EU-förordning

Kommissionens förordning (EU) 2019/1390 av den 31 juli 2019 om ändring, för anpassning till den tekniska utvecklingen, av bilagan till förordning (EG) nr 440/2008 om testmetoder enligt Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach) (Text av betydelse för EES)

CELEX: 32019R1390
Typ: EU-förordning
Datum: 20190731
EUT: L 247

EUROPEISKA KOMMISSIONEN HAR ANTAGIT DENNA FÖRORDNING

med beaktande av fördraget om Europeiska unionens funktionssätt,

med beaktande av Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 av den 18 december 2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach), inrättande av en europeisk kemikaliemyndighet, ändring av direktiv 1999/45/EG och upphävande av rådets förordning (EEG) nr 793/93 och kommissionens förordning (EG) nr 1488/94 samt rådets direktiv 76/769/EEG och kommissionens direktiv 91/155/EEG, 93/67/EEG, 93/105/EG och 2000/21/EG, särskilt artikel 13.2, och

1 I kommissionens förordning (EG) nr 440/2008 fastställs testmetoder som ska användas för tillämpning av förordning (EG) nr 1907/2006 när det gäller bestämning av kemikaliers fysikalisk-kemiska egenskaper, toxicitet och ekotoxicitet.

2 Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD) utvecklar harmoniserade och internationellt överenskomna testriktlinjer för testning av kemikalier för tillsynsändamål. OECD utfärdar regelbundet nya och reviderade testriktlinjer som tar hänsyn till den vetenskapliga utvecklingen inom området.

3 För att ta hänsyn till den tekniska utvecklingen och, när så är möjligt, minska antalet djur som används för djurförsök i enlighet med artikel 13.2 i förordning (EG) nr 1907/2006 bör, efter det att relevanta testriktlinjer från OECD har antagits, två nya testmetoder för bedömning av ekotoxicitet och nio nya testmetoder för bestämning av toxicitet för människors hälsa fastställas och sju testmetoder uppdateras. Elva av dessa testmetoder gäller in vitro-tester avseende irritation/korrosion av hud och ögon, hudsensibilisering, genotoxicitet och endokrina verkningar. Berörda parter har rådfrågats angående den föreslagna ändringen.

4 Förordning (EG) nr 440/2008 bör därför ändras i enlighet med detta.

5 De åtgärder som föreskrivs i denna förordning är förenliga med yttrandet från den kommitté som inrättats enligt artikel 133 i förordning (EG) nr 1907/2006.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

Bilagan till förordning (EG) nr 440/2008 ska ändras i enlighet med bilagan till den här förordningen.

Artikel 2

Denna förordning träder i kraft den tjugonde dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning.

Denna förordning är till alla delar bindande och direkt tillämplig i alla medlemsstater.

1 EUT L 396, 30.12.2006, s. 1.

2 Kommissionens förordning (EG) nr 440/2008 av den 30 maj 2008 om testmetoder enligt Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach) (EUT L 142, 31.5.2008, s. 1).

BILAGA

Bilagan till förordning (EG) nr 440/2008 ska ändras på följande sätt:

1 I del B ska kapitel B.4 ersättas med följande:

2 I del B ska kapitel B.17 ersättas med följande:

3 I del B ska kapitel B.22 ersättas med följande:

4 I del B ska kapitel B.23 ersättas med följande:

5 I del B ska kapitel B.40 ersättas med följande:

6 I del B ska kapitel B.40a ersättas med följande:

7 I del B ska kapitel B.46 ersättas med följande:

8 I del B ska följande kapitel läggas till:

9 I del C ska följande kapitel läggas till:

1 Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1272/2008 av den 16 december 2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen och blandningar, ändring och upphävande av direktiven 67/548/EEG och 1999/45/EG samt ändring av förordning (EG) nr 1907/2006 (EUT L 353, 31.12.2008, s. 1).

3 Kvalifikationsämnena, som först indelats i frätande respektive icke frätande, sedan i korrosiv underkategori och slutligen efter kemisk klass, valdes ut bland de ämnen som använts i ECVAM:s valideringsstudie av TER-testmetoden på råtthud (8) (9). Om inget annat anges testades ämnena vid den renhetsnivå som de hade när de köptes in från återförsäljaren (8). I den mån detta var möjligt omfattade urvalet ämnen som i) är representativa för korrosivitetsresponsens omfång (t.ex. icke frätande och svagt till starkt frätande) som kan mätas eller förutses av VRM, ii) är representativa för de kemiska klasser som används i valideringsstudien, iii) återspeglar VRM:s prestandaegenskaper, iv) har väldefinierade kemiska strukturer, v) ger definitiva resultat vid användning av in vivo-referenstestmetoden, vi) finns att köpa i handeln, och vii) inte är belagda med några kostnader för farligt avfall.

4 Kemisk klass enligt Barratt m.fl. (8).

5 FN:s motsvarande förpackningsgrupper är I, II respektive III för GHS/CLP-kategorierna 1A, 1B och 1C.

6 pH-värdena hämtades från Fentem m.fl. (9) och Barratt m.fl. (8).

10 Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1272/2008 av den 16 december 2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen och blandningar, ändring och upphävande av direktiven 67/548/EEG och 1999/45/EG samt ändring av förordning (EG) nr 1907/2006 (EUT L 353, 31.12.2008, s. 1).

11 Förkortningen RhE (= rekonstruerad human epidermis) används för alla modeller som baseras på RhE-teknik. När förkortningen RHE används tillsammans med SkinEthic™-modellen betyder den samma sak, dock skrivs den ut med bara stora bokstäver när den ingår i den specifika testmetodens kommersiella namn.

13 Kvalifikationsämnena, som först har delats in i korrosiva respektive icke-korrosiva, sedan efter korrosiv underkategori och slutligen efter kemisk klass, har valts ut från de ämnen som använts i ECVAM:s valideringsstudier för EpiSkin™ och EpiDerm™ (8) (9) (10) samt från uppföljande valideringsstudier baserade på data som tillhandahållits av utvecklarna av EpiSkin™ (22), EpiDerm™, SkinEthic™ respektive epiCS® (23). Om inget annat anges så har ämnena testas på den renhetsnivå som de hade vid inköp (8) (10). I den mån detta var möjligt omfattade urvalet ämnen som i) är representativa för korrosivitetsresponsens omfång (t.ex. icke frätande och svagt till starkt frätande) som kan mätas eller förutses av VRM, ii) är representativa för de kemiska klasser som används i valideringsstudien, iii) har väl definierade kemiska strukturer,; iv) ger resultat i VRM som är möjliga att reproducera, v) ger definitiva resultat vid användning av in vivo-referenstestmetoden, vi) finns att köpa i handeln, och vii) inte är belagda med några kostnader för farligt avfall.

14 Kemisk klass enligt Barratt m.fl. (8).

15 FN:s motsvarande förpackningsgrupper är I, II eller III, för GHS/CLP-kategorierna 1B, 1C och 1C.

16 De VRM för in vitro-prediktion som redovisas i denna tabell erhölls genom användning av EpiSkin™ respektive EpiDerm™ testmodeller (VRM) genom uppföljande valideringsförsök som genomfördes av testmetodutvecklarna.

17 Viabilitetsvärdena som erhölls i ECVAM:s valideringsstudier för hudkorrosion har inte korrigerats för MTT-reduktion (inga dödade kontroller genomfördes inom ramen för valideringsstudierna). Däremot användes anpassade kontroller vid framtagningen av testmetodutvecklarnas valideringsdata som presenteras i den här tabellen (23).

22 Vid bedömningen av RhE-testmodellernas användbarhet som stöd för underkategorisering framgick det att runt 22 % av underkategori 1A:s resultat för testmodellen EpiSkin™ faktiskt kan utgöras av ämnen eller blandningar som tillhör underkategori 1B eller 1C (dvs. överklassificeringar) (se tillägg 3).

24 Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1272/2008 av den 16 december 2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen och blandningar, ändring och upphävande av direktiven 67/548/EEG och 1999/45/EG samt ändring av förordning (EG) nr 1907/2006 (EUT L 353, 31.12.2008, s. 1).

26 Kvalifikationsämnena är en underuppsättning av de ämnen som används i valideringsstudien, och urvalet baseras på följande kriterier: i) de kemiska ämnena ska finnas tillgängliga i handeln, ii) de ska vara representativa för hela urvalet av Draizes irritationspoäng (från icke-irriterande till starkt irriterande), iii) de ska ha en väldefinierad kemisk struktur; iv) de ska vara representativa för den kemiska funktionalitet som används i valideringsprocessen, v) de ska ha gett reproducerbara resultat in vitro vid flera tester och i flera laboratorier, vi) de ska ha kunnat förutses korrekt in vitro, och vii) de får inte vara extremt toxiska (t.ex. cancerframkallande eller toxiska för fortplantningssystemet) eller belagda med några kostnader för farligt avfall.

27 In vivo-gradering enligt TM B.4 (4).

28 I denna testmetod betraktas den valfria GHS-kategorin 3 (svagt irriterande ämnen) (1) som ingen kategori.

32 För en rad olika mätningar i serum och plasma, särskilt för glukos, är nattlig fasta att föredra. Den största orsaken till detta är att den ökade variationen som oundvikligen resulterar från icke-fastande, tenderar att maskera mer subtila effekter och göra tolkningen svår. Å andra sidan kan dock den nattliga fastan inkräkta på (de dräktiga) djurens allmänna metabolism och störa laktation och digivningsbeteende, och de kan även, särskilt under foderstudier, störa den dagliga exponeringen för testkemikalien. Om nattlig fasta används ska kliniska biokemiska bestämningar utföras efter utförandet av funktionsobservationer under vecka 4 i studien, för hanarnas del. Moderdjuren bör hållas i ytterligare en dag efter att ungarna tagits bort, på t.ex. PND 13). Moderdjuren ska fasta över natten mellan laktationsdag 13 och 14, och terminalt blod användas för kliniska kemiska parametrar.

33 Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1272/2008 av den 16 december 2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen och blandningar, ändring och upphävande av direktiven 67/548/EEG och 1999/45/EG samt ändring av förordning (EG) nr 1907/2006 (EUT L 353, 31.12.2008, s. 1).

34 Syraderivat är en icke-specifik klassificering och definieras generellt som en kemikalie som framställts från en syra, antingen direkt eller genom modifiering eller partiell substitution. Denna klass omfattar anhydrider, halosyror, salter och andra typer av kemikalier.

36 I EU tillämpas tre underkategorier för frätande verkan på huden enligt CLP-förordningen, 1A, 1B och 1C.

39 De tolv ämnen som anges ovan inkluderar tre ämnen från var och en av de tre GHS-underkategorierna för frätande ämnen samt tre icke frätande ämnen. De finns lätt tillgängliga från kommersiella leverantörer. GHS-underkategorin baseras på resultaten från in vivo-provningar av hög kvalitet. Ämnena har tagits från en lista med 40 referensämnen som ingår i minimiförteckningen över kemikalier som ska användas för att visa att testmetoder som strukturellt och funktionellt liknar den validerade referenstestmetoden är noggranna och tillförlitliga, och valdes ut bland de 163 referenskemikalier som ursprungligen användes för att validera referenstestmetoden (Corrositex®) (7) (10) (14). Syftet med denna urvalsprocess var att i största möjliga mån ta med kemikalier som är representativa för korrosivitetsresponsens omfång (t.ex. icke frätande, FN:s förpackningsgrupper I, II och III för frätande ämnen) som kan mätas eller uppskattas med den validerade referenstestmetoden, är representativa för de kemikalieklasser som används under valideringsprocessen, har väldefinierade kemiska strukturer, ger reproducerbara resultat i den validerade referenstestmetoden, ger definitiva resultat vid användning av in vivo-referenstestet, finns kommersiellt tillgängliga, och inte ger upphov till alltför höga kostnader för bortskaffande (14).

40 Ämnen som testats rena eller med renhetsgrad ≥ 90 %

41 FN:s motsvarande förpackningsgrupper är I, II eller III, för GHS-underkategorierna 1A, 1B och 1C. NC: Icke frätande.

45 Testkemikalier med hög syra-/basreserv (6)

46 Testkemikalier med låg syra-/basreserv (6)

47 GHS-underkategorierna 1A, 1B och 1C motsvarar FN:s förpackningsgrupper I, II respektive III.

51 Fram till juni 2016 betecknades denna cellinje BG1Luc. BG-1-cellerna beskrevs först av Geisinger et al. (1998) (35), och karakteriserades senare av forskare vid National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) (36). Relativt nyligen upptäckte man att det finns två olika varianter av BG-1-celler som används av forskare, BG-1 Fr och BG-1 NIEHS. En djupgående analys, inklusive DNA-testning, av dessa två varianter av cellinjen BG-1, som utfördes av Li och medarbetare (2014) (37), visade att BG-1 Fr är unik och att BG-1 NIEHS, dvs. den cellinje som ursprungligen användes för att utveckla metoden, inte är cellinjen BG1 från human äggstockscancer, utan i stället är en variant av cellinjen MCF7 från human bröstcance. Den cellinje som används i testet, som ursprungligen benämndes BG1Luc4E2 (38), kommer nu att betecknas som VM7Luc4E2 (V = variant, M7 = MCF7-celler). Analysen kommer nu att betecknas VM7Luc ER TA. Detta innebär visserligen ett ändrat ursprung för den cellinje som metoden bygger på, men det påverkar inte publicerade valideringsstudier eller nyttan med och tillämpningen av denna analys för screening av östrogena/antiöstrogena kemikalier.

52 Vanliga ämnen som testas i STTA- och VM7Luc ER TA-testerna och som betecknas som ER-agonister eller negativa och används för att utvärdera noggrannheten i valideringsstudien för VM7Luc ER TA (ICCVAM VM7Luc ER TA Evaluation Report, tabell 4-1 (3)).

53 Högsta koncentration som testats i avsaknad av begränsningar på grund av cytotoxicitet eller olöslighet var 1 × 10–5 M (STTA-test) och 1 × 10–3 M (VM7Luc ER TA-test).

54 Siffran inom parentes motsvarar antalet testresultat som klassificerats som positiva (POS) eller negativa (NEG) i det totala antalet referensstudier.

55 Värden rapporterade i Draft Report of Pre-validation and Inter-laboratory Validation For Stably Transfected Transcriptional Activation (TA) Assay to Detect Estrogenic Activity – The Human Estrogen Receptor Alpha Mediated Reporter Gene Assay Using hER-HeLa-9903 Cell Line (2)

56 ICCVAM Test Method Evaluation Report on the LUMI-CELL® ER (VM7Luc ER TA) Test Method: An In Vitro Method for Identifying ER Agonists and Antagonists (3)

57 EC50-medelvärdena beräknades med hjälp av värden som rapporterats från de laboratorier som deltog i VM7Luc ER TA-valideringsstudien (XDS, ECVAM och Hiyoshi) (3).

58 Klassificeringen som ER-agonister eller som negativa grundades på information i ICCVAM:s bakgrundsdokument om analyser av östrogenreceptorbindning och transaktivering (31) samt på information från publikationer som offentliggjorts och granskats efter slutförandet av ICCVAM:s bakgrundsdokument (2) (3) (18) (31) (33) (34). Anmärkningar: Alla tester inom denna testmetod omfattar inte samma mätningar. I vissa situationer kan inte EC50 beräknas eftersom det inte skapas en fullständig dosresponskurva. I STTA-testet är PC10-värdet ett nyckelmått, men det kan även finnas andra exempel där en PCx ger användbar information.

93 Vanliga ämnen som testas i STTA- och VM7Luc ER TA-testerna och har benämnts som ER-antagonister eller negativa. De används för att utvärdera noggrannheten i valideringsstudien för VM7Luc ER TA (2) (3).

94 Högsta koncentration som testats i avsaknad av begränsningar på grund av cytotoxicitet eller olöslighet var 1 × 10–3 M (STTA-test) och 1 × 10–5 M (VM7Luc ER TA-test).

95 Validation Report of the Stably transfected Transcriptional Activation Assay to Detect ER mediated activity, Part B (2)

96 ICCVAM Test Method Evaluation Report on the LUMI-CELL® ER (VM7Luc ER TA) Test Method: An In Vitro Method for Identifying ER Agonists and Antagonists (3).

97 IC50-medelvärdena beräknades med hjälp av värden som rapporterats från de laboratorier som deltog i VM7Luc ER TA-valideringsstudien (XDS, ECVAM och Hiyoshi) (3).

98 Förmodad ER STTA-aktivitet utifrån rapporterade effekter, kända från CERI:s historiska data från testet av östrogenreceptorers bindning, det uterotrofa testet och information från den öppna litteraturen (2)

99 Klassificeringen av ER-antagonister som positiva eller negativa grundades på information i ICCVAM:s bakgrundsdokument om tester av östrogenreceptorbindning och transaktivering (31) samt på information från publikationer som publicerats och granskats efter slutförandet av ICCVAM:s bakgrundsdokument (2) (3) (18) (31).

100 Ämnena placerades i en eller flera kemiska klasser med användning av U.S. National Library of Medicine’s Medical Subject Headings (MeSH), ett internationellt erkänt standardiserat klassificeringssystem (se http://www.nlm.nih.gov/mesh).

101 Ämnena placerades i en eller flera produktklasser med användning av databanken U.S. National Library of Medicine’s Hazardous Substances Data Bank (se http://toxnet.nlm.nih.gov/cgi-bin/sis/htmlgen?HSDB).

113 Klassificeringen av ER-antagonisters aktivitet som positiv eller negativ grundades på ICCVAM:s bakgrundsdokument om test av östrogenreceptorbindning och transaktivering (31) samt på empiriska data och annan information från referensstudier som publicerats och granskats efter slutförandet av ICCVAM:s bakgrundsdokument. (2) (3) (18) (31) (32) (33) (34).

114 Värden rapporterade i Draft Report of Pre-validation and Inter-laboratory Validation For Stably Transfected Transcriptional Activation (TA) Assay to Detect Estrogenic Activity – The Human Estrogen Receptor Alpha Mediated Reporter Gene Assay Using hER-HeLa-9903 Cell Line (30)

115 EC50-medelvärdena beräknades med hjälp av värden som rapporterats från de laboratorier som deltog i VM7Luc ER TA-valideringsstudien (XDS, ECVAM och Hiyoshi) (3).

116 De rapporterade koncentrationerna var de högsta koncentrationer som testades (förberedande test) under valideringen av VM7Luc ER TA-testet. Om koncentrationen varierar mellan laboratorierna rapporteras den högsta koncentrationen. Se tabell 4-10 i ICCVAM Test Method Evaluation Report; The LUMI-Cell®ER (VM7Luc ER TA) Test Method: An In Vitro Assay for Identifying Human Estrogen Receptor Agonist and Antagonist Activity of Chemicals (3).

117 Ämnena placerades i en eller flera kemiska klasser med användning av U.S. National Library of Medicine’s Medical Subject Headings (MeSH), ett internationellt erkänt standardiserat klassificeringssystem (se http://www.nlm.nih.gov/mesh).

118 Ämnena placerades i en eller flera produktklasser med användning av databanken U.S. National Library of Medicine’s Hazardous Substances Data Bank (se http://toxnet.nlm.nih.gov/cgi-bin/sis/htmlgen?HSDB)

119 Från tabell 1 (förteckning över referenskemikalier (22) för utvärdering av noggrannhet hos östrogenreceptoragonister) i prestandastandarderna (6).

120 Om ett kvalifikationsämne inte längre finns kommersiellt tillgängligt kan ett ämne som har samma klassificering och är jämförbart när det gäller potens, verkningssätt och kemisk klass användas.

129 Klassificerat som negativt enligt litteraturgranskning (2).

130 Vanliga ämnen som testas i STTA- och VM7Luc ER TA-testerna och har benämnts som ER-antagonister eller negativa. De används för att utvärdera noggrannheten i valideringsstudien för VM7Luc ER TA (2) (3).

131 Validation Report of the Stably transfected Transcriptional Activation Assay to Detect ER mediated activity, Part B (2)

132 ICCVAM Test Method Evaluation Report on the LUMI-CELL® ER (VM7Luc ER TA) Test Method: An In Vitro Method for Identifying ER Agonists and Antagonists (3).

133 IC50-medelvärdena beräknades med hjälp av värden som rapporterats från de laboratorier som deltog i VM7Luc ER TA-valideringsstudien (XDS, ECVAM och Hiyoshi) (3).

134 De rapporterade koncentrationerna var de högsta koncentrationer som testades (förberedande test) under valideringen av VM7Luc ER TA-testet. Om koncentrationen varierar mellan laboratorierna rapporteras den högsta koncentrationen. Se tabell 4-11 i ICCVAM Test Method Evaluation Report; The LUMI-Cell®ER (VM7Luc ER TA) Test Method: An In Vitro Assay for Identifying Human Estrogen Receptor Agonist and Antagonist Activity of Chemicals (3).

135 Klassificeringen av ER-antagonister som positiva eller negativa grundades på information i ICCVAM:s bakgrundsdokument om analyser av östrogenreceptorbindning och transaktivering (31) samt på information från publikationer som publicerats och granskats efter slutförandet av ICCVAM:s bakgrundsdokument (2) (3) (18) (31).

