriserade kemikalier, av vilka tre är frivilliga kemikalier i kategori 3 enligt FN:s GHS. Enligt denna testmetod anses den valfria kategorin 3 som ingen kategori. Kemikalierna som förtecknas i tabell 1 är valda från de kemikalier som använts i optimeringsfasen som följde på förvalidering och i valideringsstudien för den validerade referensmetoden, med avseende på kemisk funktionalitet och fysikaliskt tillstånd (14) (18). Dessa referenskemikalier representerar det minsta antal kemikalier som bör användas för att utvärdera exaktheten och tillförlitligheten för föreslagna liknande eller modifierade metoder, men bör inte användas när nya metoder tas fram. I situationer där en kemikalie enligt förteckningen inte finns att tillgå, kan man använda andra kemikalier för vilka det finns adekvata in vivo-referensdata, primärt från de kemikalier som använts i optimeringsfasen som följt på förvalideringen eller valideringsstudien för den validerade referensmetoden. Om man vill kan ytterligare kemikalier från andra kemiska klasser för vilka det finns adekvata in vivo-referensdata läggas till minimiförteckningen över referenskemikalier för ytterligare utvärdering av den föreslagna testmetodens exakthet. Tabell 1 Minimiförteckning över referenskemikalier för bestämning av exakthet och tillförlitlighet för liknande eller modifierade RhE-metoder för hudirritation Kemikalie CAS-nummer Fysikaliskt tillstånd In vivo-gradering Validerad referensmetod in vitro-kat. FN:s GHS eller EU:s CLP in vivo-kat. 1-brom-4-klorbutan 6940-78-9 Vätska 0 Kat. 2 Ingen kat. dietylftalat 84-66-2 Vätska 0 Ingen kat. Ingen kat. naftalenättiksyra 86-87-3 Fast ämne 0 Ingen kat. Ingen kat. allylfenoxiacetat 7493-74-5 Vätska 0,3 Ingen kat. Ingen kat. isopropanol 67-63-0 Vätska 0,3 Ingen kat. Ingen kat. 4-metyltiobensaldehyd 3446-89-7 Vätska 1 Kat. 2 Ingen kat. metylstearat 112-61-8 Fast ämne 1 Ingen kat. Ingen kat. heptylbutyrat 5870-93-9 Vätska 1,7 Ingen kat. Ingen kat. hexylsalicylat 6259-76-3 Vätska 2 Ingen kat. Ingen kat. kanelaldehyd 104-55-2 Vätska 2 Kat. 2 Ingen kat. (Valfri kat. 3) 1-dekanol 112-30-1 Vätska 2,3 Kat. 2 Kat. 2 cyklamenaldehyd 103-95-7 Vätska 2,3 Kat. 2 Kat. 2 1-bromhexan 111-25-1 Vätska 2,7 Kat. 2 Kat. 2 2-klormetyl-3,5-dimetyl-4-metoxipyridin HCl 86604-75-3 Fast ämne 2,7 Kat. 2 Kat. 2 di-n-propyldisulfid 629-19-6 Vätska 3 Ingen kat. Kat. 2 kaliumhydroxid (5 % vattenlösning) 1310-58-3 Vätska 3 Kat. 2 Kat. 2 bensentiol, 5-(1,1-dimetyletyl)-2-metyl 7340-90-1 Vätska 3,3 Kat. 2 Kat. 2 1-metyl-3-fenyl-1-piperazin 5271-27-2 Fast ämne 3,3 Kat. 2 Kat. 2 heptanal 111-71-7 Vätska 3,4 Kat. 2 Kat. 2 tetrakloretylen 127-18-4 Vätska 4 Kat. 2 Kat. 2