136 Ämnena placerades i en eller flera kemiska klasser med användning av U.S. National Library of Medicine’s Medical Subject Headings (MeSH), ett internationellt erkänt standardiserat klassificeringssystem (se http://www.nlm.nih.gov/mesh).

137 Ämnena placerades i en eller flera produktklasser med användning av databanken U.S. National Library of Medicine’s Hazardous Substances Data Bank (se http://toxnet.nlm.nih.gov/cgi-bin/sis/htmlgen?HSDB).

151 Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1272/2008 av den 16 december 2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen och blandningar, ändring och upphävande av direktiven 67/548/EEG och 1999/45/EG samt ändring av förordning (EG) nr 1907/2006 (EUT L 353, 31.12.2008, s. 1).

152 I juni 2013 enades det gemensamma mötet om att begreppet testkemikalier när så är möjligt bör användas mer konsekvent för att beskriva vad som testas, vilket nu bör tillämpas på nya och uppdaterade testmetoder.

153 De kemiska klasserna tilldelades med användning av information som inhämtats från tidigare NICEATM-publikationer och om sådana inte finns tillgängliga, med användning av National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH®) (via ChemIDplus® [National Library of Medicine], se http://chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/) samt strukturbestämningar som fastställts av NICEATM.

154 På grundval av in vivo-test på kaninögon (OECD TG 405) och med användning av GHS/CLP (1).

155 Klassificering som kategori 1 baseras på hudfrätande potential hos 100 % natriumhydroxid (förtecknad som en kvalifikationskemikalie med hudfrätande potential i OECD TG 435) och kriteriet för GHS/CLP-kategori 1 (1).

156 Klassificering i kategori 2A eller 2B beror på tolkningen av GHS-kriteriet för att skilja mellan dessa två kategorier, dvs. 2 av 6 jämfört med 4 av 6 djur med effekter på dag 7, vilket krävs för en klassificering i kategori 2A. In vivo-datamängden omfattade två studier med tre djur var. I den ena studien visade 2 av 3 djur effekter på dag 7, vilket föranledde en kategori 2-klassificering (11). I den andra studien återhämtade sig alla endpoints hos samtliga 3 djur till en poäng på noll till dag 7, vilket föranledde en kategori 2B-klassificering (12).

157 Klassificering i kategori 2A eller 2B beror på tolkningen av GHS-kriteriet för att skilja mellan dessa två kategorier, dvs. 1 av 3 jämfört med 2 av 3 djur med effekter på dag 7, vilket krävs för en klassificering i kategori 2A. In vivo-undersökningen omfattade tre djur. Alla endpoints utom korneaopacitet och konjunktival rodnad hos ett djur återhämtades till noll dag 7 eller tidigare. Det djur som inte hade återhämtat sig fullständigt dag 7 hade en korneaopacitet på 1 och en konjunktival rodnad på 1 (dag 7) som var fullständigt återställd dag 14 (11).

163 Blandningar som består av ämnen med ett ångtryck högre än 6 kPa bör dessutom utvärderas noggrant för att undvika eventuella underskattningar, och bör motiveras från fall till fall.

164 Baserat på resultat som huvudsakligen uppnåtts med monokomponentämnen, men det finns också vissa data om testning av blandningar. Testmetoden är emellertid tekniskt tillämplig på testning av multikomponentämnen och blandningar. Innan testmetoden används på en blandning i syfte att samla in data för ett lagstadgat ändamål bör man överväga om, och i så fall varför, den kommer att ge godtagbara resultat för det syftet. Sådana överväganden är inte nödvändiga om blandningen måste provas enligt lag.

167 Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1272/2008 av den 16 december 2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen och blandningar, ändring och upphävande av direktiven 67/548/EEG och 1999/45/EG samt ändring av förordning (EG) nr 1907/2006 (EUT L 353, 31.12.2008, s. 1).

168 I juni 2013 enades det gemensamma mötet mellan OECD:s kemikaliekommitté och dess arbetsgrupp om kemikalier, bekämpningsmedel och bioteknik om att när det är möjligt bör nu en mer konsekvent användning av termen testkemikalie i betydelsen vad som testas tillämpas i nya och uppdaterade OECD-testriktlinjer.

169 EITL: EIT för flytande ämnen med SkinEthic™ HCE.

170 EITS: EIT för fasta ämnen med SkinEthic™ HCE.

171 Organisk funktionell grupp identifierad med hjälp av en samling definierade regler benämnd Organiska Funktionella Grupper (nästlad) i OECD:s verktygslåda för QSAR, version 3.1 (8).

172 Baserat på resultat från EpiOcular™ EIT i valideringsstudien av ögonirritation (EIVS) utförd av EURL ECVAM/Cosmetics Europe (8).

173 Baserat på resultat från SkinEthic™ HCE EIT i valideringsstudien (10) (11).

174 Baserat på in vivo-kaninögontest (TM B.5/OECD TG 405) (2) (14) och med användning av GHS.

175 Baserat på resultat från CEFIC CONsortium for in vitro Eye Irritation testing strategy (CON4EI) Study.

176 Klassificering i kategori 2A eller 2B beror på tolkningen av GHS-kriteriet för att skilja mellan dessa båda kategorier, dvs. 1 av 3 jämfört med 2 av 3 djur med effekter på dag 7, vilket krävs för en klassificering som kategori 2A. In vivo-studien omfattade 3 djur. Alla endpoints, förutom hornhinnegrumlingen hos ett djur, återhämtades till noll dag 7 eller tidigare. Det djur som inte hade återhämtat sig fullständigt dag 7 hade en hornhinnegrumling på 1 (dag 7) som var fullständigt återställd dag 9.

186 Denna gräns för godkännande väger in möjligheten av förlängd transport/förvaring (t.ex. > 4 dagar), vilket har visats inte påverka testmetodens prestanda (37).

188 Löslighetsgräns < 1 × 10–4 M.

189 Användningen och klassificeringen av di-n-butylftalat (DBP) som en icke-bindare baserades på tester upp till 10–4 M eftersom ämnet hade noterats som olösligt vid 10–3 M (t.ex. turbiditet) i en del laboratorier under pre-valideringsstudier.

190 Under valideringsstudien testades di-n-butylftalat (DBP) som ett kodat testämne i koncentrationer upp till 10–3 M. Under dessa förhållanden observerades vid några laboratorier antingen en minskning i radioligandbindning vid den högsta koncentrationen (10–3 M) och/eller en tvetydig kurvanpassning. För dessa testomgångar klassificerades DBP som tvetydig eller bindare i 3/5 av de laboratorier som använde CERI-testet och 5/6 av de laboratorier som använde FW-testet (se referens 2), avsnitt IV.B. 3 a, b och VI.A).

191 Klassificeringen överensstämde inte med förväntad klassificering. Klassificeringen av 4-n-heptylfenol som tvetydig eller icke-bindare av 3/5 av laboratorierna gav en genomsnittlig klassificering som tvetydig. En närmare undersökning visade att detta berodde på begränsningar i kemisk löslighet vilka förhindrade upprättande av en fullständig bindningskurva.

192 Under valideringsstudien omklassificerades bens(a)antracen som icke-bindare (dvs. negativ) baserat på publicerad litteratur som visade att den östrogena aktivitet in vitro som rapporterats för detta ämne (16) främst uppkommer genom metabol aktivering (17)(18). Enzymatisk metabol aktivering av ämnet förväntas inte i de cellfria hrER-bindningstester som användes i denna valideringsstudie mellan laboratorier. Därför är den korrekta klassificeringen av detta ämne icke-bindare när det används under de experimentella förhållanden som gäller för FW- och CERI-tester.

205 Om ett kvalifikationsämne inte längre finns kommersiellt tillgängligt kan man använda ett ämne med samma ER-bindningsklassificering, jämförbar styrka och ur samma kemiska klass.

206 Förkortningar: CAS-nummer: nummer i registret som förs av Chemical abstracts service.

207 Klassificering som ERαα-bindare eller icke-bindare i valideringsstudien för CERI- och FW-hrER-bindningstester (2).

208 ER-bindningsaktivitet baserades på amerikanska ICCVAM:s Background review documents (BRD) för ER-bindnings- och TA-tester (9) liksom på empiriska data och annan information från publicerade och refererade granskade studier (10) (11) (12) (13) (14) (15).

209 Ämnena placerades i en eller flera kemiska klasser med användning av U.S. National Library of Medicine’s Medical Subject Headings (MeSH), som är ett internationellt erkänt standardiserat klassificeringssystem (se http://www.nlm.nih.gov/mesh).

210 Ämnena placerades i en eller flera produktklasser med användning av databanken U.S. National Library of Medicine’s Hazardous Substances Data Bank (se http://toxnet.nlm.nih.gov/cgi-bin/sis/htmlgen?HSDB)

211 DBP kan användas som alternativ icke-bindande kontroll och då testas med maxkoncentration om 10–4 M.

212 Gränsen för detta ämnes löslighet är 10–4 M. Användningen och klassificeringen av di-n-butylftalat (DBP) som en icke-bindare baserar sig på tester upp till 10–4 M eftersom ämnet hade noterats som olösligt vid 10–3 M (t.ex. turbiditet) i en del laboratorier under pre-valideringsstudier.

221 Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1272/2008 av den 16 december 2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen och blandningar, ändring och upphävande av direktiven 67/548/EEG och 1999/45/EG samt ändring av förordning (EG) nr 1907/2006 (EUT L 353, 31.12.2008, s. 1).

222 I juni 2013 enades det gemensamma mötet mellan OECD:s kemikaliekommitté och dess arbetsgrupp om kemikalier, bekämpningsmedel och bioteknik om att en mer enhetlig användning av termen testkemikalie, som en beskrivning av vad som testas, bör användas i nya och uppdaterade OECD-testriktlinjer, när så är möjligt.

223 Denna mening förslogs och godkändes vid WNT-mötet i april 2014.

225 Dessa endpoints ska analyseras statistiskt.

226 Alla endpoints analyseras statistiskt.

Tillägg

DEFINITIONER

Kemikalie: ett ämne eller en blandning.

Hudirritation: en reversibel hudskada som finns kvar i upp till fyra timmar efter applicering av en testkemikalie.

Hudkorrosion: en irreversibel skada på huden i form av synlig nekros genom epidermis och in i dermis, efter applicering av en testkemikalie i upp till fyra timmar. Typiska korrosiva reaktioner är sår, blödningar och blodiga sårskorpor samt, i slutet av observationsperioden på 14 dagar, missfärgning av huden på grund av blekning, partier med totalt håravfall och ärr. Histopatologi bör övervägas för att bedöma tveksamma skador.

Testkemikalie: varje ämne eller blandning som testas med denna testmetod.

Tillägg 1

DEFINITIONER

Tillägg 2

FORMLER FÖR BEDÖMNING AV CYTOTOXICITET OCH MUTANTFREKVENS

Cytotoxicitet bedöms genom den relativa överlevnaden, dvs. kloningseffektiviteten hos celler som överförts till plattor omedelbart efter behandling justerat för eventuell cellförlust under behandlingen, jämfört med den justerade kloningseffektiviteten i negativa kontroller (där överlevanden sätts till 100 %) (se RS-formeln nedan).

Anpassad CE för en odling som behandlats med testkemikalie beräknas på följande sätt:

Adjusted CE Number of cells at the end of treatment Number of cells at the beginning of treatment

RS för en odling som behandlats med testkemikalie beräknas på följande sätt:

RS Adjusted CE in treated culture Adjusted CE in the solvent control 100

Mutantfrekvensen är kloningseffektiviteten hos mutantkolonier i ett selektivt medium delat med kloningseffektiviteten i ett icke-selektivt medium för samma odling vid tidpunkten för urvalet.

Mutant frequency Cloning efficiency of mutant colonies in selective medium Cloning efficiency in non-selective medium

När plattor används för kloningseffektivitet:

CE = antal kolonier/antal celler som överförts till plattor.

När mikrotiterplattor används för kloningseffektivitet:

Antalet kolonier per brunn i mikrotiterplattor följer en Poisson-fördelning.

Kloningseffektivitet = -LnP(0)/antal celler som överförts per brunn.

LnP(0) är det troliga antalet tomma brunnar av de inokulerade brunnarna och beskrivs av följande formel:

LnP(0) = -Ln (antal tomma brunnar/antal fyllda brunnar)

Tillägg 1

DEFINITIONER

Tillägg 2

TIDSFÖRLOPP FÖR SPERMATOGENESEN HOS DÄGGDJUR

Fig. 1: En jämförelse av tiden (antal dagar) det tar för hanliga könsceller att utvecklas i möss, råttor och människor. Ingen DNA-reparation sker under de skuggade perioderna.

Ett schema över spermatogenesen hos möss, råttor och människor visas ovan (hämtat från Adler, 1996). Odifferentierade spermatogonier omfattar A-enkel, A-dubbel och A-justerade spermatogonier (Hess och de Franca, 2008). A-enkel anses vara den sanna stamcellen, och för att bedöma effekterna på stamceller måste det därför gå minst 49 dagar (för möss) mellan den sista injektionen av testkemikalien och parningen.

Litteraturhänvisningar

Adler, I.D (1996). Comparison of the Duration of Spermatogenesis Between Rodents and Humans. Mutat Res, 352:169–172.

Hess, RA, De Franca LR (2008). Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. I: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, C. Yan Cheng (Ed), Landes Biosciences and Springer Science&Business Media:1-15.

Tillägg

DEFINITIONER

Tillägg

DEFINITIONER

Tillägg 1

DEFINITIONER

Tillägg 2

HUVUDKOMPONENTERNA I DE RHE-TESTMODELLER SOM VALIDERATS FÖR TESTNING AV HUDKORROSION

Testmodellernas komponenter | EpiSkinTM | EpiDermTM SCT | SkinEthicTM RHE | epiCS®

Modellyta | 0,38 cm2 | 0,63 cm2 | 0,5 cm2 | 0,6 cm2

Antal vävnadsreplikat | Minst 2 per exponering | 2–3 per exponering | Minst 2 per exponering | Minst 2 per exponering

Behandlingsdoser och applicering | Vätskor och trögflytande ämnen: 50 μl ± 3 μl (131,6 μl/cm2) Fasta ämnen: 20 ± 2 mg (52,6 mg/cm2) + 100 μl ± 5μl NaCl solution (9 g/l) Vaxaktiga/klibbiga ämnen: 50 ± 2 mg (131,6 mg/cm2) med nylonnät | Vätskor: 50 μl (79,4 μl/cm2) med eller utan nylonnät Förtest för att se om testkemikalien är kompatibel med nylonnätet Halvfasta ämnen: 50 μl (79,4 μl/cm2) Fasta ämnen: 25 μl H2O (eller mer om det krävs) + 25 mg (39,7 mg/cm2) Vaxer: Platt skivformad bit på ca 8 mm i diameter som placeras ovanpå vävnaden och väts med 15 μl H2O. | Vätskor och trögflytande ämnen: 40 μl ± 3μl (80 μl/cm2) med nylonnät Förtest för att se om testkemikalien är kompatibel med nylonnätet Fasta ämnen: 20 μl ± 2μl H2O + 20 ± 3 mg (40 mg/cm2) Vaxaktiga/klibbiga ämnen: 20 ± 3 mg (40 mg/cm2) med nylonnät | Vätskor: 50 μl ± cm2 (83,3 μl/cm2) med nylonnät Förtest för att se om testkemikalien är kompatibel med nylonnätet Halvfasta ämnen: 50 μl (83,3 μl/cm2) Fasta ämnen: 25 mg (41,7 mg/cm2) + 25 μl H2O (eller mer om det krävs) Vaxaktiga ämnen: Platt kaka bit på ca 8 mm i diameter som placeras ovanpå vävnaden och väts med 15 μl H2O.

Förberedande test av direkt MTT-reduktion | 50 μl (vätskor) eller 20 mg (fasta ämnen)+ 2 ml MTT 0,3 mg/ml lösning för 180 ± 5 min vid 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH → om lösningen färgas blå/lila ska anpassade water killed-kontroller genomföras | 50 μl (vätskor) eller 25 mg (fasta ämnen) + 1 ml MTT 1 mg/ml lösning för 60 min vid 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH → om lösningen färgas blå/lila ska anpassade freeze killed-kontroller genomföras | 40 μl (vätskor) eller 20 mg (fasta ämnen)+ 1 ml MTT 1 mg/ml solution för 180 ± 15 min vid 37 °C, 5 % CO2, 95 % RH → om lösningen färgas blå/lila ska anpassade freeze killed-kontroller genomföras | 50 μl (vätskor) eller 25 mg (fasta ämnen)+ 1 ml MTT 1 mg/ml lösning för 60 min vid 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH → om lösningen färgas blå/lila ska anpassade freeze killed-kontroller genomföras

Förberedande test av eventuell färginterferens | 10 μl (vätskor) eller 10 mg (fasta ämnen) + 90 μl H2 O som blandas i 15 min vid rumstemperatur → om lösningen färgas ska anpassade kontroller genomföras | 50 μl (vätskor) eller 25 mg (fasta ämnen) + 300 μl H2 O i 60 min vid 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH → om lösningen färgas ska anpassade living-kontroller genomföras | 40 μl (vätskor) eller 20 mg (fasta ämnen) + 300 μl H2 O som blandas i 60 min vid rumstemperatur → om testkemikalien färgas ska anpassade living-kontroller genomföras | 50 μl (vätskor) eller 25 mg (fasta ämnen) + 300 μl H2 O i 60 min vid 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH → om lösningen färgas ska anpassade living-kontroller genomföras

Exponering tid och temperatur | 3 min, 60 min (± 5 min) och 240 min (± 10 min) I ventilerad kammare rumstemperatur (RT, 18-28 oC) | 3 min i rumstemperatur, och 60 min vid 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH | 3 min i rumstemperatur, och 60 min vid 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH | 3 min i rumstemperatur, och 60 min vid 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH

Sköljning | 25 ml 1 × PBS (2 ml/gång) | 20 gånger med en mjuk och konstant stråle av 1 × PBS | 20 gånger med en mjuk och konstant stråle av 1 × PBS | 20 gånger med en mjuk och konstant stråle av 1 × PBS

Negativ kontroll | 50 μl saltlösning (9 g/l) Testad för varje exponeringstid | 50 μl H2O Testad för varje exponeringstid | 40 μl H2O Testad för varje exponeringstid | 50 μl H2O Testad för varje exponeringstid

Positiv kontroll | 50 μl isättika Testad i endast 4 timmar | 50 μl 8N KOH Testad för varje exponeringstid | 40 μl 8N KOH Testad i endast 1 timme | 50 μl 8N KOH Testad för varje exponeringstid

MTT-lösning | 2 ml 0,3 mg/ml | 300 μl 1 mg/ml | 300 μl 1 mg/ml | 300 μl 1 mg/ml

MTT-inkubation, tid och temperatur | 180 min (± 15 min) vid 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH | 180 min vid 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH | 180 min (± 15 min) vid 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH | 180 min vid 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH

Extraktionslösning | 500 μl surgjord isopropanol (0,04 N HCl i isopropanol) (isolerad helt nedsänkt vävnad) | 2 ml isopropanol (extraktion från iläggets topp och botten) | 1,5 ml isopropanol (extraktion från iläggets topp och botten) | 2 ml isopropanol (extraktion från iläggets topp och botten)

Extraktionstid och extraktionstemperatur | Över natten vid rumstemperatur, skyddad från ljus | Över natten utan att skakas, vid rumstemperatur eller i 120 min utan att skakas (~120 rpm) vid rumstemperatur | Över natten utan att skakas, vid rumstemperatur eller i 120 min utan att skakas (~120 rpm) vid rumstemperatur | Över natten utan att skakas, vid rumstemperatur eller i 120 min utan att skakas (~120 rpm) vid rumstemperatur

Avläst OD-värde | 570 nm (545–595 nm) utan referensfilter | 570 nm (eller 540 nm) utan referensfilter | 570 nm (540–600 nm) utan referensfilter | 540–570 nm utan referensfilter

Kvalitetskontroll av vävnaden | 18 timmars behandling med SDS 1,0 mg/ml ≤ IC50 ≤ 3,0 mg/ml | Behandling med 1 % Triton X-100 4,08 timmar ≤ ET50 ≤ 8,7 timmar | Behandling med 1 % Triton X-100 4,0 timmar ≤ ET50 ≤ 10,0 timmar | Behandling med 1 % Triton X-100 2,0 timmar ≤ ET50 ≤ 7,0 timmar

Acceptanskriterier | 1. Medelvärdet för optisk densitet på de vävnadsreplikat som behandlats med den negativa kontrollen (NaCl) ska vara ≥ 0,6 och ≤ 1,5 för varje exponeringstid. 2. Viabilitetsmedelvärdet för de vävnadsreplikat som exponerats under fyra timmar med den positiva kontrollen (isättika), uttryckt som % av den negativa kontrollen, ska vara ≤ 20 %. 3. Skillnaden i viabilitet mellan två vävnadsreplikat får inte överskrida 30 %, dvs. inom intervallet 20–100 % för viabilitet och ≥ 0,3 när det gäller optisk densitet. | 1. Medelvärdet för optisk densitet på de vävnadsreplikat som behandlats med den negativa kontrollen (H2O) ska vara ≥ 0,8 och ≤ 2,8 för varje exponeringstid. 2. Viabilitetsmedelvärdet för de vävnadsreplikat som exponerats under en timme med den positiva kontrollen (8N KOH), uttryckt som % av den negativa kontrollen, ska vara ≤ 15 %. 3. Inom viabilitetsintervallet på 20–100 % ska variationskoefficienten (CV) mellan vävnadsreplikaten vara ≤ 30 %. | 1. Medelvärdet för optisk densitet på de vävnadsreplikat som behandlats med den negativa kontrollen (H2O) ska vara ≥ 0,8 och ≤ 3,0 för varje exponeringstid. 2. Medelviabilitetsvärdet för de vävnadsreplikat som exponerats i en timme (och i fyra timmar, i förekommande fall) med den positiva kontrollen (8N KOH), uttryckt som % av den negativa kontrollen, ska vara < 15 %. 3. Vid ett viabilitetsintervall på 20–100 % och ett OD-värde på ≥ 0,3 får skillnaden i viabilitet mellan de två vävnadsreplikaten inte överskrida 30 %. | 1. Medelvärdet för optisk densitet på de vävnadsreplikat som behandlats med den negativa kontrollen (H2O) ska vara ≥ 0,8 och ≤ 2,8 för varje exponeringstid. 2. Viabilitetsmedelvärdet för de vävnadsreplikat som exponerats under en timme med den positiva kontrollen (8N KOH), uttryckt som % av den negativa kontrollen, ska vara < 20 %. 3. Vid ett viabilitetsintervall på 20–100 % och ett OD-värde på ≥ 0,3 får skillnaden i viabilitet mellan de två vävnadsreplikaten inte överskrida 30 %.

Tillägg 3

TESTMODELLERNAS PRESTANDA FÖR UNDERKATEGORISERING

Tabellen nedan visar prestandan för de beräknade testmodellerna baserat på en uppsättning av 80 kemikalier som testats av fyra testutvecklare. Beräkningarna genomfördes av OECD:s sekretariat och granskades och godkändes av en undergrupp av experter (21) (23).

Testmodellerna EpiSkin™, EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE och epiCS® kan användas för underkategorisering (dvs. mellan 1A och 1B respektive 1C och NC).

De fyra testmodellernas prestanda och grad av överklassificering, underklassificering och noggrannhet (prediktionskapacitet) baserat på en uppsättning av 80 kemikalier som alla testats i två eller tre omgångar i varje testmodell:

PREDIKTIONSSTATISTIK FÖR SAMTLIGA KEMIKALIER

(n = 80 kemikalier som testats i två oberoende testomgångar för epiCS® eller i tre oberoende testomgångar för EpiDerm™ SCT, EpiSkin™ och SkinEthic™ RHE, dvs. 159 respektive 240 klassificeringar)

EpiSkin™ | EpiDerm™ | SkinEthic™ | epiCS®

Överklassificeringar:

1B-och-1C överklassificerade 1A | 21,50 % | 29,0 % | 31,2 % | 32,8 %

NC överklassificerade 1B och 1C | 20,7 % | 23,4 % | 27,0 % | 28,4 %

NC överklassificerade 1A | 0,00 % | 2,7 % | 0,0 % | 0,00 %

överklassificerade korr. | 20,7 % | 26,1 % | 27,0 % | 28,4 %

Global överklassificeringsgrad (samtliga kategorier) | 17,9 % | 23,3 % | 24,5 % | 25,8 %

Underklassificeringar:

1A underklassificerade 1B och 1C | 16,7 % | 16,7 % | 16,7 % | 12,5 %

1A underklassificerade NC | 0,00 % | 0,00 % | 0,00 % | 0,00 %

1B och 1C underklassificerade NC | 2,2 % | 0,00 % | 7,5 % | 6,6 %

Global underklassificeringsgrad (samtliga kategorier) | 3,3 % | 2,5 % | 5,4 % | 4,4 %

Korrekta klassifikationer:

1A korrekt klassificerad | 83,3 % | 83,3 % | 83,3 % | 87,5 %

1B och 1C korrekt klassificerade | 76,3 % | 71,0 % | 61,3 % | 60,7 %

NC korrekt klassificerad | 79,3 % | 73,9 % | 73,0 % | 71,62 %

Total noggrannhet | 78,8 % | 74,2 % | 70 % | 69,8 %

NC: Icke frätande

1 en kemikalie testades endast en gång i epiCS® på grund av bristande tillgång (23).

Tillägg 4

Nyckelparametrar och acceptanskriterier för kvalificering av HPLC/UPLC-spektrofotometersystem för mätning av MTT-formazan som extraherats ur RhE-vävnad

Parametrar | Protokoll baserat på FDA:s vägledning (37) (38) | Acceptanskriterier

Selektivitet | Analys av isopropanol, blanka levande kontroller (isopropanolextrakt från obehandlad levande RhE-vävnad), blanka döda kontroller (isopropanolextrakt från obehandlad död RhE-vävnad) | Areainterferens ≤ 20 % av areaLLOQ

Precision | Kvalitetskontroller (dvs. MTT-formazan vid 1,6 μg/ml, 16 μg/ml och 160 μg/ml) i isopropanol (n = 5) | CV ≤ 15 % eller ≤ 20 % för LLOQ

Noggrannhet | Kvalitetskontroller i isopropanol (n = 5) | % Dev ≤ 15 % eller ≤ 20 % för LLOQ

Matriseffekt | Kvalitetskontroller i levande blankprov (n = 5) | 85 % ≤ matriseffekt i % ≤ 115 %

Återföring (carry over) | Analys av isopropanol mot en ULOQ2-standard | Areainterference ≤ 20 % av areaLLOQ

Reproducerbarhet (inom en dag) | Tre oberoende kalibreringskurvor (baserade på 6 konsekutiva 1/3-spädningar av MTT-formazan i isopropanol med början vid ULOQ, dvs. 200 μg/ml); Kvalitetskontroller i isopropanol (n = 5) | Kalibreringskurvor: % Dev ≤ 15 % eller ≤ 20 % för LLOQ Kvalitetskontroller: % Dev ≤ 15 % och CV ≤ 15 %

Reproducerbarhet (mellan dagar) | Dag 1 En kalibreringskurva och kvalitetskontroller i isopropanol (n = 3) Dag 2 En kalibreringskurva och kvalitetskontroller i isopropanol (n = 3) Dag 3 En kalibreringskurva och kvalitetskontroller i isopropanol (n = 3)

MTT-formazanets kortsiktiga stabilitet i RhE-vävnadsextrakt | Kvalitetskontroller i blanka levande kontroller (n = 3) som analyserats på dagen för beredningen samt efter 24 timmars förvaring i rumstemperatur | % Dev ≤ 15 %

MTT-formazanets långsiktiga stabilitet i RhE-vävnadsextrakt, i förekommande fall | Kvalitetskontroller i blanka levande kontroller (n = 3) som analyserats på dagen för beredningen samt efter flera dagars förvaring vid specifik temperatur (t.ex. 4 oC, –20 oC, –80 oC) | %Dev ≤ 15 %

1 LLOQ: Undre kvantifieringsgräns, definierad för att omfatta 1–2 % vävnadsviabilitet, dvs. 0,8 μg/ml.

2 ULOQ: Övre kvantifieringsgräns, definierad för att vara minst dubbel så hög som den högsta förväntade koncentrationen av MTT-formazan i isopropanolextrakt från negativa kontroller, dvs. 200 μg/ml.

Tillägg 1

DEFINITIONER

Tillägg 2

TESTMODELLER SOM INGÅR I DENNA TESTMETOD

Nr | Testmodellens namn | Typ av valideringsstudie | Källor

1 | EpiSkin™ | Fullständig prospektiv valideringsstudie (2003–2007). Komponenterna i denna modell användes för att definiera de essentiella testmetodkomponenterna i den ursprungliga respektive den uppdaterade ECVAM PS (39) (40) (21). Data från metoden beträffande identifiering av icke klassificerade respektive klassificerade ämnen utgjorde dessutom den viktigaste grunden för att definiera specificitet och sensitivitet i de ursprungliga PS. | (2) (10) (11) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (23) (32) (39) (40)

2 | EpiDerm™ SIT (EPI-200) | EpiDerm™ (original): Testmodellen genomgick en fullständig prospektiv valideringsstudie med nr 1 under åren 2003–2007. Komponenterna i denna modell användes för att definiera de essentiella testmetodkomponenterna i den ursprungliga respektive den uppdaterade ECVAM PS (39) (40) (21). EpiDerm™ SIT (EPI-200): En modifierad version av den ursprungliga EpiDerm™ validerades med hjälp av ECVAM:s ursprungliga PS (21) 2008. (2) (21) (22) (23) (33) | (2) (10) (12) (13) (15) (16) (17) (18) (20) (21) (23) (33) (39) (40)

3 | SkinEthic™ RHE | Valideringsstudie baserad på ECVAM:s ursprungliga prestandastandarder (21) 2008. | (2) (21) (22) (23) (31)

4 | LabCyte EPI-MODEL24 SIT | Valideringsstudie (2011–2012) baserad på prestandastandarderna (PS) i OECD TG 439 (8), vilka i sin tur baseras på ECVAM:s uppdaterade PS (39) (40). | (24) (25) (26) (27) (28) (35) (39) (40) samt PS i denna TG (8)

1 ECVAM:s ursprungliga prestandastandarder (PS) (21) utvecklades 2007 efter den prospektiva valideringsstudie (16) som bedömde prestandan hos testmodellerna nr 1 och 2 utefter det klassificeringssystem som beskrivs i det tjugoåttonde tillägget till EU:s direktiv om farliga ämnen (41). År 2008 introducerades GHS (1) och EU:s CLP, vilket förskjöt gränsvärdet för att skilja icke-klassificerade ämnen från klassificerade, från en in vivo-gradering på 2,0 till 2,3. Noggrannhetsvärdena och listan över referenskemikalier i ECVAM:s PS uppdaterades 2009 för att anpassas till den nya lagstiftningen (2) (39) (40). I likhet med de ursprungliga PS baserades de uppdaterade PS till stor del på data från modell 1 och 2 (16), men använde dessutom data om referenskemikalier från modell 3. År 2010 användes EVCAM:s uppdaterade PS för att slå fast PS för denna TG (8). När det gäller denna testmetod anses EpiSkin™ utgöra metodens VRM, eftersom den använts för att utveckla samtliga av metodens PS-kriterier. Detaljerad information om valideringsstudierna, en datasammanställning samt bakgrunden till de nödvändiga anpassningar som gjorts av PS på grund av genomförandet av GHS/CLP finns i ECVAM/BfR:s förklarande bakgrundsdokument till motsvarande OECD TG 439 (23).

Tillägg 3

SPECIFIKA PROTOKOLLPARAMETRAR FÖR VARJE TESTMODELL SOM INGÅR I DENNA TESTMETOD

RhE-modellerna har snarlika protokoll, och det är värt att notera att alla använder sig av en period efter inkubation på 42 timmar (32) (33) (34) (35). Skillnaderna finns framför allt i de tre parametrar som har med testmodellernas barriärfunktioner att göra och listas här nedan: A) tid och volym före inkubation, B) applicering av testkemikalier och C) volym efter inkubation.

EpiSkinTM (SM) | EpiDermTM SIT (EPI-200) | SkinEthic RHETM | LabCyte EPI-MODEL24 SIT

Inkubationstid | 18–24 timmar | 18–24 timmar | < 2 timmar | 15-30 timmar

Mediets volym | 2 ml | 0,9 ml | 0,3 eller 1 ml | 0,5 ml

För vätskor | 10 μl (26 μl/cm2) | 30 μl (47 μl/cm2) | 16 μl (32 μl/cm2) | 25 μl (83 μl/cm2)

För fasta ämnen | 10 mg (26 mg/cm2) + DW (5 μl) | 25 mg (39 mg/cm2) + DPBS (25 μl) | 16 mg (32 mg/cm2) + DW (10 μl) | 25 mg (83 mg/cm2) + DW (25 μl)

Användning av nylonnät | Används inte | Vid behov | Applicerad | Används inte

Total appliceringstid | 15 minuter | 60 minuter | 42 minuter | 15 minuter

Appliceringstemperatur | rumstemperatur | a) i 25 minuter vid rumstemperatur b) i 35 minuter vid 37 oC | rumstemperatur | rumstemperatur

Mediets volym | 2 ml | 0,9 ml × 2 | 2 ml | 1 ml

Standardavvikelse mellan vävnadsreplikaten | SD18 | SD18 | SD18 | SD18

Tillägg 4

NYCKELPARAMETRAR OCH ACCEPTANSKRITERIER FÖR KVALIFICERING AV HPLC/UPLC-SPEKTROFOTOMETERSYSTEM FÖR MÄTNING AV MTT-FORMAZAN SOM EXTRAHERATS UR RHE-VÄVNADER

Parametrar | Protokoll baserat på FDA:s vägledning (36) (37) | Acceptanskriterier

Precision | Kvalitetskontroller (dvs. MTT-formazan vid 1,6 μg/ml, 16 μg/ml och 160 μg/ml ) i isopropanol (n = 5) | CV ≤ 15 % eller ≤ 20 % för LLOQ-området

Noggrannhet | Kvalitetskontroller i isopropanol (n = 5) | % Dev ≤ 15 % eller ≤ 20 % för LLOQ

Matriseffekt | Kvalitetskontroller i levande blankprov (n = 5) | 85 % ≤ matriseffekt i % ≤ 115 %

Återföring (carry over) | Analys av isopropanol mot en ULOQ-standard | Areainterference ≤ 20 % av areaLLOQ

Reproducerbarhet (inom en dag) | Tre oberoende kalibreringskurvor (baserade på sex på varandra följande spädningar av MTT-formazan i isopropanol (1:3) med start i ULOQ, dvs. 200 μg/ml) Kvalitetskontroller i isopropanol (n = 5) | Kalibreringskurvor: % Dev ≤ 15 % eller ≤ 20 % för LLOQ Kvalitetskontroller: % Dev ≤ 15 % och CV ≤ 15 %

MTT-formazanets långsiktiga stabilitet i RhE-vävnadsextrakt, i förekommande fall | Kvalitetskontroller i blanka levande kontroller (n = 3) som analyserats på dagen för beredningen samt efter flera dagars förvaring vid en specifik temperatur (t.ex. 4 oC, –20 oC, –80 oC) | %Dev ≤ 15 %

1 LLOQ: Undre kvantifieringsgräns definierad för att omfatta 1–2 % vävnadsviabilitet, dvs. 0,8 μg/ml.

Tillägg 1

DEFINITIONER (SE ÄVEN OECD GD 150 (6))

Androgenicitet är förmågan hos en kemikalie att fungera som ett naturligt androgent hormon (t.ex. testosteron) hos ett däggdjur.

Antiandrogenicitet är förmågan hos en kemikalie att undertrycka verkan av ett naturligt androgent hormon (t.ex. testosteron) hos ett däggdjur.

Anti-östrogenicitet är förmågan hos en kemikalie att undertrycka verkan av ett naturligt östrogent hormon (t.ex. 17ß-östradiol) hos ett däggdjur.

Antityreoid aktivitet är förmågan hos en kemikalie att undertrycka verkan av ett naturligt tyreoideahormon (t.ex. T3) hos ett däggdjur.

Kemikalie: ett ämne eller en blandning.

Utvecklingstoxicitet: uttryck för reproduktionstoxicitet i form av pre-, peri- eller postnatala strukturella eller funktionella störningar i avkomman.

Dosering är en allmän term som omfattar dos, dess frekvens samt doseringens varaktighet.

Dos är den mängd testkemikalie som administreras. Dosen uttrycks som testkemikaliens vikt per enhet kroppsvikt av försöksdjur per dag (t.ex. mg/kg kroppsvikt/dag), eller som en konstant kostkoncentration.

Uppenbar toxicitet är en allmän term som beskriver tydliga tecken på toxicitet efter tillförsel av testkemikalien. Dessa bör vara tillräckliga för en riskbedömning och bör vara sådana att en ökning av den tillförda dosen kan förväntas resultera i utvecklingen av allvarliga toxicitetssymptom och sannolikt leda till mortalitet.

Nedsatt fertilitet innebär störningar i fortplantningsförmågan hos hanen eller honan.

Maternell toxicitet: skadliga effekter på dräktiga honor som kan ske antingen specifikt (direkt effekt) eller icke-specifikt (indirekt effekt).

NOAEL är förkortningen för nivån där ingen skadlig effekt observeras. Detta är den högsta dosnivå där inga behandlingsrelaterade fynd observerats på grund av behandling.

Östrogenicitet är förmågan hos en kemikalie att agera som ett naturligt östrogent hormon (t.ex. 17ß-östradiol) hos ett däggdjur.

Reproduktionstoxicitet innebär skadliga effekter på avkomman och/eller en försämring av fortplantningsförmågan hos hanar och honor.

Testkemikalie: varje ämne eller blandning som testas med denna testmetod.

Tyreoid aktivitet är förmågan hos en kemikalie att agera som ett naturligt tyreoideahormon (t.ex. T3) hos ett däggdjur.

Validering är en vetenskaplig process utformad för att karakterisera de operativa kraven och begränsningarna hos en testmetod och visa dess tillförlitlighet och relevans för ett visst ändamål.

Tillägg 2

FÖRSÖKSSCHEMA SOM VISAR STUDIENS MAXIMALA VARAKTIGHET, BASERAT PÅ EN 14-DAGARS PARNINGSPERIOD

Tillägg 3

SAMMANFATTNING I TABELLFORM AV EFFEKTER PÅ REPRODUKTION/UTVECKLING

IAKTTAGELSER | VÄRDEN

Dosering (enheter) | 0 (kontroll) | … | … | … | …

Startade par (N)

Ägglossningscykel (för oregelbundna cykler åtminstone medellängd och frekvens)

Honor som bevisligen befruktats (N)

Honor som blivit dräktiga (N)

Befruktningsdag 1–5 (N)

Befruktningsdag 6–... (N)

Dräktighetsperiod ≤ 21 dagar (N)

Dräktighetsperiod = 22 dagar (N)

Dräktighetsperiod ≥ 23 dagar (N)

Moderdjur med levande ungar (N)

Moderdjur med levande ungar på dag 4 post partum (N)

Implantationer/moderdjur (medel)

Levande ungar/moderdjur vid födseln (medel)

Levande ungar/moderdjur på dag 4 (medel)

Könsfördelning (m/f) vid födseln (medel)

Könsfördelning (m/f) på dag 4 (medel)

Kullens vikt vid födseln (medel)

Kullens vikt på dag 4 (medel)

Ungarnas vikt vid födseln (medel)

Ungarnas vikt vid AGD-mätningen (medel – hanungar, medel – honungar)

Ungarnas AGD på samma dag efter födseln, från födseln – dag 4 (medel – hanungar, medel – honungar)

Ungarnas vikt på dag 4 (medel)

Bröstvårteretention hos hanungarna på dag 13 (medel)

Ungarnas vikt på dag 13 (medel)

ONORMALA UNGAR

Moderdjur med 0

Moderdjur med 1

Moderdjur med ≥ 2

FÖRLORAD AVKOMMA

Prenatal/post-implantationer (implantationer minus levande födda)

Honor med 0

Honor med 1

Honor med 2

Honor med ≥ 3

Postnatal (levande födda minus levande ungar på dag 13)

Honor med 0

Honor med 1

Honor med 2

Honor med ≥ 3

1 Parningsperiodens sista dag

Tillägg 1

DEFINITIONER (SE ÄVEN (20) OECD GD 150)

Androgenicitet är förmågan hos en kemikalie att fungera som ett naturligt androgent hormon (t.ex. testosteron) hos ett däggdjur.

Antiandrogenicitet är förmågan hos en kemikalie att undertrycka verkan av ett naturligt androgent hormon (t.ex. testosteron) hos ett däggdjur.

Anti-östrogenicitet är förmågan hos en kemikalie att undertrycka verkan av ett naturligt östrogent hormon (t.ex. 17ß-östradiol) hos ett däggdjur.

Antityreoid aktivitet är förmågan hos en kemikalie att undertrycka verkan av ett naturligt tyreoideahormon (t.ex. T3) hos ett däggdjur.

Kemikalie ett ämne eller en blandning.

Utvecklingstoxicitet uttryck för reproduktionstoxicitet i form av pre-, peri- eller postnatala strukturella eller funktionella störningar i avkomman.

Dos är den mängd testkemikalie som administreras. Dosen uttrycks som testkemikaliens vikt per enhet kroppsvikt av försöksdjuret per dag (t.ex. mg/kg kroppsvikt/dag), eller som en konstant kostkoncentration.

Dosering är en allmän term som omfattar dosen, dess frekvens samt doseringens varaktighet.

Nedsatt fertilitet innebär störningar i fortplantningsförmågan hos hanen eller honan.

Maternell toxicitet skadliga effekter på dräktiga honor som kan ske antingen specifikt (direkt effekt) eller icke-specifikt (indirekt effekt) och som är relaterade till det dräktiga tillståndet.

NOAEL är förkortningen för den nivå där ingen skadlig effekt observeras. Detta är den högsta dosnivå där inga behandlingsrelaterade fynd observerats på grund av behandling.