III. Definierade värden för tillförlitlighet och exakthet.
8. För att etablera tillförlitligheten och relevansen för föreslagna liknande eller modifierade metoder som kan överföras mellan laboratorier bör alla 20 referenskemikalierna i tabell 1 testas i minst tre laboratorier. Om den föreslagna metoden endast ska användas i ett enskilt laboratorium krävs inte testning i flera laboratorier för valideringen. Det är ändå av största vikt att sådana valideringsstudier bedöms fristående av internationellt erkända valideringsorgan, i enlighet med internationella riktlinjer (9). Alla 20 referenskemikalierna ska i varje laboratorium testas vid tre oberoende omgångar som genomförs med olika vävnadsuppsättningar och med tillräckliga tidsintervaller mellan varandra. Varje omgång ska minst bestå av tre parallellt testade vävnadsbitar för varje berörd testkemikalie, negativ kontroll och positiv kontroll.
9. Vid beräkningen av värden för tillförlitlighet och exakthet för den föreslagna metoden bör alla de fyra nedan angivna kriterierna beaktas, för att garantera att tillförlitlighet och relevans bestäms på ett förhandsdefinierat och enhetligt sätt: 1. Endast data från testomgångar som ingår i fullständiga sekvenser får användas för beräkning av metodens variabilitet inom och mellan laboratorier och förutsägande kapacitet (exakthet). 2. Den slutliga klassificeringen för varje referenskemikalie i varje deltagande laboratorium ska göras genom att använda viabilitetsmedelvärdet för de olika omgångarna som ingår i en fullständig sekvens. 3. Endast data som erhållits för kemikalier för vilka det har gjorts fullständiga sekvenser av testomgångar i alla deltagande laboratorier får användas för beräkning av metodens variabilitet mellan laboratorier. 4. Värdena för exakthet ska beräknas på grundval av de enskilda laboratoriernas förutsägelser som erhållits för de 20 referenskemikalierna vid de olika deltagande laboratorierna. I detta sammanhang avses med sekvens av omgångar tre oberoende testomgångar vid ett laboratorium för en testkemikalie. En fullständig sekvens av omgångar är en sekvens för en testkemikalie vid ett laboratorium där alla tre testomgångarna är giltiga. Det betyder att en enskild ogiltig omgång gör hela sekvensen på tre omgångar ogiltig.
Reproducerbarhet inom laboratorier
10. En utvärdering av reproducerbarheten inom ett laboratorium bör ge en konkordans för klassificeringar (kategori 2 och ingen kategori enligt FN:s GHS eller CLP-förordningen) som erhålls i olika och oberoende testomgångar med de 20 referenskemikalierna vid ett enda laboratorium. Konkordansen ska vara lika med eller högre (≥) än 90 %.
Reproducerbarhet mellan laboratorier
11. En utvärdering av reproducerbarheten mellan laboratorier är inte nödvändig om den föreslagna metoden endast ska användas vid ett enskilt laboratorium. För metoder som ska överföras mellan laboratorier ska den konkordans för klassificeringarna (kategori 2 och ingen kategori enligt FN:s GHS eller CLP-förordningen) som erhålls i olika och oberoende testomgångar med de 20 referenskemikalierna mellan helst minst tre laboratorier vara lika med eller högre (≥) än 80 %.