Östrogenicitet är förmågan hos en kemikalie att agera som ett naturligt östrogent hormon (t.ex. 17ß-östradiol) hos ett däggdjur.

Reproduktionstoxicitet innebär skadliga effekter på avkomman och/eller en försämring av fortplantningsförmågan hos hanar och honor.

Testkemikalie varje ämne eller blandning som testas med denna testmetod.

Tyreoid aktivitet är förmågan hos en kemikalie att agera som ett naturligt tyreoideahormon (t.ex. T3) hos ett däggdjur.

Validering är en vetenskaplig process utformad för att karakterisera de operativa kraven och begränsningarna hos en testmetod och visa dess tillförlitlighet och relevans för ett visst ändamål.

Tillägg 2

FÖRSÖKSSCHEMA SOM VISAR STUDIENS MAXIMALA VARAKTIGHET, BASERAT PÅ EN 14-DAGARS PARNINGSPERIOD

Tillägg 3

SAMMANFATTNING I TABELLFORM AV EFFEKTER PÅ REPRODUKTION/UTVECKLING

IAKTTAGELSER | VÄRDEN

Dosering (enheter)....... | 0 (kontroll) | … | … | … | …

Startade par (N)

Ägglossningscykel (för oregelbundna cykler åtminstone medellängd och frekvens)

Honor som bevisligen befruktats (N)

Honor som blivit dräktiga (N)

Befruktningsdag 1–5 (N)

Befruktningsdag 6–... (N)

Dräktighetsperiod ≤ 21 dagar (N)

Dräktighetsperiod = 22 dagar (N)

Dräktighetsperiod ≥ 23 dagar (N)

Moderdjur med levande ungar (N)

Moderdjur med levande ungar på dag 4 post partum (N)

Implantationer/moderdjur (medel)

Levande ungar/moderdjur vid födseln (medel)

Levande ungar/moderdjur på dag 4 (medel)

Könsfördelning (m/f) vid födseln (medel)

Könsfördelning (m/f) på dag 4 (medel)

Kullens vikt vid födseln (medel)

Kullens vikt på dag 4 (medel)

Ungarnas vikt vid födseln (medel)

Ungarnas vikt vid tidpunkten för AGD-mätningen (medel – hanungar, medel – honungar)

Ungarnas AGD på samma dag efter födseln, från födseln – dag 4 (medel – hanungar, medel – honungar, notera PND)

Ungarnas vikt på dag 4 (medel)

Ungarnas vikt på dag 13 (medel)

Bröstvårteretention hos hanungarna på dag 13 (medel)

ONORMALA UNGAR

Moderdjur med 0

Moderdjur med 1

Moderdjur med ≥ 2

FÖRLORAD AVKOMMA

Prenatal (implantationer minus levande födda)

Honor med 0

Honor med 1

Honor med 2

Honor med ≥ 3

Postnatal (levande födda minus levande ungar på PND 13)

Honor med 0

Honor med 1

Honor med 2

Honor med ≥ 3

1 Parningsperiodens sista dag.

Tillägg

DEFINITIONER

Tillägg 1

DEFINITIONER OCH FÖRKORTNINGAR

1 Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 av den 18 december 2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach), inrättande av en europeisk kemikaliemyndighet, ändring av direktiv 1999/45/EG och upphävande av rådets förordning (EEG) nr 793/93 och kommissionens förordning (EG) nr 1488/94 samt rådets direktiv 76/769/EEG och kommissionens direktiv 91/155/EEG, 93/67/EEG, 93/105/EG och 2000/21/EG (EUT L 304, 22.11.2007, s. 1).

Tillägg 2

STABILT TRANSFEKTERAD MÄNSKLIG ÖSTROGENRECEPTOR-Α – TRANSAKTIVERINGSANALYS FÖR DETEKTION AV ÖSTROGENAGONISTISK OCH -ANTAGONISTISK AKTIVITET HOS KEMIKALIER MED ANVÄNDNING AV CELLINJEN HERΑ-HELA-9903

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR (SE ÄVEN ALLMÄN INLEDNING)

1. Detta transaktiveringstest (TA) använder cellinjen hERα-HeLa-9903 för att detektera östrogenagonistisk aktivitet, medierad genom human östrogenreceptor alfa (hERα). Valideringsstudien för stabilt transfekterad transaktivering (Stably Transfected Transactivation) (STTA), som utförts av CERI (Japanese Chemicals Evaluation and Research Institute) med användning av cellinjen hERα-HeLa-9903 för att detektera östrogenagonistisk och antagonistisk aktivitet medierad genom human östrogenreceptor alfa, visade att testmetoden är relevant och tillförlitlig för det avsedda syftet (1).

2. Denna testmetod är särskilt utformad för att detektera hERα-medierad transaktivering genom att mäta kemiluminiscens som endpoint. Ej receptormedierade luminiscenssignaler har dock rapporterats vid fytoöstrogenkoncentrationer högre än 1 μM till följd av överaktivering av luciferasrapportgenen (2) (3). Dosresponskurvan visar att den faktiska aktiveringen av östrogenreceptorsystemet inträffar vid lägre koncentrationer, men det luciferasuttryck som erhålls vid höga koncentrationer av fytoöstrogener eller liknande föreningar som misstänks producera fytoöstrogenlik överaktivering av luciferasrapportgenen, måste undersökas noggrant i stabilt transfekterade ER TA-testsystem (tillägg 1).

3. Avsnitten Allmän inledning och Komponenter i ER TA-testet bör läsas innan denna testmetod används för lagstadgade ändamål. Definitioner och förkortningar som används i denna testriktlinje beskrivs i tillägg 2.1.

PRINCIPER FÖR METODEN (SE ÄVEN ALLMÄN INLEDNING)

4. Denna testmetod används för att signalera östrogenreceptorns bindning med en ligand. Efter ligandbindning translokerar receptor–ligand-komplexet till kärnan, där det binder specifika DNA-responselement och transaktiverar en firefly-luciferasrapportgen, vilket leder till ökat celluttryck av luciferasenzym. Luciferin är ett substrat som luciferasenzymet omvandlar till en bioluminiscent produkt som kan mätas kvantitativt med en luminometer. Luciferasaktivitet kan utvärderas snabbt och till låg kostnad med ett antal kommersiellt tillgängliga testkit.

5. Testsystemet använder cellinjen hERα-HeLa-9903, som härleds från en human cervikal tumör, med två stabilt infogade konstruktioner: i) Konstruktionen med hERαα-uttryck (som kodar för hela den humana receptorn), och ii) en konstruktion med en firefly-luciferas-rapportgen som bär fem tandemupprepningar av ett vitellogenin-östrogenreceptivt element (ERE), som drivs av ett MT-promotor (metallotionein) TATA-element från möss. MT TATA-genkonstruktionen från möss har visat bäst resultat, och används därför utbrett. Denna hERα-HeLa-9903-cellinje kan således mäta en testkemikalies förmåga att inducera hERα-medierad transaktivering från luciferasgenuttrycket.

6. I ER-agonisttestet baseras datatolkningen på huruvida den maximala responsnivå som induceras av en agonistrespons motsvarar eller överskrider 10 % av den respons som induceras genom en maximalt inducerande koncentration (1 nM) av den positiva kontrollen (PC) 17β-östradiol (E2) (dvs. PC10). I ER-antagonisttestet baseras datatolkningen på huruvida responsen visar en minskning på minst 30 % i aktiviteten från den respons som induceras genom den spikade kontrollen (25 pM E2) utan cytotoxicitet. Dataanalys och tolkning diskuteras i detalj i punkterna 34–48.

FÖRFARANDE

Cellinjer

7. Den stabilt transfekterade cellinjen hERα-HeLa-9903 bör användas i testet. Denna cellinje kan erhållas från cellbanken JRCB (Japanese Collection of Research Bioresources) genom att man ingår ett materialöverföringsavtal (MTA).

8. Endast celler som karakteriseras som mykoplasmafria bör användas i testningen. RT-PCR (Real Time Polymerase Chain Reaktion) är den valda metoden för en känslig detektion av mykoplasmainfektion (4) (5) (6).

Cellinjens stabilitet

9. För att övervaka cellinjens stabilitet bör E2, 17α-östradiol, 17α-metyltestosteron och kortikosteron användas som referensstandarder för agonisttest. En fullständig koncentrationsresponskurva i det testkoncentrationsintervall som anges i tabell 1 bör mätas minst en gång varje gång testet utförs, och resultaten bör överensstämma med de resultat som anges i tabell 1.

10. Vad beträffar antagonisttest bör två fullständiga koncentrationskurvor för två referensstandarder, tamoxifen och flutamid, mätas samtidigt med varje testomgång. Det är viktigt att övervaka en korrekt kvalitativ klassificering som positiv eller negativ för de två kemikalierna.

Betingelser för cellodling och överföring till platta

11. Cellerna bör förvaras i EMEM (Eagle’s Minimum Essential Medium) utan fenolrött, kompletterat med 60 mg/l antibiotiskt kanamycin och 10 % dextranbelagt träkolsbehandlat fetalt bovinserum (DCC-FBS), i en CO2-inkubator (5 % CO2) vid 37±1°C. När cellerna når 75–90 % konfluens kan de subkultiveras vid 10 ml av 0,4 x 105 – 1 x 105 celler/ml för en cellodlingsskål på 100 mm. Cellerna bör suspenderas med 10 % FBS-EMEM (som är detsamma som EMEM med DCC-FBS) och sedan överföras till hål på en mikrotiterplatta vid en densitet på 1 x 104 celler/(100 μl x hål). Därefter bör cellerna förinkuberas i en 5 % CO2-inkubator vid 37 ± 1 °C i tre timmar före kemisk exponering. Plastvaran bör vara fri från östrogenaktivitet.

12. För att bibehålla responsens integritet bör cellerna odlas mer än en passage från den frysta stamodlingen i det konditionerade mediet, men bör inte odlas mer än 40 passager. För cellinjen hERα-HeLa-9903 kommer detta att ta mindre än tre månader. Cellernas prestanda kan dock minskas om de odlas under olämpliga odlingsförhållanden.

13. DCC-FBS kan beredas enligt beskrivningen i tillägg 2.2, eller erhållas från kommersiella källor.

Acceptanskriterier

Positiva och negativa referensstandarder för ER-agonisttest

14. Före och under studien bör testsystemets responsförmåga kontrolleras med hjälp av lämpliga koncentrationer av en stark östrogen (E2), en svag östrogen (17α-östradiol), en mycket svag agonist (17α-metyltestosteron) och ett negativt ämne (kortikosteron). Godtagbara intervallvärden som härletts från valideringsstudien (1) anges i tabell 1. Dessa fyra parallella referensstandarder bör ingå i varje försök och resultaten bör falla inom de givna godtagbara gränserna. Om så inte är fallet bör man fastställa orsaken till att acceptanskriterierna inte har uppfyllts (t.ex. hantering av cellerna, serum och antibiotika för kvalitet och koncentration), och därefter upprepa testet. När acceptanskriterierna har uppfyllts är det viktigt att cellodlingsmaterialet används på ett konsekvent sätt för att säkerställa minimal variation av värdena för EC50, PC50 och PC10. De fyra parallella referensstandarderna, som bör ingå i varje försök (som utförs under samma förhållanden, inklusive material, cellernas passagenivå och av samma tekniker), kan säkerställa testets sensitivitet, eftersom PC10 från de tre positiva referensstandarderna bör falla inom ett godtagbart intervall, vilket även gäller PC50 och EC50 om de kan beräknas (se tabell 1).

Tabell 1 Godtagbara intervallvärden för de fyra referensstandarderna för ER-agonisttestet

17β-östradiol (E2) CAS-nr: 50-28-2 | –11,4~–10,1 | < – 11 | -11,3~–10,1 | 0,7~1,5 | 10-14~10-8M

17α-östradiol CAS-nr: 57-91-0 | -9,6~-8,1 | -10,7~-9,3 | -9,6~-8,4 | 0,9~2,0 | 10-12~10-6M

Kortikosteron CAS-nr: 50-22-6 | — | — | — | — | 10-10~10-4M

17α-metyltestosteron CAS-nr: 58-18-4 | -6,0~-5,1 | – 8,0~– 6,2 | — | — | 10-11~10-5M

Positiva och negativa referensstandarder för ER-antagonisttestet

15. Före och under studien bör testsystemets responsförmåga kontrolleras med hjälp av lämpliga koncentrationer av ett positivt ämne (tamoxifen) och ett negativt ämne (flutamid). Godtagbara intervallvärden som härletts från valideringsstudien (1) anges i tabell 2. Dessa två parallella referensstandarder bör ingå i varje försök och resultaten bör bedömas som korrekta enligt kriterierna. Om så inte är fallet bör man fastställa orsaken till att kriterierna inte har uppfyllts (t.ex. hantering av cellerna, kvalitet och koncentration hos serum och antibiotika), och därefter upprepa testet. Dessutom bör IC50-värden för ett positivt ämne (tamoxifen) beräknas och resultaten bör falla inom givna godtagbara gränser. När acceptanskriterierna har uppfyllts är det viktigt att cellodlingsmaterialet används på ett konsekvent sätt för att säkerställa minimal variation hos IC50-värdena. De två parallella referensstandarderna, som bör ingå i varje försök (som utförs under samma förhållanden, inklusive material, cellernas passagenivå och av samma tekniker), kan säkerställa testets sensitivitet (se tabell 2).

Tabell 2 Kriterier och godtagbara intervallvärden för de två referensstandarderna för ER-antagonisttestet

Namn | Kriterier | LogIC50 | Testintervall

Tamoxifen CAS-nr: 10540-29-1 | Positivt: IC50 bör beräknas. | –5,942~–7,596 | 10-10~10-5M

Flutamid CAS-nr: 13311-84-7 | Negativt: IC30 bör inte beräknas. | — | 10-10 ~10-5M

Positiva kontroller och vehikelkontroller

16. Den positiva kontrollen för ER-agonisttest (1 nM av E2) och för ER-antagonisttest (10μM tamoxifen) bör testas i minst tre replikat på varje platta. Den vehikel som används för att lösa upp testkemikalien bör testas som vehikelkontroll i minst tre replikat på varje platta. Om en annan vehikel används i den positiva kontrollen än för testkemikalien, bör en annan vehikelkontroll utöver denna vehikelkontroll testas i minst tre replikat på samma platta med den positiva kontrollen.

Kvalitetskriterier för ER-agonisttest

17. Medelvärdet för luciferasaktiviteten i den positiva kontrollen (1 nM E2) bör vara minst fyra gånger medelvärdet för den positiva kontrollen på varje platta. Detta kriterium fastställs på grundval av hur tillförlitliga endpoint-värdena från valideringsstudien är (historiskt mellan fyra och trettio gånger).

18. När det gäller kvalitetskontrollen av testet bör den x-faldiga induktion som motsvarar PC10-värdet för den parallella positiva kontrollen (1 nM E2) vara högre än n 1+2SD av den x-faldiga induktionen (= 1) för den parallella vehikelkontrollen. För prioriteringssyften kan PC10-värdet vara användbart för att förenkla den nödvändiga dataanalysen jämfört med en statistisk analys. En statistisk analys ger visserligen information om signifikans men är inte en kvantitativ parameter för den koncentrationsbaserade potentialen, och är därför mindre användbar i prioriteringssyfte.

Kvalitetskriterier för ER-antagonisttest

19. Medelvärdet för luciferasaktiviteten i den spikade kontrollen (25 pM E2) bör vara minst fyra gånger medelvärdet för den positiva kontrollen på varje platta. Detta kriterium fastställs på grundval av hur tillförlitliga endpoint-värdena från valideringsstudien är.

20. Vad gäller kvalitetskontrollen av testet bör den relativa transkriptionella aktiveringen (RTA) av 1 nM E2 vara större än 100 %, RTA av 1μM 4-hydroxitamoxifen (OHT) vara mindre än 40,6 % och RTA av 100 μM Digitonin (Dig) vara mindre än 0 %. Demonstration av laboratoriets kompetens (se punkt 14 och tabellerna 3 och 4 i Komponenter i ER TA-test i denna testmetod).

Vehikel

21. Dimetylsulfoxid (DMSO) eller ett lämpligt lösningsmedel vid samma koncentration som används för de olika positiva och negativa kontrollerna samt testkemikalierna bör användas som parallell vehikelkontroll. Testkemikalierna bör lösas upp i ett lämpligt lösningsmedel som är blandbart med cellmediet. Vatten, etanol (renhetsgrad 95 % till 100 %) och DMSO är lämpliga vehiklar. Om DMSO används bör nivån inte överskrida 0,1 % (v/v). För alla vehiklar ska det visas att den maximala volym som används inte är cytotoxisk och inte har en störande verkan på genomförandet av testet.

Beredning av testkemikalierna

22. Generellt bör testkemikalierna lösas upp i DMSO eller ett annat lämpligt lösningsmedel och spädas ut i omgångar med samma lösningsmedel vid ett gemensamt intervall på 1:10 för att bereda lösningar med utspädning med mediet.

Löslighet och cytotoxicitet: överväganden för koncentrationsintervalltest

23. Ett förberedande test bör göras för att fastställa lämpligt koncentrationsintervall för den kemikalie som ska testas och för att utröna om testkemikalien har några löslighets- och cytotoxicitetsproblem. Inledningsvis testas kemikalierna upp till den högsta koncentrationen på 1 μl/ml, 1 mg/ml eller 1 mM, beroende på vilken koncentration som är lägst. Baserat på omfattningen av cytotoxicitet eller bristande lösningsförmåga som observerats under det förberedande testet, bör den första definitiva testomgången testa kemikalien vid logaritmisk seriespädning, med utgångspunkt från den högsta godtagbara koncentrationen (t.ex. 1 mM, 100μM, 10μM, osv.). Förekomst av grumlighet, fällningar eller cytotoxicitet ska noteras. Koncentrationerna i den andra och vid behov den tredje testomgången bör om nödvändigt justeras för att bättre karakterisera koncentrationens responskurva och undvika koncentrationer som konstateras vara olösliga eller ger överdriven cytotoxicitet.

24. För ER-agonister och ER-antagonister kan ökande nivåer av cytotoxicitet avsevärt ändra eller eliminera den typiska sigmoida (S-formiga) responsen, vilket bör vägas in i datatolkningen. Testmetoder för cytotoxicitet som kan ge information om 80 % cellviabilitet bör användas, med hjälp av ett lämpligt test baserat på laboratoriets erfarenhet.

25. Om resultatet av cytotoxicitetstestet visar att koncentrationen av testkemikalien har minskat cellantalet med 20 % eller mer bör denna koncentration anses vara cytotoxisk, och koncentrationer vid eller över den cytotoxiska koncentrationen bör undantas från utvärderingen.

Kemisk exponering och beredning av testplattor

26. Förfarandet för kemiska utspädningar (steg-1 och steg-2) samt exponering till cellerna (steg-3) kan utföras enligt följande: Steg-1: Varje testkemikalie bör spädas ut i omgångar i DMSO eller ett lämpligt lösningsmedel och överföras till hålen i en mikrotiterplatta för att uppnå slutliga seriekoncentrationer enligt det förberedande testet för att bestämma koncentrationsintervall (vanligen i serier av exempelvis 1 mM, 100 μM, 10 μM, 1μM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM och 10 pM (10-3–10-11 M)) för triplikattestning. Steg-2: Kemisk utspädning: Späd först ut 1,5 μl av testkemikalien i lösningsmedlet till en volym på 500 μl av mediet. Steg-3: Kemisk exponering av cellerna: Överför 50 μl spädning till mediet (som förbereddes i steg-2) till en testbrunn som innehåller 104 celler/100 μl/brunn. Den rekommenderade slutliga volymen av medium som behövs för varje brunn är 150 μl. Testprov och referensstandarder kan fördelas enligt tabellerna 3 och 4.

Tabell 3 Exempel på fördelning av koncentrationer av referensstandarderna i testplattan i ER-agonisttestet

Rad | 17α-metyltestosteron | Kortikosteron | 17α-östradiol | E2

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12

A | konc. 1 (10 μM) | → | → | 100 μM | → | → | 1 μM | → | → | 10 nM | → | →

B | konc. 2 (1 μM) | → | → | 10 μM | → | → | 100 nM | → | → | 1 nM | → | →

C | konc. 3 (100 nM) | → | → | 1 μM | → | → | 10 nM | → | → | 100 pM | → | →

D | konc. 4 (10 nM) | → | → | 100 nM | → | → | 1 nM | → | → | 10 pM | → | →

E | konc. 5 (1 nM) | → | → | 10 nM | → | → | 100 pM | → | → | 1 pM | → | →

F | konc. 6 (100 pM) | → | → | 1 nM | → | → | 10 pM | → | → | 0,1 pM | → | →

G | konc. 7 (10 pM) | → | → | 100 pM | → | → | 1 pM | → | → | 0,01 pM | → | →

H | VC | → | → | → | → | → | PC | → | → | → | → | →

27. Referensstandarderna (E2, 17α-östradiol, 17-μετψλτεστοστερονμοχηοκορτικοστερονκκββρρτεσταστιιιαρφεετεστομγΣνγννταβελλτττττHål för positiva kontroller som behandlas med 1 nM av E2 som kan ge maximal induktion av E2 och hål för vehikelkontroll som endast behandlas med DMSO (eller lämpligt lösningsmedel) bör ingå i varje testplatta (tabell 4). Om celler från olika källor (t.ex. olika passageantal, olika partier osv.) används i samma försök bör referensstandarderna testas för varje cellkälla.

Tabell 4 Exempel på fördelning av koncentrationer av test- och kontrollkemikalierna i testplattan i ER-agonisttest

Rad | Testkemikalie 1 | Testkemikalie 2 | Testkemikalie 3 | Testkemikalie 4

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12

A | konc. 1 (10 μM) | → | → | 1 mM | → | → | 1 μM | → | → | 10 nM | → | →

B | konc. 2 (1 μM) | → | → | 100 μM | → | → | 100 nM | → | → | 1 nM | → | →

C | konc. 3 (100 nM) | → | → | 10 μM | → | → | 10 nM | → | → | 100 pM | → | →

D | konc. 4 (10 nM) | → | → | 1 μM | → | → | 1 nM | → | → | 10 pM | → | →

E | konc. 5 (1 nM) | → | → | 100 nM | → | → | 100 pM | → | → | 1 pM | → | →

F | konc. 6 (100 pM) | → | → | 10 nM | → | → | 10 pM | → | → | 0,1 pM | → | →

G | konc. 7 (10 pM) | → | → | 1 nM | → | → | 1 pM | → | → | 0,01 pM | → | →

H | VC | → | → | → | → | → | PC | → | → | → | → | →

Tabell 5 Exempel på fördelning av koncentrationer av referensstandarderna i testplattan i ER-antagonisttest

28. För att utvärdera kemikaliers antagonistiska aktivitet bör testhålen i raderna A till G spikas med 25pM E2. Referensstandarderna (tamoxifen och flutamid) bör testas i varje testomgång. Hål för positiva kontroller som behandlats med 1 nM av E2, som kan användas som kvalitetskontroll för cellinjen hERα-HeLa-9903, hål för vehikelkontroller som behandlats med DMSO (eller lämpligt lösningsmedel), 0,1 % DMSO-hål som behandlats med en tillsats av DMSO till den spikade E2 motsvarande hål med spikad kontroll, hål som behandlats med den slutliga koncentrationen 1 μM OHT och hål som behandlats med 100 μM Dig bör ingå i varje testplatta (tabell 5). De efterföljande testplattorna bör utformas på samma sätt, men utan referensstandardhålen (tabell 6). Om celler från olika källor (t.ex. olika passageantal, olika partier osv.) används i samma försök bör referensstandarderna testas för varje cellkälla.

Tabell 6 Exempel på fördelning av koncentrationer av test- och kontrollkemikalierna i testplattan i ER-antagonisttest

29. Avsaknaden av kanteffekter bör bekräftas i förekommande fall, och om kanteffekter misstänks bör plattans utformning ändras för att undvika sådana effekter. Man kan till exempel använda en platta utan kanthål.

30. Efter tillsättningen av kemikalierna bör plattorna inkuberas i en 5 % CO2-inkubator vid 37 ± 1test °C i 20–24 timmar för att inducera rapportgenprodukterna.

31. Dessa föreningar bör behandlas särskilt försiktigt, eftersom de är mycket flyktiga. I sådana fall kan närliggande kontrollhål skapa falska positiva värden, och detta bör övervägas mot bakgrund av de förväntade och historiska kontrollvärdena. I de enstaka fall där flyktighet kan vara ett problem kan användning av plattförseglare bidra till att effektivt isolera individuella hål under testningen, och rekommenderas därför i dessa fall.

32. Upprepade definitiva tester av samma kemikalie bör utföras på olika dagar för att säkerställa oberoende.

Luciferastest

33. En kommersiell luciferastestreagens (t.ex. Steady-Glo® Luciferase Assay System [Promega, E2510 eller motsvarande]) eller ett standardsystem för luciferastest (t.ex. Promega, E1500 eller motsvarande) kan användas för testet så länge acceptanskriterierna är uppfyllda. Testreagenserna bör väljas beroende på sensitiviteten hos den luminometer som ska användas. Om standardsystemet för luciferastest används bör lyseringsreagens för cellodling (t.ex. Promega, E1531 eller motsvarande) användas innan substratet tillförs. Luciferasreagensen bör appliceras enligt tillverkarens anvisningar.

DATAANALYS

ER-agonisttest

34. För att få fram den relativa transkriptionella aktiviteten jämfört med den positiva kontrollen (1 nM av E2) i ER-agonisttestet kan luminiscenssignalerna från samma platta analyseras enligt följande steg (andra likvärdiga matematiska processer är också godtagbara:

Steg 1. Beräkna medelvärdet för vehikelkontrollen.

Steg 2. Subtrahera medelvärdet för vehikelkontrollen från varje hålvärde för att normalisera data.

Steg 3. Beräkna medelvärdet för den normaliserade positiva kontrollen.

Steg 4. Dividera det normaliserade värdet för varje hål i plattan med medelvärdet för den normaliserade positiva kontrollen (PC = 100 %).

Det slutliga värdet för varje hål utgör den relativa transkriptionella aktiviteten för det hålet jämfört med PC-responsen.

Steg 5. Beräkna medelvärdet för den relativa transkriptionella aktiviteten för varje koncentrationsgrupp av testkemikalien. Det finns två dimensioner av responsen: den genomsnittliga transkriptionella aktiviteten (respons) och den koncentration vid vilken responsen inträffar (se följande avsnitt).

Överväganden i fråga om induktion av EC50, PC50 och PC10

35. Det krävs en fullständig koncentrationsresponskurva för att beräkna EC50, men detta kanske inte alltid är möjligt eller praktiskt till följd av begränsningar i testkoncentrationsintervallet (till exempel på grund av problem med cytotoxicitet eller löslighet). Eftersom EC50 och högsta induktionsnivå (motsvarande toppvärdet i Hill-ekvationen) är informativa parametrar bör dessa rapporteras om så är möjligt. Lämplig statistisk programvara bör användas för beräkningen av EC50 och högsta induktionsnivå (t.ex. statistikprogramvaran Graphpad Prism). Om Hills logistiska ekvation är tillämplig på koncentrationsresponsdata bör EC50 beräknas enligt följande ekvation (7): Y = Bottom + (Top-Bottom) / (1+10 exp ((log EC50 -X) x Hill slope)), där X är koncentrationens logaritm, och Y är svaret. Y startar i botten och går upp till toppen i en S-kurva. Botten är fastställd till noll i Hills logistiska ekvation.

36. Följande uppgifter bör lämnas för varje testkemikalie: RPCMax, som är den maximala responsnivå som induceras av en testkemikalie, uttryckt som en procentenhet av den respons som 1 nM E2 inducerar på samma platta, samt PCMax (den koncentration som sammanhänger med RPCMax), och för positiva kemikalier, de koncentrationer som inducerar PC10 och, i förekommande fall, PC50.

37. PCx-värdet kan beräknas genom interpolering mellan två punkter på X-Y-koordinaten, en omedelbart över och en omedelbart under ett PCx-värde. När de datapunkter som ligger omedelbart över och under PCx-värdet har koordinaterna (a,b) respektive (c,d) kan PCx-värdet beräknas med följande ekvation: log[PCx] = log[c]+(x-d)/(d-b)

38. PC-värdena beskrivs i figur 1 nedan. Figur 1 Exempel på härledning av PC-värden PC (1 nM of E2) induceras på varje testplatta.

ER-antagonisttest

39. För att få fram den relativa transkriptionella aktiviteten (RTA) jämfört med den spikade kontrollen (25 pM av E2) i ER-antagonisttestet kan luminiscenssignalerna från samma platta analyseras enligt följande steg (andra likvärdiga matematiska processer är också godtagbara: Steg 1. Beräkna medelvärdet för vehikelkontrollen. Steg 2. Subtrahera medelvärdet för vehikelkontrollen från varje hålvärde för att normalisera data. Steg 3. Beräkna medelvärdet för den normaliserade spikade kontrollen. Steg 4. Dividera det normaliserade värdet för varje hål i plattan med medelvärdet för den normaliserade spikade kontrollen (spikad kontroll = 100 %). Det slutliga värdet för varje hål utgör den relativa transkriptionella aktiviteten för det hålet jämfört med responsen på den spikade kontrollen. Steg 5. Beräkna medelvärdet för den relativa transkriptionella aktiviteten för varje behandling.

Överväganden i fråga om induktion av IC30 och IC50

40. För positiva kemikalier bör de koncentrationer som inducerar IC30 och i förekommande fall IC50 anges.

41. ICx-värdet kan beräknas genom interpolering mellan två punkter på X-Y-koordinaten, en omedelbart över och en omedelbart under ett ICx-värde. När de datapunkter som ligger omedelbart över och under ICx-värdet har koordinaterna (c,d) respektive (a,b) kan ICx-värdet beräknas med följande ekvation: lin ICx = a-(b-(100-x)) (a-c) /(b-d) Figur 2 Exempel på hur man härleder IC-värden Den spikade kontrollen (25 pM E2) inkluderas på varje testplatta. RTA: relativ transkriptionsaktivitet.

42. Resultaten bör baseras på två (eller tre) oberoende testomgångar. Om två testomgångar ger jämförbara och därför reproducerbara resultat är det inte nödvändigt att utföra en tredje testomgång. För att vara godtagbara bör resultaten uppfylla acceptanskriterierna (se Acceptanskriterier, punkterna 14–20), vara reproducerbara.

Datatolkningskriterier

Tabell 7 Positiva och negativa beslutskriterier i ER-agonisttest

Positiv | Om ett RPCMax erhålls som motsvarar eller överskrider 10 % av responsen i den positiva kontrollen i minst två av två eller två av tre testomgångar.

Negativ | Om RPCMax inte når minst 10 % av responsen i den positiva kontrollen i två av två eller två av tre testomgångar.

Tabell 8 Positiva och negativa beslutskriterier i ER-antagonisttest

Positiv | Om IC30 beräknas i minst två av två eller två av tre testomgångar.

Negativ | Om IC30 inte kan beräknas i två av två eller två av tre testomgångar.

43. Datatolkningskriterierna anges i tabellerna 7 och 8. Positiva resultat karakteriseras av både effektens omfattning och den koncentration vid vilken effekten uppstår. Båda dessa mål uppnås genom att resultaten uttrycks som en koncentration vid vilken 50 % (PC50) eller 10 % (PC10) av PC-värdena uppnås för agonisttestet, och 50 % (IC50) eller 30 % (IC30) av värdet för den spikade kontrollen hämmas för antagonisttestet. Testkemikalien anses dock vara positiv om den maximala respons som induceras av testkemikalien (RPCMax) motsvarar eller överskrider 10 % av den positiva kontrollens respons i minst två av två eller två av tre testomgångar. Testkemikalien anses vara negativ om RPCMax inte uppnår minst 10 % av den positiva kontrollens respons i två av två eller två av tre testomgångar.

44. Beräkningarna av PC10, PC50 och PCMax i ER-agonisttestet samt IC30 och IC50 i ER-antagonisttestet kan göras med hjälp av ett kalkylblad som finns tillgängligt tillsammans med testriktlinjen på OECD:s offentliga webbplats.

45. Det bör vara tillräckligt att erhålla värden för PC10 eller PC50 respektive IC30 eller IC50 minst två gånger. Om de resulterande basvärdena för data i samma koncentrationsintervall uppvisar variationer med en oacceptabelt hög variationskoefficient (CV, %) kan data anses otillförlitliga. I så fall bör källan till den höga variationen identifieras. Variationskoefficienten av rådatan är tre gånger så hög (dvs. Luminescensintensiteten för de datapunkter som används för beräkningen av PC10 bör vara lägre än 20 %.

46. Om acceptanskriterierna uppfylls innebär detta att testsystemet fungerar korrekt, men det säkerställer inte att en viss testomgång kommer att ge korrekta data. Att upprepa resultaten från den första testomgången är det bästa sättet att försäkra sig om att korrekta data har erhållits.

47. När det gäller ER-agonisttest, som kräver mer information utöver screening- och prioriteringsändamålen för denna testriktlinje för positiva testkemikalier, särskilt PC10-PC49-kemikalier och kemikalier som misstänks överstimulera luciferas, kan bekräftelse på att den observerade luciferasaktiviteten endast är en ERα-specifik respons fås med hjälp av en ERα-antagonist (se tillägg 2.1).

TESTRAPPORT

48. Se punkt 20 i Komponenter i ER TA-testet.

LITTERATUR

1 OECD (2015). Report of the Inter-Laboratory Validation for Stably Transfected Transactivation Assay to detect Estrogenic and Anti-estrogenic Activity. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (nr 225), Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling, Paris.

2 Escande A., et al. (2006). Evaluation of Ligand Selectivity Using Reporter Cell Lines Stably Expressing Estrogen Receptor Alpha or Beta, Biochem. Pharmacol., 71, 1459–1469.

3 Kuiper G.G., et al. (1998). Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor Beta, Endocrinol., 139, 4252–4263.

4 Spaepen M., et al. (1992). Detection of Bacterial and Mycoplasma Contamination in Cell Cultures by Polymerase Chain Reaction, FEMS Microbiol. Lett., 78(1), 89–94.

5 Kobayashi H., et al. (1995). Rapid Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Cultures by Enzymatic Detection of Polymerase Chain Reaction (PCR) Products, J. Vet. Med. Sci., 57(4), 769–771.

6 Dussurget O. och Roulland-Dussoix D. (1994). Rapid, Sensitive PCR-Based Detection of Mycoplasmas in Simulated Samples of Animal Sera, Appl. Environ. Microbiol., 60(3), 953–959.

7 De Lean A., Munson P.J. och Rodbard D. (1978). Simultaneous Analysis of Families of Sigmoidal Curves: Application to Bioassay, Radioligand Assay, and Physiological Dose-Response Curves, Am. J. Physiol., 235, E97–El02.

1 JCRB Cell Bank: National Institute of Biomedical Innovation, 7-6-8 Asagi Saito, Ibaraki-shi, Osaka 567-0085, Japan, fax +81-72-641-9812.

2 http://www.oecd.org/env/testguidelines

Tillägg 2,1

FALSKT POSITIVT VÄRDE: BEDÖMNING AV EJ RECEPTORMEDIERADE LUMINESCENSSIGNALER

1. Falska positiva värden i ER-agonisttestet kan genereras av ej ER-medierad aktivering av luciferasgenen eller direkt aktivering av genprodukten eller orelaterad fluorescens. Sådana effekter visar sig genom en ofullständig eller ovanlig dosresponskurva. Om sådana effekter misstänks bör effekten av en ER-antagonist (t.ex. 4-hydroxitamoxifen (OHT) vid icke-toxisk koncentration) på responsen undersökas. Den rena antagonisten ICI 182780 är kanske inte lämplig för detta syfte eftersom en tillräcklig koncentration av ICI 182780 kan sänka VC-värdet, vilket i sin tur påverkar dataanalysen.

2. För att säkerställa att detta tillvägagångssätt är giltigt måste följande testas i samma platta: Den okända kemikaliens agonistiska aktivitet med/utan 10 μM OHT. Vehikelkontroll (i triplikat). OHT (i triplikat). 1 nM av E2 (i triplikat) som agonistisk positiv kontroll. 1 nM av E2 + OHT (i triplikat).

Datatolkningskriterier

Anmärkning: Samtliga hål bör behandlas med samma koncentration av vehikeln.

Om den okända kemikaliens agonistiska aktivitet INTE påverkas av behandlingen med ER-antagonisten klassificeras den som negativ.

I fall där den okända kemikaliens agonistiska aktivitet hämmas fullständigt ska beslutskriterierna tillämpas.

Om den agonistiska aktiviteten vid den lägsta koncentrationen motsvarar eller överskrider PC10-responsen hämmas den okända kemikalien i en grad som motsvarar eller överskrider PC10-responsen. Skillnaden i respons mellan de hål som inte har behandlats och de hål som har behandlats med ER-antagonisten beräknas. Denna skillnad bör anses motsvara den verkliga responsen och bör användas för beräkningen av lämpliga parametrar som underlag för ett klassificeringsbeslut.

Dataanalys

Kontrollera prestandastandarden.

Kontrollera variationskoefficienten mellan hål som behandlats under samma förhållanden.

1 Beräkna variationskoefficientens medelvärde.

2 Subtrahera variationskoefficientens medelvärde från värdet för varje hål som inte har behandlats med OHT.

3 Beräkna medelvärdet för OHT.

4 Subtrahera variationskoefficientens medelvärde från värdet för varje hål som har behandlats med OHT.

5 Beräkna den positiva kontrollens medelvärde.

6 Beräkna den relativa transkriptionella aktiviteten för alla andra hål i förhållandet till den positiva kontrollen.

Tillägg 2,2

BEREDNING AV SERUM BEHANDLAT MED DEXTRANBELAGT TRÄKOL (DCC)

1. Behandling av serum med dextranbelagt träkol (DCC) är en generell metod för att eliminera östrogenföreningar från serum som tillförs cellmedier. Syftet är att utesluta missvisande respons som är förknippad med östrogenrester i serumet. 500 ml fetalt bovinserum (FBS) kan behandlas genom detta förfarande.

Komponenter

2. Följande material och utrustning kommer att behövas:

Material

Aktivt träkol.

Dextran.

Magnesiumkloridhexahydrat (MgCl2·6H2O).

Sackaros.

1 M HEPES buffertlösning (pH 7.4).

Ultrarent vatten som producerats från ett filtersystem.

Utrustning

Autoklaverad glasbehållare (av lämplig storlek), en vanlig laboratoriecentrifug (som kan hålla en temperatur på 4 oC).

Förfarande

3. Följande förfarande har anpassats till användning av 50 ml centrifugprovrör: [Dag-1] Bered en suspension av dextranbelagt träkol med 1 liter ultrarent vatten som innehåller 1,5 mM MgCl2, 0,25 M sackaros, 2,5 g träkol, 0,25 g dextran och 5 mM HEPES, och rör om vid 4 oC över natten. [Dag-2] Fördela suspensionen i 50 ml centrifugprovrör och centrifugera vid 10000 rpm vid 4 oC i 10 minuter. Avlägsna supernatanten och lagra hälften av träkolssedimentet vid 4 oC för användning på dag-3. Suspendera den andra hälften av träkolet med FBS som har tinats något för att undvika fällning och värmeinaktiverats vid 56 oC i 30 minuter, överför sedan träkolet till en autoklaverad glasbehållare, t.ex. en E-kolv. Låt suspensionen stå under omrörning vid 4 oC över natten. [Dag-3] Fördela suspensionen med FBS i centrifugprovrör för centrifugering vid 10000 rpm vid 4 oC i 10 minuter. Samla in FBS och överför det till det nya träkolssediment som bereddes och lagrades på dag-2. Suspendera träkolssedimentet och låt suspensionen stå under försiktig omrörning i en autoklaverad glasbehållare vid 4 oC över natten. [Dag-4] Fördela suspensionen för centrifugering vid 10000 rpm vid 4 oC i 10 minuter och sterilisera supernatanten genom att filtrera den genom ett 0,2 μm sterilt filter. Denna DCC-behandlade FBS bör lagras vid -20 oC och kan användas i upp till ett år.

Tillägg 3

TESTMETOD MED TRANSAKTIVERING AV ÖSTROGENRECEPTORN VM7LUC FÖR IDENTIFIERING AV ÖSTROGENRECEPTORERS AGONISTER OCH ANTAGONISTER

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR (SE ÄVEN ALLMÄN INLEDNING)

1. Denna testmetod använder cellinjen VM7Luc4E2. Den har validerats av National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM) och Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) (1). VM7Luc-cellinjerna uttrycker framför allt endogena ERα och en mindre mängd endogent ERβ (2) (3) (4).

2. Denna metod är tillämplig på många olika ämnen, förutsatt att de är lösliga i dimetylsulfoxid (DMSO, CAS-nr 67-68-5), inte reagerar med DMSO eller cellodlingsmediet och inte är cytotoxiska vid de testade koncentrationerna. Om det inte är möjligt att använda DMSO kan en annan vehikel, såsom etanol eller vatten, användas i stället (se punkt 12). Den demonstrerade prestandan hos (ant)agonistmetoden VM7Luc ER TA tyder på att testet kan ge information om ER-medierade verkningssätt och att det kan övervägas i samband med prioritering av ämnen för ytterligare testning

3. Denna metod är särskilt utformad för att detektera hERα- och hERß-medierad transaktivering genom att mäta kemiluminiscens som endpoint. Det är vanligt att kemiluminiscens används i biologiska tester, eftersom luminiscens har ett högt signal-brusförhållande. Firefly-luciferasaktiviteten i cellbaserade tester kan dock förväxlas med ämnen som hämmar luciferasenzymet, vilket orsakar både en uppenbar inhibering eller ökad luminiscens på grund av proteinstabilisering. I vissa luciferasbaserade tester med ER-rapportgener har dessutom ej receptormedierade luminiscenssignaler rapporterats vid fytoöstrogena koncentrationer högre än 1 μM till följd av överaktivering av luciferasrapportgenen(9) (11). Dosresponskurvan visar att den faktiska aktiveringen av östrogenreceptorsystemet inträffar vid lägre koncentrationer, men det luciferasuttryck som erhålls vid höga koncentrationer av fytoöstrogener eller liknande föreningar som misstänks producera fytoöstrogenlik överaktivering av luciferasrapportgenen, måste undersökas noggrant i stabilt transfekterade ER TA-testsystem.