Förutsägande kapacitet (exakthet)
12. Exaktheten (känslighet, specificitet och total exakthet) för den föreslagna liknande eller modifierade metoden bör vara jämförbar med eller bättre än exaktheten för den validerade referensmetoden, med beaktande av tilläggsinformation rörande relevans hos arten i fråga (tabell 2). Känsligheten ska vara lika med eller högre (≥) än 80 % (2) (8) (23). Det finns också en ytterligare särskild begränsning som gäller för känsligheten hos den föreslagna in vitro-metoden såtillvida att endast två in vivo-kemikalier i kategori 2, 1-dekanol och di-n-propyldisulfid, får klassificeras felaktigt som ingen kategori av fler än ett deltagande laboratorium. Specificiteten ska vara lika med eller högre (≥) än 70 % (2) (8) (23). Det finns inga ytterligare begränsningar rörande specificiteten för den föreslagna in vitro-metoden, dvs. de deltagande laboratorierna får felklassificera in vivo-kemikalier som ingen kategori så länge som testmetodens slutliga specificitet ligger inom det godtagbara området. Den totala exaktheten ska vara lika med eller högre (≥) än 75 % (2) (8) (23). Även om den validerade referensmetodens känslighet beräknad för de 20 referenskemikalierna som förtecknas i tabell 1 är lika med 90 %, är det definierade minimivärdet för känsligheten som krävs för alla liknande eller modifierade metoder som övervägs satt till 80 %, eftersom både 1-dekanol (en gränskemikalie) och di-n-propyldisulfid (falsk negativ i den validerade referensmetoden) är kända för att vara icke-irriterande för människa (31) (32) (33), även om de identifieras som irriterande ämnen i kanintest. Eftersom RhE-modellerna är baserade på celler av mänskligt ursprung kan de förutsäga att dessa kemikalier inte är irriterande (ingen kategori enligt FN:s GHS eller CLP-förordningen). Tabell 2 Förutsägande värden för känslighet, specificitet och total exakthet som krävs för att en liknande eller modifierad metod ska anses vara giltig Känslighet Specificitet Total exakthet ≥ 80 % ≥ 70 % ≥ 75 %
Kriterier för godkännande av ett försök
13. Det är möjligt att ett eller flera test som hör samman med en eller flera testkemikalier inte uppfyller kriterierna för godkänt för test- och kontrollkemikalierna eller inte kan godkännas av andra orsaker. För att komplettera data som saknas är det tillåtet att för varje testkemikalie göra högst två tilläggstest (omtestning). Det betyder alltså att då även positiv kontroll och negativ kontroll måste testas parallellt vid omtestning får man genomföra högst två extra omgångar för varje testkemikalie.
14. Det är möjligt, även efter omtestning, att det minimiantal på tre giltiga omgångar som krävs för varje testad kemikalie inte erhålls för varje referenskemikalie i varje deltagande laboratorium, och då är den resulterande datamatrisen ofullständig. I sådana fall bör alla följande tre kriterier uppfyllas för att datauppsättningarna ska anses vara godtagbara: 1. Det bör finnas minst en fullständig sekvens av omgångar för alla 20 referenskemikalierna. 2. I minst tre deltagande laboratorier måste minst 85 % av sekvenserna vara fullständiga (för 20 kemikalier, dvs. 3 ogiltiga sekvenser tillåts i ett enskilt laboratorium). 3. Minst 90 % av alla möjliga sekvenser från minst tre laboratorier måste vara fullständiga (för 20 kemikalier som testats i tre laboratorier, dvs. totalt tillåts 6 ogiltiga sekvenser).
1 EGT L 225, 21.8.2001, s. 1.
3 Urvalet kemikalier baserar sig på följande kriterier: i) kemikalierna finns kommersiellt tillgängliga, ii) de är representativa för hela skalan av Draizes irritationspoäng (från icke-irriterande till kraftigt irriterande), iii) de har en väl definierad kemisk struktur, iv) de är representativa för den kemiska funktionalitet som används i valideringsprocessen och v) de är inte förknippade med någon extremt toxisk profil (t.ex. karcinogena eller toxiska för reproduktionssystemet) och de är inte förknippade med orimliga bortskaffningskostnader.
4 Kemikalier som är irriterande på kanin men för vilka det finns tillförlitliga belägg om att de inte är irriterande för människor (31) (32) (33).