4. Avsnitten Allmän inledning och Komponenter i ER TA-testet bör läsas innan denna testmetod används för lagstadgade ändamål. Definitioner och förkortningar som används i denna testmetod beskrivs i tillägg 1.

PRINCIPER FÖR METODEN(SE ÄVEN ALLMÄN INLEDNING)

5. Metoden används för att indikera ligandbindning till östrogenreceptorer, följt av translokering av receptorligandkomplexet till kärnan. I kärnan binds receptor–ligand-komplexet till specifika DNA-responselement och transaktiverar rapportgenen (luc). Då produceras luciferas som sedan släpper ut ljus som kan kvantifieras med en luminometer. Luciferasaktivitet kan utvärderas snabbt och till låg kostnad med ett antal kommersiellt tillgängliga kit. VM7Luc ER TA använder VM7, en adenokarcinom cellinje från mänskligt bröst som är mottaglig för östrogenreceptorer, och har transfekterats stabilt med en firefly-luc-rapportgen under kontroll av fyra östrogenresponselement som har placerats uppströms från musens MMTV-promotor för att detektera ämnen med agonistisk eller antagonistisk aktivitet in vitro i östrogenreceptorerna. Denna MMTV-promotor uppvisar endast smärre korsreaktivitet med andra steroida och icke-steroida hormoner (8). Datatolkningskriterierna beskrivs i detalj i punkt 41. Kortfattat identifieras positiv respons genom en koncentrationsresponskurva vid minst tre punkter, utan överlappande felstaplar (medelvärde ± SD), samt en förändring i omfånget (normaliserad relativ ljusenhet [normalised relative light unit RLU]) på minst 20 % av det maximala värdet för referensstandarden (17β-östradiol [E2; CAS-nr 50-28-2] för agonisttestet, raloxifen HCl [Ral, CAS-nr 84449-90-1]/E2 för antagonisttestet).

FÖRFARANDE

Cellinje

6. Den stabilt transfekterade cellinjen VM7Luc4E2 bör användas i testet. Cellinjen finns för närvarande endast tillgänglig med ett tekniskt licensavtal från University of California, Davis, Kalifornien, USA och från Xenobiotic Detection Systems Inc., Durham, North Carolina USA.

Cellinjens stabilitet

7. För att bibehålla cellinjens stabilitet och integritet bör cellerna odlas mer än en passage från den frysta stammen i cellunderhållsmediet (se punkt 9). Cellerna bör inte odlas mer än 30 passager. För cellinjen VM7Luc4E2 cell line tar 30 passager omkring tre månader.

Betingelser för cellodling och överföring till platta

8. De rutiner som anges i vägledningen om god praxis för cellodling (5) (6) bör följas för att säkerställa kvalitet hos alla material och metoder och på så sätt bibehålla arbetets integritet, giltighet och reproducerbarhet.

9. VM7Luc4E2-cellerna förvaras i ett RPMI 1640-medium kompletterat med 0,9 % Pen-Strep och 8,0 % fetalt bovinserum (FBS) i en särskild vävnadsodlingsinkubator vid 37 ± 1 °C, 90 % ± 5 % luftfuktighet och 5,0 % ± 1 % CO2/luft.

10. När VM7Luc4E2-cellerna når ~80 % konfluens subkultiveras och konditioneras de till en östrogenfri miljö i 48 timmar innan cellerna överförs till 96-hålsplattor för exponering för testkemikalierna och analys av östrogenberoende induktion av luciferasaktivitet. Det östrogenfria mediet (EFM) innehåller Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium (DMEM) utan fenolrött, kompletterat med 4,5 % träkols-/dextranbehandlat fetalt bovinserum (FBS), 1,9 % L-glutamin och 0,9 % Pen-Strep. Alla plastvaror bör vara fria från östrogenaktivitet [se detaljerat protokoll (7)].

Acceptanskriterier

11. Godkännandet eller förkastandet av ett test baseras på en utvärdering av referensstandarden och kontrollresultaten från varje försök, som utförts på en 96-hålsplatta. Varje referensstandard testas i flera koncentrationer och det ska finnas flera prov av varje referens- och kontrollkoncentration. Resultaten jämförs med kvalitetskontrollerna för dessa parametrar som härletts från de historiska databaser över agonistisk och antagonistisk aktivitet som varje laboratorium skapar när de visar sin kompetens. De historiska databaserna uppdateras kontinuerligt med värden för referensstandarden och kontrollerna. Ändringar i utrustning eller laboratorieförhållanden kan göra det nödvändigt att uppdatera de historiska databaserna.

Agonisttest

Förberedande test för att bestämma koncentrationsintervall

Induktion: Plattornas induktion bör mätas genom att den genomsnittligt högsta E2-referensstandardens RLU-värde jämförs med det genomsnittliga RLU-värdet för DMSO-kontrollen. Femfaldig induktion uppnås vanligen, men för att godtas måste induktionen vara minst fyrfaldig.

DMSO-kontrollresultat: Lösningsmedelskontrollens RLU-värden bör hålla sig inom 2,5 gånger standardavvikelsen för den historiska lösningskontrollens RLU-medelvärde.

Försök som inte uppfyller ett av dessa acceptanskriterier bör förkastas och upprepas.

Fullständigt test

Det fullständiga testet innefattar acceptanskriterier för det förberedande agonisttestet samt följande:

Resultat för referensstandarden: E2-referensstandardens koncentrationsresponskurva bör vara S-formad och uppvisa minst tre värden inom den linjära delen av koncentrationsresponskurvan.

Resultat för positiva kontroller: Metoxiklorkontrollens RLU-värden bör vara högre än DMSO-medelvärdet, plus tre gånger standardavvikelsen från DMSO-medelvärdet.

Försök som inte uppfyller ett av acceptanskriterierna bör förkastas och upprepas.

Antagonisttest

Förberedande test

Reduktion: Plattornas reduktion mäts genom att den genomsnittligt högsta Ral/E2-referensstandardens RLU-värde jämförs med det genomsnittliga RLU-värdet för DMSO-kontrollen. Femfaldig reduktion uppnås vanligen, men för att godtas måste reduktionen vara minst trefaldig.

E2-kontrollresultat. E2-kontrollens RLU-värden bör hålla sig inom 2,5 gånger standardavvikelsen för den historiska E2-kontrollens RLU-medelvärde.

DMSO-kontrollresultat: DMSO-kontrollens RLU-värden bör hålla sig inom 2,5 gånger standardavvikelsen för den historiska lösningsmedelskontrollens RLU-medelvärde.

Försök som inte uppfyller ett av acceptanskriterierna förkastas och upprepas.

Fullständigt test

Det fullständiga testet innefattar acceptanskriterier för det förberedande antagonisttestet samt följande:

Resultat för referensstandarden: Ral/E2-referensstandardens koncentrationsresponskurva bör vara S-formad och uppvisa minst tre värden inom den linjära delen av koncentrationsresponskurvan.

Resultat för positiva kontroller: RLU-värdena för tamoxifen-/E2-kontrollen bör vara lägre än E2-kontrollens medelvärde minus tre gånger standardavvikelsen från E2-kontrollens medelvärde.

Försök som inte uppfyller ett av acceptanskriterierna förkastas och upprepas.

Referensstandarder, positiva kontroller och vehikelkontroller

Vehikelkontroll (agonist- och antagonisttest)

12. Den vehikel som används för att lösa upp testkemikalierna bör testas som vehikelkontroll. Den vehikel som användes under valideringen av VM7Luc ER TA-testet var 1 % (v/v) dimetylsulfoxid (DMSO, CAS-nr 67-68-5) (se punkt 24). Om en annan vehikel än DMSO används bör alla referensstandarder, kontroller och testkemikalier i förekommande fall testas i samma vehikel.

Referensstandard (förberedande agonisttest)

13. Referensstandarden är E2 (CAS-nr 50-28-2). För det förberedande testet består referensstandarden av en seriespädning med fyra koncentrationer av E2 (1,84 x 10-10, 4,59 x 10-11, 1,15 x 10-11 och 2,87 x 10-12 M), och varje koncentration testas i duplikathål.

Referensstandard (fullständigt agonisttest)

14. E2 för fullständig testning består av en seriespädning på 1:2 med elva koncentrationer (från 3,67 x 10-10 till 3,59 x 10-13 M) E2 i duplikathål.

Referensstandard (förberedande antagonisttest)

15. Referensstandarden är en kombination av Ral (CAS-nr 84449-90-1) och E2 (CAS-nr 50-28-2). Ral/E2 för förberedande testning består av en seriespädning med tre koncentrationer av Ral (3,06 x 10-9, 7,67 x 10-10 och 1,92 x 10-10M), plus en fast koncentration (9,18 × 10-11 M) av E2 i duplikathål.

Referensstandard (fullständigt antagonisttest)

16. Ral/E2 för fullständig testning består av en seriespädning på 1:2 Ral (från 2,45x 10-8 till 9,57 x 10-11M), plus en fast koncentration (9,18 × 10-11 M) av E2 bestående av nio koncentrationer av Ral/E2 i duplikathål.

Svag positiv kontroll (agonist)

17. Den svaga positiva kontrollen är 9,06 x 10-6 M p,p’-metoxiklor (metoxiklor, CAS-nr 72-43-5) i EFM).

Svag positiv kontroll (antagonist)

18. Den svaga positiva kontrollen består av tamoxifen (CAS-nr 10540-29-1) 3.36 x 10-6 M med 9,18 × 10-11 M E2 i EFM.

E2-kontroll (endast antagonisttest)

19. E2-kontrollerna är 9,18 × 10-11 M E2 i EFM och används som en referens för negativ kontroll.

Induktionsförhållande (agonist)

20. Induktionen av referensstandardens (E2) luciferasaktivitet mäts genom att E2-referensstandardens högsta genomsnittliga RLU-värde divideras med DMSO-kontrollens genomsnittliga RLU-värde, och resultatet bör inte vara högre än fyrfaldigt.

Induktionsreduktion (antagonist)

21. Medelvärdet för referensstandardens (Ral/E2) luciferasaktivitet mäts genom att Ral/E2-referensstandardens högsta genomsnittliga RLU-värde divideras med DMSO-kontrollens genomsnittliga RLU-värde, och bör inte vara högre än trefaldigt. Demonstration av laboratoriets kompetens (se punkt 14 och tabellerna 3 och 4 i Komponenter i ER TA-testet i denna testmetod).

Vehikel

22. Testkemikalierna bör lösas upp i ett lämpligt lösningsmedel som är blandbart med cellmediet. Vatten, etanol (renhetsgrad 95 % till 100 %) och DMSO är lämpliga vehiklar. Om DMSO används bör nivån inte överskrida 1 % (v/v). För alla vehiklar ska det visas att den maximala volym som används inte är cytotoxisk och inte har en störande verkan på genomförandet av testet. Referensstandarderna och kontrollerna löses upp i 100 % lösningsmedel och späds därefter ned till lämpliga koncentrationer i EFM.

Beredning av testkemikalierna

23. Testkemikalierna löses upp i 100 % DMSO (eller lämpligt lösningsmedel) och späds därefter ned till lämpliga koncentrationer i EFM. Alla testkemikalier bör få anta rumstemperatur innan de löses upp och späds ut. Nya testkemikalielösningar bör beredas för varje försök. Lösningarna bör inte ha märkbara fällningar eller grumlighet. Referensstandarden och kontrollstammarna kan beredas i bulk. Nya beredningar av den slutliga referensstandarden, kontrollutspädningarna och testkemikalierna bör dock göras för varje försök och användas inom 24 timmar från beredningen.

Löslighet och cytotoxicitet: överväganden för koncentrationsintervalltest

24. Det förberedande testet består av sju-punkts 1:10 seriespädningar som körs i duplikat. Först testas testkemikalierna upp till den högsta koncentrationen på 1 mg/ml (~1 mM) för agonisttestet och 20 μg/ml (~10 μM) för antagonisttestet. Förberedande test används för att fastställa följande:

Startkoncentrationer för testkemikalierna som ska användas under den fullständiga testningen

Kemiska utspädningar för testkemikalierna (1:2 eller 1:5) som ska användas under den fullständiga testningen

25. En bedömning av cellviabilitet/cytotoxicitet ingår i protokollen för agonist- och antagonisttesterna (7) och integreras i de förberedande och fullständiga testerna. Den cytotoxicitetsmetod som användes för att bedöma cellviabilitet under valideringen av VM7Luc ER TA (1) var en skalad kvalitativ visuell observationsmetod. Det är dock även möjligt att använda en kvantitativ metod för att fastställa cytotoxicitet (se protokollet (7)). Data från testkemikaliekoncentrationer som orsakar mer än 20 % reduktion av viabiliteten kan inte användas.

Testkemikaliens exponering och beredning av testplattor

26. Cellerna räknas och överförs till 96-hålsplattor för vävnadsodling (2 x 105 celler per hål) i EFM och inkuberas i 24 timmar så att cellerna fäster vid plattan. EFM avlägsnas och ersätts med test- och referenskemikalierna i EFM och inkuberas i 19–24 timmar. Det är viktigt att vara särskilt försiktig med mycket flyktiga ämnen, eftersom närliggande kontrollhål kan skapa falska positiva resultat. I sådana fall kan användning av plattförseglare bidra till att effektivt isolera individuella hål under testningen, och rekommenderas därför i dessa fall.

Förberedande tester för att bestämma koncentrationsintervall

27. Vid den förberedande testningen används alla hål i 96-hålsplattan för att testa kemikalier som sju-punkts 1:10 seriespädningar i duplikat (se figurerna 1 och 2).

I den förberedande testningen av agonister används fyra koncentrationer av E2 i duplikat som referensstandard och fyra replikathål för DMSO-kontrollen.

I den förberedande testningen av antagonister används tre koncentrationer av Ral/E2 med 9,18 × 10-11 M E2 i duplikat som referensstandard, med tre replikathål för E2- och DMSO-kontrollerna.

Figur 1 Utformning av förberedande agonisttest med 96-hålsplatta

Förkortningar: E2-1 till E2-4 = koncentrationer av referensstandarden E2 (från hög till låg). TC1-1 till TC1-7 = koncentrationer (från hög till låg) av testkemikalie 1 (TC1). TC2-1 till TC2-7 = koncentrationer (från hög till låg) av testkemikalie 2 (TC2). TC3-1 till TC3-7 = koncentrationer (från hög till låg) av testkemikalie 3 (TC3). TC4-1 till TC4-7 = koncentrationer (från hög till låg) av testkemikalie 4 (TC4). TC5-1 till TC5-7 = koncentrationer (från hög till låg) av testkemikalie 5 (TC5). TC6-1 till TC6-7 = koncentrationer (från hög till låg) av testkemikalie 6 (TC6). VC = vehikelkontroll (DMSO [1 % v/v EFM.]).

Figur 2 Utformning av förberedande antagonisttest med 96-hålsplatta

Förkortningar: E2 = E2-kontroll. Ral-1 till Ral-3 = koncentrationer av referensstandarden raloxifen/E2 (från hög till låg). TC1-1 till TC1-7 = koncentrationer (från hög till låg) av testkemikalie 1 (TC1). TC2-1 till TC2-7 = koncentrationer (från hög till låg) av testkemikalie 2 (TC2). TC3-1 till TC3-7 = koncentrationer (från hög till låg) av testkemikalie 3 (TC3). TC4-1 till TC4-7 = koncentrationer (från hög till låg) av testkemikalie 4 (TC4). TC5-1 till TC5-7 = koncentrationer (från hög till låg) av testkemikalie 5 (TC5). TC6-1 till TC6-7 = koncentrationer (från hög till låg) av testkemikalie 6 (TC6). VC = vehikelkontroll (DMSO [1 % v/v EFM.]).

Anmärkning: Alla testkemikalier testas i närvaro av 9,18 × 10-11 M E2.

28. Den rekommenderade slutliga volymen av medium som behövs för varje brunn är 200 μl. Använd endast testplattor där cellerna i alla hål ger en viabilitet på minst 80 %.

29. Fastställande av startkoncentrationer för fullständig agonist-testning beskrivs i detalj i agonistprotokollet (7). Kortfattat används följande kriterier:

Om det inte finns några punkter på testkemikaliens kurva som är högre än medelvärdet plus tre gånger standardavvikelsen för DMSO-kontrollen görs ett fullständigt test med användning av elva-punkts 1:2 seriespädning, med den maximala lösliga koncentrationen som utgångspunkt.

Om det inte finns några punkter på testkemikaliens kurva som är högre än medelvärdet plus tre gånger standardavvikelsen för DMSO-kontrollen bör den startkoncentration som används för elva-punkts spädningsschemat i fullständig testning vara en log högre än den koncentration som ger det högsta justerade RLU-värdet i det förberedande koncentrationsintervalltestet. Elva-punktsschemat baseras antingen på en 1:2- eller 1:5-spädning enligt följande kriterier:

Om testkemikalien uppvisar en bifasisk koncentrationsresponskurva i det förberedande testet bör båda faserna även upplösas i den fullständiga testningen.

30. Fastställande av startkoncentrationer för fullständig antagonist-testning beskrivs i detalj i antagonistprotokollet (7). Kortfattat används följande kriterier:

Om det inte finns några punkter på testkemikaliens koncentrationskurva som är lägre än medelvärdet minus tre gånger standardavvikelsen för E2-kontrollen görs ett fullständigt test med användning av elva-punkts 1:2 seriespädning, med den maximala lösliga koncentrationen som utgångspunkt.

Om det inte finns några punkter på testkemikaliens kurva som är lägre än medelvärdet minus tre gånger standardavvikelsen för E2-kontrollen bör den startkoncentration som används för elva-punkts spädningsschemat i fullständig testning vara en av följande:

Elva-punktsschemat baseras antingen på en 1:2- eller 1:5-spädning enligt följande kriterier:

Fullständiga tester

31. Det fullständiga testet består av elva-punkts seriespädningar (antingen 1:2- eller 1:5-seriespädningar baserat på startkoncentrationen för kriterierna för fullständig testning), där varje koncentration testas i tre hål i 96-hålsplattan (se figurerna 3 och 4).

I den fullständiga testningen av agonister används elva koncentrationer av E2 i duplikat som referensstandard. Fyra replikathål för DMSO-kontrollen och fyra replikathål för metoxiklorkontrollen (9,06 x 10-6 M) finns med i varje platta.

I den fullständiga testningen av antagonister används nio koncentrationer av Ral/E2 med 9,18 × 10-11 M E2 i duplikat som referensstandard, med fyra replikathål för E2-kontrollen med 9,18 x 10-11 M, fyra replikathål för DMSO-kontroller och fyra replikathål för tamoxifen 3,36 x 10-6M.

Figur 3 Utformning av fullständigt test av agonister med en 96-hålsplatta

Förkortningar: TC1-1 till TC1-11 = koncentrationer (från hög till låg) av testkemikalie 1. TC2-1 till TC2-11 = koncentrationer (från hög till låg) av testkemikalie 2. E2-1 till E2-11 = koncentrationer av referensstandarden E2 (från hög till låg). Meth = p,p’-metoxiklor, svag positiv kontroll. VC = DMSO (1 % v/v) EFM vehikelkontroll.

Figur 4 Utformning av fullständigt test av antagonister med en 96-hålsplatta

Förkortningar: E2 = E2-kontroll. Ral-1 till Ral-9 = koncentrationer av referensstandarden raloxifen/E2 (från hög till låg). Tam = tamoxifen/E2, svag positiv kontroll. TC1-1 till TC1-11 = koncentrationer (från hög till låg) av testkemikalie 1 (TC1). TC2-1 till TC2-11 = koncentrationer (från hög till låg) av testkemikalie 2 (TC2). VC = vehikelkontroll (DMSO [1 % v/v EFM.]).

Anmärkning: Såsom har påpekats innehåller alla referens- och testhål en fast koncentration av E2 (9,18 x 10-11M).

32. Upprepade fullständiga tester av samma kemikalie bör utföras på olika dagar för att säkerställa oberoende. Minst två fullständiga tester bör utföras. Om testresultaten motsäger varandra (t.ex. om ett test är positivt och det andra negativt) eller om ett av testerna är olämpligt bör ett ytterligare tredje test utföras.

Mätning av luminescens

33. Luminescens mäts i intervallet 300 till 650 nm med användning av en injektionsluminometer och programvara som kontrollerar injiceringsvolymen och mätintervallet (7). Ljusemissionen från varje hål uttrycks som RLU per hål.

DATAANALYS

Bestämning av EC50 /IC50

34. EC50-värdet (halva den maximala effektiva koncentrationen av testkemikalien [agonister]) och IC50-värdet (halva den maximala hämmande koncentrationen av testkemikalien [antagonister]) fastställs utifrån koncentrationsresponsdata. För testkemikalier som är positiva vid en eller flera koncentrationer beräknas den koncentration av testkemikalien som orsakar halva den maximala responsen (IC50 eller EC50) med hjälp av en Hillfunktionsanalys eller ett lämpligt alternativ. Hillfunktionen är en logistisk matematisk modell med fyra parametrar som kopplar testkemikaliekoncentrationen till responsen (som vanligen följer en S-kurva), med användning av nedanstående ekvation:

Y Bottom Top Bottom 1 10 lgEC 50 XHill Slope

Där

Modellen beräknar den bästa passningen för parametrarna Top, Bottom, Hillslope samt IC50 och EC50. Lämplig statistisk programvara bör användas för beräkningen av värdena för EC50 och IC50 (t.ex. den statistiska programvaran Graphpad PrismR).

Bestämning av avvikande värden (outliers)

35. En god statistisk bedömning kan underlättas genom att inbegripa (men inte begränsat till) Q-testet (se agonist- och antagonistprotokollen (7)) för att bestämma oanvändbara hål som utesluts från dataanalysen.

36. För replikat av E2-referensstandarden (två per koncentration) betraktas alla justerade RLU-värden för ett replikat vid en given E2-koncentration som avvikande värden om dess värde ligger mer än 20 % över eller under det justerade RLU-värdet för den koncentrationen i den historiska databasen.

Insamling och justering av luminometerdata för förberedande koncentrationsintervalltestning

37. Rådata från luminometern bör överföras till en kalkylbladsmall som har utformats för testet. Det bör bestämmas om det finns datapunkter som visar avvikande värden som måste tas bort. (Se testacceptanskriterier för de parametrar som fastställs i analyserna.) Följande beräkningar bör göras:

Agonist

Antagonist

Insamling och justering av luminometerdata för fullständig testning

38. Rådata från luminometern bör överföras till en kalkylbladsmall som har utformats för testet. Det bör bestämmas om det finns datapunkter som visar avvikande värden som måste tas bort. (Se testacceptanskriterier för de parametrar som fastställs i analyserna.) Följande beräkningar görs:

Agonist

Antagonist

Datatolkningskriterier

39. VM7Luc ER TA är avsett att ingå i en sammanvägd bedömning för att underlätta prioritering av ämnen för ED-testning in vivo. Ett led i detta prioriteringsförfarande är att klassificera testkemikalien som positiv eller negativ för antingen ER-agonistisk eller ER-antagonistisk aktivitet. De positiva och negativa beslutskriterier som används i valideringsstudien för VM7Luc ER TA beskrivs i tabell 1.

Tabell 1 Positiva och negativa beslutskriterier

AGONISTISK AKTIVITET

Positiv | Alla testkemikalier som har klassificerats som positiva för ER-agonistisk aktivitet bör ha en koncentrationsresponskurva som består av en baslinje som följs av en positiv lutning och avslutas i en platå eller topp. I vissa fall är det endast möjligt att fastställa två av dessa egenskaper (baslinje–lutning eller lutning–topp). Den linje som anger den positiva lutningen bör innehålla minst tre punkter med ej överlappande felstaplar (medelvärde ± SD). De punkter som formar baslinjen utesluts, men den linjära delen av kurvan kan omfatta toppen eller den första punkten i platån. En positiv klassificering kräver en responsamplitud, skillnaden mellan baslinje och topp, på minst 20 % av det maximala värdet för referensstandarden E2 (dvs. 2000 RLU eller mer när referensstandardernas [E2] värde justeras upp till 10000 RLU). Om möjligt bör ett EC50-värde beräknas för varje positiv testkemikalie.

Negativ | Det genomsnittliga justerade RLU för en given koncentration motsvarar eller är lägre än RLU-medelvärdet för DMSO-kontrollen plus tre gånger standardavvikelsen för DMSO:s RLU.

Otillräcklig | Data som inte kan tolkas som att de visar närvaro eller avsaknad av aktivitet på grund av betydande kvalitativa eller kvantitativa begränsningar anses vara olämpliga, och kan inte användas för att fastställa om testkemikalien är positiv eller negativ. Kemikalierna bör omtestas.

ANTAGONISTISK AKTIVITET

Positiv | Testkemikaliens data skapar en koncentrationsresponskurva som består av en baslinje, följd av en negativ lutning. Den linje som anger den negativa lutningen bör innehålla minst tre punkter med ej överlappande felstaplar. De punkter som formar baslinjen utesluts, men den linjära delen av kurvan kan omfatta den första punkten i platån. Det bör finnas en reduktion på minst 20 % av aktiviteten jämfört med det maximala värdet för referensstandarden Ral/E2 (dvs. 8000 RLU eller mindre när det maximala värdet för referensstandarden [Ral/E2] justeras till 10000 RLU). Testkemikaliens högsta icke-cytotoxiska koncentrationer bör vara lägre än eller motsvarande 1 x 10-5 M. Om möjligt bör ett IC50-värde beräknas för varje positiv testkemikalie.

Negativ | Alla datapunkter över EC80-värdet (80 % av E2-responsen, eller 8000 RLU), vid koncentrationer lägre än 1,0 x 10-5 M.

40. Positiva resultat karakteriseras av både effektens omfattning och om så är möjligt den koncentration vid vilken effekten uppstår. Exempel på positiva, negativa och otillräckliga data visas i figurerna 5 och 6.

Figur 5 Exempel på agonister Positiva, negativa och otillräckliga data

Den streckade linjen anger 20 % av E2-responsen, 2000 justerade och normaliserade RLU.

Figur 6 Exempel på antagonister Positiva, negativa och otillräckliga data

Den streckade linjen anger 80 % av Ral/E2-responsen, 8000 justerade och normaliserade RLU.

Den heldragna linjen anger 1,00 x 10-5 M. För att en respons ska anses vara positiv bör den ligga under 8000 RLU-linjen och vid koncentrationer lägre än 1,00 x 10-5M.

Koncentrationer märkta med en asterisk i meso-hexestroldiagrammet anger viabilitetspoäng på 2 eller högre.

Testresultaten för meso-hexestrol anses utgöra olämpliga data, eftersom den enda responsen under 8000 RLU förekommer vid 1,00 x 10-5M.

41. Beräkningarna av EC50 och IC50 kan göras med hjälp av en Hillfunktion med fyra parametrar (se agonist- och antagonistprotokollen för närmare uppgifter (7)). Om acceptanskriterierna uppfylls innebär detta att systemet fungerar korrekt, men det säkerställer inte att en viss testomgång kommer att ge korrekta data. Att upprepa resultaten från den första testomgången är det bästa sättet att försäkra sig om att korrekta data har erhållits (se punkt19 i Komponenter i ER TA-testet).

TESTRAPPORT

42. Se punkt 20 i Komponenter i ER TA-testet.

LITTERATUR

1 ICCVAM (2011). ICCVAM Test Method Evaluation Report on the LUMI-CELL® ER (BG1Luc ER TA) Test Method: An In Vitro Method for Identifying ER Agonists and Antagonists, National Institute of Environmental Health Sciences: Research Triangle Park, NC.

2 Monje P., Boland R. (2001). Subcellular Distribution of Native Estrogen Receptor α and β Isoforms in Rabbit Uterus and Ovary, J. Cell Biochem., 82(3): 467-479.

3 Pujol P., et al. (1998). Differential Expression of Estrogen Receptor-Alpha and -Beta Messenger RNAs as a Potential Marker of Ovarian Carcinogenesis, Cancer Res., 58(23): 5367-5373.

4 Weihua Z., et al. (2000). Estrogen Receptor (ER) β, a Modulator of ERα in the Uterus, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97(11): 936-5941.

5 Balls M., et al. (2006). The Importance of Good Cell Culture Practice (GCCP), ALTEX, 23 (Suppl): s. 270-273.

6 Coecke S., et al. (2005). Guidance on Good Cell Culture Practice: a Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, Alternatives to Laboratory Animals, 33: s. 261-287.

7 ICCVAM (2011). ICCVAM Test Method Evaluation Report, The LUMI-CELL® ER (BG1Luc ER TA) Test Method: An In Vitro Assay for Identifying Human Estrogen Receptor Agonist and Antagonist Activity of Chemicals, NIH Publication nr 11–7850.

8 Rogers J.M., Denison M.S. (2000). Recombinant Cell Bioassays for Endocrine Disruptors: Development of a Stably Transfected Human Ovarian Cell Line for the Detection of Estrogenic and Anti-Estrogenic Chemicals, In Vitro Mol. Toxicol.,13(1):67–82.

9 Escande A., et al. (2006). Evaluation of Ligand Selectivity Using Reporter Cell Lines Stably Expressing Estrogen Receptor Alpha or Beta, Biochem. Pharmacol., 71(10):1459–1469.

10 Thorne N., Inglese J., Auld D.S. (2010). Illuminating Insights into Firefly Luciferase and Other Bioluminescent Reporters Used in Chemical Biology, Chemistry and Biology,17(6): 646–657.

11 Kuiper G.G., et al. (1998). Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor Beta, Endocrinology,139(10):4252–4263.

12 Geisinger, et al.(1989). Characterization of a human ovarian carcinoma cell line with estrogen and progesterone receptors, Cancer 63, 280–288.

13 Baldwin, et.al. (1998). BG-1 ovarian cell line: an alternative model for examining estrogen-dependent growth in vitro, In Vitro Cell. Dev. Biol. – Animal, 34, 649–654.

14 Li, Y., et al. (2014). Research resource: STR DNA profile and gene expression comparisons of human BG-1 cells and a BG-1/MCF-7 clonal variant, Mol. Endo. 28, s. 2072–2081.

15 Rogers, J.M. och Denison, M.S. (2000). Recombinant cell bioassays for endocrine disruptors:development of a stably transfected human ovarian cell line for the detection of estrogenicand anti-estrogenic chemicals, In Vitro & Molec. Toxicol. 13, s. 67-82.

1 Före juni 2016 betecknades denna cellinje som BG1Luc. BG-1-cellerna beskrevs först av Geisinger et al. (1998) (12), och karakteriserades senare av forskare vid National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) (13). Relativt nyligen upptäckte man att det finns två olika varianter av BG-1-celler som används av forskare, BG-1 Fr och BG-1 NIEHS. En djupgående analys, inklusive DNA-testning, av dessa två varianter av cellinjen BG-1, som utfördes av Li och medarbetare (2014) (14), visade att BG-1 Fr är unik och att BG-1 NIEHS, dvs. den cellinje som ursprungligen användes för att utveckla metoden, inte är cellinjen BG1 från human äggstockscancer, utan i stället är en variant av cellinjen MCF7 från human bröstcance. Den cellinje som används i testet, som ursprungligen benämndes BG1Luc4E2 (15), kommer nu att betecknas som VM7Luc4E2 (V = variant, M7 = MCF7-celler). Analysen kommer nu att betecknas VM7Luc ER TA. Detta innebär visserligen ett ändrat ursprung för den cellinje som metoden bygger på, men det påverkar inte publicerade valideringsstudier eller nyttan med och tillämpningen av denna analys för screening av östrogena/antiöstrogena kemikalier.

2 Michael S. Denison, Ph.D. Professor, Dept. of Environmental Toxicology, 4241 Meyer Hall, One Shields Ave, University of California, Davis, CA 95616, E: msdenison@ucdavis.edu, (530) 754-8649

3 Xenobiotic Detection Systems Inc. 1601 East Geer Street, Suite S, Durham NC, 27704 USA, e-post: info@dioxins.com, tfn: 919-688-4804, fax: 919-688-4404

Tillägg 4

STABILT TRANSFEKTERAD HUMAN ÖSTROGENRECEPTOR-Α – TRANSAKTIVERINGSTEST FÖR DETEKTION AV ÖSTROGENAGONISTISK OCH -ANTAGONISTISK AKTIVITET HOS KEMIKALIER MED ANVÄNDNING AV CELLINJEN ERΑ CALUX

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR (SE ÄVEN ALLMÄN INLEDNING)

1. Denna ERα CALUX-transaktiveringstest använder den humana U2OS-cellinjen för att detektera östrogenagonistisk och -antagonistisk aktivitet, medierad genom human östrogenreceptor alfa (hERα). Valideringsstudien av det biologiska testet Stabilt transfekterad ERα CALUX, som utfördes av BioDetection Systems BV (Amsterdam, Nederländerna), visade att denna metod är relevant och tillförlitlig för det avsedda syftet (1). Cellinjen ERα CALUX uttrycker endast stabilt transfekterad human ERα (2) (3).

2. Denna metod är särskilt utformad för att detektera hERα-medierad transaktivering genom att mäta bioluminiscens som endpoint. Bioluminiscens används ofta i biologiska tester på grund av dess höga signal-brusförhållande (4).

3. Fytoöstrogenkoncentrationer högre än 1 μM har rapporterats överaktivera luciferasrapportgenen, vilket leder till ej receptormedierad luminescens (5) (6) (7). Högre koncentrationer av fytoöstrogener eller andra liknande föreningar som kan överaktivera luciferasuttrycket måste därför undersökas mycket noggrant i tester med stabilt transfekterad ER-transaktivering (se tillägg 2).

PRINCIPER FÖR METODEN(SE ÄVEN ALLMÄN INLEDNING)

5. DET biologiska testet används för att bedöma ligandbindning till östrogenreceptorer, följt av translokering av receptor–ligand-komplexet till kärnan. I kärnan binder receptor–ligand-komplexet specifika DNA-responselement och transaktiverar en firefly-luciferasrapportgen, vilket leder till ökat celluttryck hos luciferasenzymen. Efter tillsats av luciferassubstratet luciferin omvandlas luciferinet till en bioluminiscent produkt. Det ljus som alstras kan enkelt upptäckas och kvantifieras med hjälp av en luminometer.

6. Testsystemet använder stabilt transfekterade ERα CALUX-celler. ERα CALUX-celler med ursprung från cellinjen U2OS från humant osteoblastiskt osteosarkom. Humana U2OS-celler transfekterades stabilt med 3xHRE-TATA-Luc och pSG5-neo-hERα, med användning av metoden för samfällning med kalciumfosfat. U2OS-cellinjen valdes som det den bästa kandidaten för att fungera som östrogenresponsiv (och andra steorida hormoner) rapportcellinje, baserat på iakttagelsen att U2OS-cellinjen uppvisar låg eller ingen endogen receptoraktivitet. Frånvaron av endogena receptorer bedömdes endast med användning av luciferasrapportplasmider, som inte visade någon aktivitet när receptorligander tillsattes. Denna cellinje stödde även starka hormonmedierade responser när kognata receptorer infördes transient (2) (3) (8).

7. Testningen av kemikaliers östrogena eller antiöstrogena aktivitet med hjälp av cellinjen ERα CALUX omfattar ett förberedande test och fullständiga testomgångar. Under den förberedande testet bestäms löslighet, cytotoxicitet och ett förfinat koncentrationsintervall för testkemikalierna inför den fullständiga testningen. Under de fullständiga testomgångarna testas testkemikaliernas förfinade koncentrationsintervall i ERα CALUX-testerna, för att därefter klassificera testkemikalierna som agonistiska eller antagonistiska.

8. Datatolkningskriterierna beskrivs i detalj i punkt 59. Kortfattat anses en testkemikalie vara positiv för agonistisk aktivitet om minst två på varandra följande koncentrationer av testkemikalien visar en respons som motsvarar eller är högre än 10 % av den maximala responsen för referensstandarden 17β-östradiol (PC10). En testkemikalie anses vara positiv för antagonistisk aktivitet om minst två på varandra följande koncentrationer av testkemikalien visar en respons som motsvarar eller är lägre än 80 % av den maximala responsen för referensstandarden tamoxifen (PC80).

FÖRFARANDE

Cellinjer

9. Den stabilt transfekterade cellinjen U2OS ERα CALUX bör användas i testet. Cellinjen kan erhållas från BioDetection Systems BV, Amsterdam, Nederländerna med ett tekniskt licensavtal.

10. Endast mykoplasmafria cellodlingar bör användas. De använda cellsatserna bör ha certifierats som negativa för mykoplasmaförorening. I annat fall bör ett mykoplasmatest utföras före användning. RT-PCR (Real Time Polymerase Chain Reaktion) bör användas för känslig detektion av mykoplasmainfektion (9).

Cellinjens stabilitet

11. För att bibehålla CALUX-cellernas stabilitet och integritet bör cellerna lagras i flytande kväve (–80 oC). När cellerna har tinats upp för att starta en ny odling bör de subkultiveras minst två gånger innan de används för att bedöma östrogenagonistisk och -antagonistisk aktivitet hos kemikalier. Cellerna bör inte subkultiveras för mer än 30 passager.

12. För att övervaka cellinjens stabilitet över tiden bör det agonistiska och antagonistiska testsystemets respons kontrolleras genom en utvärdering av referensstandardens värden EC50 eller IC50. Dessutom bör det positiva och det negativa kontrollurvalets relativa induktion övervakas. Resultaten bör överensstämma med acceptanskriterierna för det agonistiska (tabell 3C) eller det antagonistiska ERα CALUX-biotestet (tabell 4C). Referensstandarder och positiva och negativa kontroller anges i tabellerna 1 och 2 för den agonistiska respektive antagonistiska varianten.

Betingelser för cellodling och överföring till platta

13. U2OS-cellerna bör odlas i ett odlingsmedium (DMEM/F12 (1:1) med fenolrött som pH-indikator, kompletterat med fetalt bovinserum (7,5 %), icke-essentiella aminosyror (1 %), 10 enheter/ml penicillin, streptomycin och geneticin (G-418) som urvalsmarkör). Cellerna bör placeras i en CO2-inkubator (5 % CO2) vid 37 °C och 100 % luftfuktighet. När cellerna når en konfluens på 85–95 % bör de antingen subkultiveras eller beredas för sådd i 96-håls mikrotiterplattor. I det senare fallet bör cellerna resuspenderas vid 1 x 105 celler/ml i ett östrogenfritt testmedium (DMEM/F12 (1:1) utan fenolrött, kompletterat med dextranbelagt träkol som behandlats med fetalt bovinserum (5 % v/v), icke-essentiella aminosyror (1 %) och 10 enheter/ml penicillin, streptomycin) och överföras till 96-hålsplattorna (100 μl homogeniserad cellsuspension). Cellerna bör förinkuberas i en CO2-inkubator (5 % CO2, 37 °C, 100 % luftfuktighet) i 24 timmar före exponering. Plasten bör vara östrogenfri.

Acceptanskriterier

14. Testkemikaliernas agonistiska och antagonistiska aktivitet testas i serier. En testserie består av högst sex mikrotiterplattor. Varje testserie består av minst en hel serie av utspädningar av en referensstandard, ett positivt kontrollprov, ett negativt kontrollprov och lösningsmedelskontroller. I figurerna 1 och 2 beskrivs beredningen av plattor för agonistiska och antagonistiska testserier.

15. Varje utspädning av referensstandarderna, testkemikalierna, alla lösningsmedelskontroller samt de positiva och negativa kontrollerna bör analyseras i triplikat. Varje triplikatanalys bör uppfylla kraven i tabellerna 3A och 4A.

16. En komplett serie av utspädningar av referensstandarden (17β-östradiol för agonistisk aktivitet, tamoxifen för antagonistisk aktivitet) mäts på den första plattan i varje testserie. För att kunna jämföra analysresultaten för de återstående fem mikrotiterplattorna med den första mikrotiterplattan som innehåller referensstandardens fullständiga koncentrationsresponskurva bör alla plattor innehålla tre kontrollprover: lösningsmedelskontroll, den högsta koncentrationen av den testade referensstandarden och approximativ koncentration av EC50 (agonistisk aktivitet) eller IC50 (antagonistisk aktivitet) för referensstandarden. Förhållandet mellan de genomsnittliga kontrollproverna för den första plattan och de återstående fem plattorna bör uppfylla de krav som anges i tabell 3C (agonistisk aktivitet) eller tabell 4C (antagonistisk aktivitet).

17. Z-faktorn beräknas för varje mikrotiterplatta inom en testserie (10). Z-faktorn bör beräknas med användning av responsen vid referensstandardens högsta och lägsta koncentration. En mikrotiterplatta anses giltig om den uppfyller kraven i tabell 3C (agonistisk aktivitet) eller tabell 4C (antagonistisk aktivitet).

18. Referensstandarden bör uppvisa en S-formad dosresponskurva. Det EC50- eller IC50-värde som härleds från responsen på en serie utspädningar av referensstandarden bör uppfylla kraven i tabell 3C (agonistisk aktivitet) eller tabell 4C (antagonistisk aktivitet).

19. Varje testserie bör innehålla ett positivt och ett negativt kontrollprov. Den beräknade relativa induktionen både för det positiva och det negativa kontrollprovet bör uppfylla kraven i tabell 3C (agonistisk aktivitet) eller tabell 4C (antagonistisk aktivitet).

20. Under alla mätningar bör induktionsfaktorn för referensstandardens högsta koncentration mätas genom att den genomsnittligt högsta RLU-responsen för referensstandarden 17β-östradiol divideras med referenslösningsmedelskontrollens genomsnittliga RLU-respons. Denna induktionsfaktor bör uppfylla kraven för x-faldig induktion i tabell 3C (agonistisk aktivitet) eller tabell 4C (antagonistisk aktivitet).

21. Endast mikrotiterplattor som uppfyller samtliga ovannämnda acceptanskriterier anses giltiga och kan användas för att utvärdera testkemikaliernas respons.