5 Enligt FN:s GHS, inte enligt CLP-förordningen.
Tillägg 1
Definitioner
Tillägg 2
Formler för bestämning av cytotoxicitet
1. När cytoB används ska bedömningen av cytotoxicitet basera sig på proliferationsindex vid cytokinesinhibering (CBPI) eller replikeringsindex (RI) (16) (58). Proliferationsindex vid cytokinesinhibering indikerar det genomsnittliga antalet cellcykler per cell under exponeringsperioden för cytoB och kan användas för att beräkna cellproliferationen. Replikeringsindex indikerar det relativa antalet kärnor i behandlade odlingar i jämförelse med kontrollodlingar och kan användas för att beräkna procentandelen cytostas: % cytostas = 100 – 100{(CBPIT – 1) ÷ (CBPIC – 1)} och T odling behandlad med testkemikalie C vehikelkontrollodling där CBPI = Antalet mononukleära celler + 2 × Antalet binukleära celler + 3 × Antalet multinukleära celler Totala antalet celler Således gäller att ett CBPI-värde på 1 (alla celler är mononukleära) motsvarar 100 % cytostas. Cytostas = 100 – RI RI = Antalet binukleära celler + 2 × Antalet multinukleära celler ÷ Totala antalet celler T Antalet binukleära celler + 2 × Antalet multinukleära celler ÷ Totala antalet celler C × 100 T behandlade odlingar C kontrollodlingar
2. Således betyder ett RI-värde på 53 % att, jämfört med antalet celler som har delat sig till binukleära och multinukleära celler i kontrollodlingen, endast 53 % av detta antal har delat sig i den behandlade odlingen, dvs. 47 % cytostas.
3. När cytoB inte används, rekommenderas att cytotoxiciteten utvärderas på grundval av relativ ökning av celltal (RICC) eller relativ populationsfördubbling (RPD) (58), eftersom den andel av cellpopulationen som har delat sig beaktas i båda metoderna. RICC = Ökning av cellantal i behandlade odlingar slutlig – vid start Ökning av cellantal i kontrollodlingar slutlig – vid start × 100 RPD = Antal populationsfördubblingar i behandlade odlingar Antal populationsfördubblingar i kontrollodlingar × 100 där Populationsfördubbling = [log (Cellantal efter behandling ÷ Ursprungligt cellantal)] ÷ log 2
4. Således indikerar ett RICC-värde eller ett RPD-värde på 53 % att det förekommer 47 % cytotoxicitet/cytostas.
5. Genom att använda ett proliferationsindex (PI) kan cytotoxiciteten bestämmas genom att räkna antalet kloner som består av 1 cell (cl1), 2 celler (cl2), 3 till 4 celler (cl4) och 5 till 8 celler (cl8) PI = 1 × cl1 + 2 × cl2 + 3 × cl4 + 4 × cl8 cl1 + cl2 + cl4 + cl8
6. PI har använts som en värdefull och tillförlitlig cytotoxicitetsparameter även för cellinjer som har odlats in situ utan tillsats av cytoB (25) (26) (27) (28).
Tillägg 3
Kategori | Kemikalie | CAS-nummer | EG-nummer
Cytosinarabinosid | 147-94-4 | 205-705-9
Mitomycin C | 50-07-7 | 200-008-6
Benso(a)pyren | 50-32-8 | 200-028-5
Cyklofosfamid | 50-18-0 | 200-015-4
Kolchicin | 64-86-8 | 200-598-5
Vinblastin | 143-67-9 | 205-606-0
Di(2-etylhexyl)ftalat | 117-81-7 | 204-211-0
Nalidixinsyra | 389-08-2 | 206-864-7
Pyren | 129-00-0 | 204-927-3
Natriumklorid | 7647-14-5 | 231-598-3
2 Referenskemikalierna är de kemikalier som rekommenderas. Ersättning eller tillägg av kemikalier till förteckningen över referenskemikalier kan göras om deras aktivitet är känd och de inducerar mikrokärnor enligt samma mekanismer, och om de kan påvisas vara relevanta för de kemikalier som ska testas med MNvit-förfarandet. Beroende på ändamålet kan motiveringen också innehålla en valideringsstudie där man använt ett brett urval olika ämnen eller fokuserat på ett smalare spektrum baserat på testämnets kemiska klass eller mekanismen för den skada som undersöks.