22. Acceptanskriterierna är tillämpliga både på det förberedande testet och de fullständiga testomgångarna.

Tabell 1 Koncentrationer av referensstandarden samt positiv kontroll och negativ kontroll för det agonistiska CALUX-testet

Ämne | CAS-nr | Testintervall (M)

Referensstandard | 17β-östradiol | 50-28-2 | 1*10–13 – 1*10–10

Positiv kontroll (PC) | 17α-metyltestosteron | 58-18-4 | 3*10–6

Negativ kontroll (NC) | kortikosteron | 50-22-6 | 1*10-8

Tabell 2 Koncentrationer av referensstandarden samt positiv kontroll och negativ kontroll för det antagonistiska CALUX-testet

Ämne | CAS-nr | Testintervall (M)

Referensstandard | tamoxifen | 10540-29-1 | 3*10-9 – 1*10-5

Positiv kontroll (PC) | 4-hydroxitamoxifen | 68047-06-3 | 1*10-9

Negativ kontroll (NC) | resveratrol | 501-36-0 | 1*10-5

Tabell 3 Acceptanskriterier för det agonistiska ERα CALUX-testet

A – individuella prov på platta | Kriterium

1 | Maximal % SD för triplikathål (för negativ kontroll, positiv kontroll, kemikalie och referensstandard, förutom C0) | < 15 %

2 | Maximal % SD för triplikathål (för referensstandard och testkemikaliens lösningsmedelskontroller (C0, SC)) | < 30 %

3 | Maximalt LDH-läckage, som ett mått på cytotoxicitet. | < 120 %

B – inom en enskild mikrotiterplatta

4 | Förhållande för referensstandardens lösningsmedelskontroll (C0, platta 1) och testkemikaliens lösningsmedelskontroll (SC, plattorna 2 till x) | 0,5 till 2,0

5 | Förhållande för appr. EC50 och de högsta referensstandardkoncentrationerna på platta 1 samt appr. EC50 och de högsta referensstandardkoncentrationerna på plattorna 2 till x (C4, C8) | 0,70 till 1,30

6 | Z-faktor för varje platta | > 0,6

C – inom en enskild analysserie (samtliga plattor i en serie)

7 | S-kurva för referensstandarden | Ja (17ß-östradiol)

8 | EC50-förhållande för referensstandarden 17ß-östradiol | 4*10-12 – 4*10-11 M

9 | Minsta induktionsförhållande för den högsta koncentrationen av 17ß-östradiol med avseende på referensstandardens lösningsmedelskontroll. | 5

10 | Relativ induktion (%) PC. | > 30 %

11 | Relativ induktion (%) NC. | < 10 %

Appr.: approximativ. PC: positiv kontroll. NC: negativ kontroll. SC: testkemikaliens lösningsmedelskontroll. C0: referensstandardens lösningsmedelskontroll. SD: standardavvikelse. LDH: laktatdehydrogenas.

Tabell 4 Acceptanskriterier för det antagonistiska ERα CALUX-testet

A – individuella prov på platta | Kriterium

1 | Maximal % SD för triplikathål (för negativ kontroll, positiv kontroll, kemikalie och referensstandard, lösningsmedelskontroll C0)) | < 15 %

2 | Maximal % SD för triplikathål (för vehikelkontroll och högsta referensstandardkoncentration (C8)) | < 30 %

3 | Maximalt LDH-läckage, som ett mått på cytotoxicitet. | < 120 %

B – inom en enskild mikrotiterplatta

4 | Förhållande för referensstandardens lösningsmedelskontroll (C0, platta 1) och testkemikaliens lösningsmedelskontroll (SC, plattorna 2 till x) | 0,70 till 1,30

5 | Förhållande för appr. referensstandardkoncentrationer för IC50 på platta 1 samt appr. IC50-referensstandardkoncentrationer för IC50 på plattorna 2 till x (C4) | 0,70 till 1,30

6 | Förhållande för de högsta referensstandardkoncentrationerna på platta 1 och de högsta referensstandardkoncentrationerna på plattorna 2 till x (C8) | 0,50 till 2,0

7 | Z-faktor för varje platta | > 0,6

C – inom en enskild analysserie (samtliga plattor i en serie)

8 | S-kurva för referensstandarden | Ja (tamoxifen)

9 | IC50-förhållande för referensstandarden (tamoxifen) | 1*10-8 - 1*10-7 M

10 | Minsta induktionsförhållande för referensstandardens lösningsmedelskontroll med avseende på den högsta tamoxifenkoncentrationen. | 2,5

11 | Relativ induktion (%) PC. | < 70 %

12 | Relativ induktion (%) NC. | > 85 %

Appr.: approximativ. PC: positiv kontroll. NC: negativ kontroll. VC: vehikelkontroll (lösningsmedelskontroll utan fast koncentration av den agonistiska referensstandarden). SC: testkemikaliens lösningsmedelskontroll. C0: referensstandardens lösningsmedelskontroll. SD: standardavvikelse. LDH: laktatdehydrogenas.

Lösningsmedels-/vehikelkontroll, referensstandarder, positiva kontroller, negativa kontroller

23. Samma lösningsmedels-/vehikelkontroll, referensstandarder och positiva och negativa kontroller bör användas både för det förberedande testet och de fullständiga testomgångarna. Dessutom bör koncentrationen av referensstandarder och positiva och negativa kontroller vara desamma.

Lösningsmedelskontroll

24. Det lösningsmedel som används för att lösa upp testkemikalierna bör användas som lösningsmedelskontroll. Dimetylsulfoxid (DMSO, 1 % (v/v), CAS-nr 67-68-5) användes som vehikel under valideringen av ERα CALUX-testet. Om ett annat lösningsmedel än DMSO används bör alla referensstandarder, kontroller och testkemikalier testas i samma vehikel. Observera att lösningsmedelskontrollen för antagonistiska studier innehåller en fast koncentration av den agonistiska referensstandarden 17β-östradiol (ungefär EC50-koncentration). En vehikelkontroll bör beredas och testas för att testa det lösningsmedel som används för antagonistiska studier.

Vehikelkontroll (antagonistisk aktivitet)

25. För att testa antagonistisk aktivitet kompletteras testmediet med en fast koncentration av den agonistiska referensstandarden 17β-östradiol (ungefär EC50-koncentration). För att testa det lösningsmedel som använts för att lösa upp testkemikalierna i antagonisttestet, bör ett testmedium utan fast koncentration av den agonistiska referensstandarden 17β-östradiol beredas. Detta kontrollprov utgör vehikelkontrollen. Dimetylsulfoxid (DMSO, 1 % (v/v), CAS-nr 67-68-5) användes som vehikel under valideringen av ERα CALUX-testet. Om ett annat lösningsmedel än DMSO används bör alla referensstandarder, kontroller och testkemikalier testas i samma vehikel.

Referensstandarder

26. Den agonistiska referensstandarden är 17β-östradiol (tabell 1). Referensstandarderna består av seriespädningar av åtta koncentrationer av 17β-östradiol (1*10-13, 3*10-13, 1*10-12, 3*10-12, 6*10-12, 1*10-11, 3*10-11, 1*10-10 M).

27. Den antagonistiska referensstandarden är tamoxifen (tabell 2). Referensstandarderna består av seriespädningar av åtta koncentrationer av tamoxifen (3*10-9, 1*10-8, 3*10-8, 1*10-7, 3*10-7, 1*10-6, 3*10-6, 1*10-5 M). Varje koncentration av den agonistiska referensstandarden saminkuberas med en fast koncentration av den agonistiska referensstandarden17β-östradiol (3*10-12 M).

Positiv kontroll

28. Den positiva kontrollen för agonistiska studier är 17α-metyltestosteron (tabell 1).

29. Den positiva kontrollen för antagonistiska studier är 4-hydroxitamoxifen (tabell 2). Den antagonistiska positiva kontrollen saminkuberas med en fast koncentration av den agonistiska referensstandarden17β-östradiol (3*10-12 M).

Negativ kontroll

30. Den negativa kontrollen för agonistiska studier är kortikosteron (tabell 1).

31. Den negativa kontrollen för antagonistiska studier är resveratrol (tabell 2). Den antagonistiska negativa kontrollen saminkuberas med en fast koncentration av den agonistiska referensstandarden17β-östradiol (3*10-12 M).

Demonstration av laboratoriets kompetens (se punkt 14 och tabellerna 3 och 4 i Komponenter i ER TA-testet i denna testmetod)

Vehikel

32. Det lösningsmedel som används för att lösa upp testkemikalierna bör lösa upp testkemikalien fullständigt och bör vara blandbart med cellmediet. DMSO, vatten och etanol (renhetsgrad 95 % till 100 %) är lämpliga lösningsmedel. Om DMSO används som lösningsmedel bör den maximala koncentrationen av DMSO under inkubationen inte överskrida 1 % (v/v). Före användning bör lösningsmedlet testas för att kontrollera att det inte är cytotoxiskt och inte stör testet.

Beredning av referensstandarder, positiva kontroller, negativa kontroller och testkemikalier

33. Referensstandarder, positiva kontroller, negativa kontroller och testkemikalier löses upp i 100 % DMSO (eller ett annat lämpligt lösningsmedel). Lämpliga (serie)spädningar bör sedan beredas i samma lösningsmedel. Innan de löses upp bör alla ämnen få anta rumstemperatur. Färska stamlösningar eller referensstandarder, positiva kontroller, negativa kontroller och testkemikalier bör inte ha märkbara fällningar eller grumlighet. Referensstandarden och kontrollstammarna kan beredas i bulk. Nya stamlösningar av testkemikalierna bör beredas före varje försök. Nya slutliga utspädningar av referensstandarderna, de positiva kontrollerna, de negativa kontrollerna och testkemikalierna bör dock beredas för varje försök och användas inom 24 timmar från beredningen.

Löslighet, cytotoxicitet och koncentrationsintervall

34. Under det förberedande testet fastställs testkemikaliernas löslighet i det valda lösningsmedlet. En maximal stamkoncentration på 0,1 M bereds. Om denna koncentration visar löslighetsproblem bör lägre stamlösningar beredas till dess att testkemikalierna är fullständigt upplösta. Under det förberedande testet testas seriespädningar på 1:10 av testkemikalien. Den maximala testkoncentrationen för agonistisk eller antagonistisk testning är 1 mM. Efter det förberedande testet härleds ett lämpligt förfinat koncentrationsintervall för testkemikalierna som bör testas under de fullständiga testomgångarna. De utspädningar som används för fullständig testning bör vara 1x, 3x, 10x, 30x, 100x, 300x, 1000x och 3000x.

35. Cytotoxicitetstestning ingår i protokollet för den agonistiska och den antagonistiska testmetoden (11). Cytotoxicitetstestning ingår dessutom både i det förberedande testet och de fullständiga testomgångarna. Den metod som användes för att bedöma cytotoxicitet under valideringen av ERα CALUX-testet var läckagetestet för laktatdehydrogenas (LDH) i kombination med en kvalitativ visuell inspektion av cellerna (se tillägg 4.1) och följt av exponering för textkemikalierna. Andra kvantitativa metoder kan dock användas för att bestämma cytotoxicitet (t.ex. tetrazoliumbaserat kolorimetriskt test (MTT) eller CALUX-test av cytotoxicitet). Generellt anses testkemikaliekoncentrationer som visar mer än 20 % reduktion av cellviabiliteten vara cytotoxiska och kan därför inte användas för datautvärdering. När det gäller LDH-läckagetest anses testkemikaliens koncentration vara cytotoxisk om procentandelen LDH-läckage är högre än 120 %.

Testkemikaliens exponering och beredning av testplattor

36. Efter trypsinering av en konfluent kolv med odlade celler resuspenderas cellerna vid 1 x 105 celler/ml i ett östrogenfritt testmedium 100 μl av resuspenderade celler överförs till de inre hålen på en 96-håls mikrotiterplatta. De yttre hålen fylls med 200 μl fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (se figurerna 1 och 2). De överförda cellerna förinkuberas i 24 timmar i en CO2-inkubator (5 % CO2, 37 °C, 100 % luftfuktighet).

37. Efter förinkuberingen inspekteras cellerna för att kontrollera om det finns någon synlig cytotoxicitet (se tillägg 4.1), kontamination eller konfluens. Endast plattor som inte visar någon synlig cytotoxicitet eller kontamination och har minst 85 % konfluens används för testningen. Mediet från de inre hålen avlägsnas försiktigt och ersätts med 200 μl östrogenfritt testmedium som innehåller lämpliga spädningsserier av referensstandarderna, testkemikalierna, de positiva kontrollerna, de negativa kontrollerna och lösningsmedelskontrollerna (tabell 5: agonistiska studier, Tabell 6: antagonistiska studier). Alla referensstandarder, testkemikalier, positiva kontroller, negativa kontroller och lösningsmedelskontroller testas i triplikat. Plattans utformning för agonistisk testning anges i figur 1. Plattans utformning för antagonistisk testning anges i figur 2. Plattorna för förberedande test och fullständig testning utformas på identiskt sätt. För antagonistisk testning innehåller alla inre hål, förutom hålen för vehikelkontroll, även en fast koncentration av den agonistiska referensstandarden 17β-östradiol (3*10-12 M). Observera att referensstandarderna C8 och C4 bör tillsättas varje TC-platta.

38. När cellerna har exponerats för alla kemikalier bör de 96-håls mikrotiterplattorna inkuberas i ytterligare 24 timmar i en CO2-inkubator (5 % CO2, 37 °C, 100 % luftfuktighet).

Figur 1 Utformning av 96-håls mikrotiterplattor för förberedande test och bedömning av agonistisk effekt.

C0 = referensstandardens lösningsmedel.

C(1-8) = referensstandardens spädningsserier (1-8, låga-till-höga koncentrationer).

PC = positiv kontroll.

NC = negativ kontroll.

TCx-(1-8) = spädningar (1-8, låga till höga koncentrationer) av testkemikalien för det förberedande testet samt bedömning av den agonistiska effekten hos testkemikalie x.

SC = lösningsmedelskontroll av testkemikalien (helst samma lösningsmedel som i C0, men eventuellt från en annan sats).

Grå celler: = Yttre hål, fyllda med 200 μl PBS.

Figur 2 Utformning av 96-håls mikrotiterplattor för förberedande test och bedömning av antagonistisk effekt.

C0 = referensstandardens lösningsmedel.

C(1-8) = referensstandardens spädningsserier (1-8, låga-till-höga koncentrationer).

NC = negativ kontroll.

PC = positiv kontroll.

TCx-(1-8) = spädningar (1-8, låga till höga koncentrationer) av testkemikalien för det förberedande testet samt bedömning av den agonistiska effekten hos testkemikalie x.

SC = lösningsmedelskontroll av testkemikalien (helst samma lösningsmedel som i C0, men eventuellt från en annan sats).

VC = vehikelkontroll (lösningsmedelskontroll utan fast koncentration av den agonistiska referensstandarden 17β-östradiol).

Grå celler: = Yttre hål, fyllda med 200 μl PBS.

Anmärkning: alla inre hål, utom hålen för vehikelkontroll, innehåller också en fast koncentration av den agonistiska referensstandarden 17β-östradiol (3,0*10-12 M).

Mätning av luminescens

39. Luminiscensmätningen beskrivs i detalj i protokollet för den agonistiska och den antagonistiska testmetoden (10). Mediet bör avlägsnas från hålen och cellerna bör lyseras efter 24 timmars inkubation för att öppna cellmembranet och möjliggöra mätning av luciferasaktiviteten.

40. För luminescensmätningen kräver detta förfarande en luminometer som är utrustad med två injektorer. Luciferasreaktionen utlöses genom injektion av substratet luciferin. Reaktionen stoppas genom tillsats av 0,2 M NaOH. Reaktionen stoppas för att förebygga att luminescens överförs från ett hål till ett annat.

41. Det ljus som släpps ut från varje hål uttrycks som relativa ljusenheter (RLU) från varje hål.

Förberedande test

42. Analysresultaten från det förberedande testet används för att bestämma ett förfinat koncentrationsintervall för testkemikalierna inför den fullständiga testningen. Utvärdering av resultaten från det förberedande testet och bestämning av det förfinade koncentrationsintervallet för testkemikalier för fullständig testning beskrivs detaljerat i protokollet för den agonistiska och den antagonistiska testmetoden (10). Här ges endast en kort sammanfattning av förfarandena för att bestämma testkemikaliernas koncentrationsintervall för agonistisk och antagonistisk testning. Vägledning för utformningen av seriespädningar ges i tabellerna 5 och 6.

Val av koncentrationer för bedömning av agonistiska effekter

43. Under det förberedande testet bör testkemikalierna testas med användning av de seriespädningar som anges i tabell 5 (agonistisk testning) och 6 (antagonistisk testning). Alla koncentrationer bör testas i triplikathål enligt den utformning av plattorna som ges i figur 1 (agonistisk testning) respektive figur 2 (antagonistisk testning).

44. Endast analysresultat som uppfyller acceptanskriterierna (tabell 3) anses giltiga och kan användas för att utvärdera testkemikaliernas respons. Om en eller flera mikrotiterplattor i en analysserie inte uppfyller acceptanskriterierna bör de respektive mikrotiterplattorna analyseras igen. Om den första plattan som innehåller den fullständiga serien av spädningar av referensstandarden inte uppfyller acceptanskriterierna måste hela testserien (sex plattor) analyseras igen.

45. Testkemikaliernas ursprungliga koncentrationsintervall bör justeras och det förberedande testet bör upprepas i följande fall: Om cytotoxicitet observeras. Det förberedande testet bör upprepas med lägre icke-cytotoxiska koncentrationer av testkemikalien. Om det förberedande testet av testkemikalien inte visar en fullständig dosresponskurva på grund av att de testade kemikalierna genererar maximal induktion. Det förberedande testet bör upprepas med lägre koncentrationer av testkemikalien.

46. När en giltig dosrelaterad respons observeras bör den (lägsta) koncentration vid vilken maximal induktion observeras och inte visar cytotoxicitet väljas. Den högsta koncentrationen av den testkemikalie som ska testas i de fullständiga testomgångarna bör vara tre gånger denna valda koncentration.

47. En fullständig förfinad spädningsserie av testkemikalien bör beredas med de utspädningssteg som anges i tabell 5, med start vid den högsta koncentration som fastställts enligt ovan.

48. En testkemikalie som inte framkallar någon agonistisk effekt bör testas i de fullständiga testomgångarna, med start vid den högsta icke-cytotoxiska koncentration som identifierats under det förberedande testet.

Val av koncentrationer för bedömning av antagonistiska effekter

49. Endast analysresultat som uppfyller acceptanskriterierna (tabell 4) anses giltiga och kan användas för att utvärdera testkemikaliernas respons. Om en eller flera mikrotiterplattor i en analysserie inte uppfyller acceptanskriterierna bör de respektive mikrotiterplattorna analyseras igen. Om den första plattan som innehåller den fullständiga serien av spädningar av referensstandarden inte uppfyller acceptanskriterierna måste hela testserien (sex plattor) analyseras igen.

50. Testkemikaliernas ursprungliga koncentrationsintervall bör justeras och det förberedande testet bör upprepas i följande fall: Om cytotoxicitet observeras. Det förberedande testet bör upprepas med lägre icke-cytotoxiska koncentrationer av testkemikalien. Om det förberedande testet av testkemikalien inte visar en fullständig dosresponskurva på grund av att de testade kemikalierna genererar maximal inhibering. Det förberedande testet bör upprepas med lägre koncentrationer av testkemikalien.

51. När en giltig dosrelaterad respons påvisas bör den (lägsta) koncentration vid vilken maximal inhibiering observeras och inte visar cytotoxicitet väljas. Den högsta koncentrationen av den testkemikalie som ska testas i de fullständiga testomgångarna bör vara tre gånger denna valda koncentration.

52. En fullständig förfinad spädningsserie av testkemikalien bör beredas med de utspädningssteg som anges i tabell 6, med start vid den högsta koncentration som fastställts enligt ovan.

53. Testkemikalier som inte framkallar några antagonistisk effekter bör testas i de fullständiga testomgångarna, med start vid den högsta icke-cytotoxiska koncentration som testats under det förberedande testet.

Fullständiga testomgångar

54. När de förfinade koncentrationsintervallen har valts bör testkemikalierna testas fullständigt med användning av de spädningsserier som anges i tabell 5 (antagonistisk analys) och 6 (antagonistisk analys). Alla koncentrationer bör testas i triplikathål enligt den utformning av plattorna som ges i figur 1 (agonistisk testning) respektive figur 2 (antagonistisk testning).

55. Endast analysresultat som uppfyller acceptanskriterierna (tabellerna 3 och 4) anses giltiga och kan användas för att utvärdera testkemikaliernas respons. Om en eller flera mikrotiterplattor i en analysserie inte uppfyller acceptanskriterierna bör de respektive mikrotiterplattorna analyseras igen. Om den första plattan som innehåller den fullständiga serien av spädningar av referensstandarden inte uppfyller acceptanskriterierna måste hela testserien (sex plattor) analyseras igen.

Tabell 5 Koncentrationer och utspädningar av de referensstandarder, kontroller och testkemikalier som används för agonistisk testning

Referens 17β-östradiol | TCx – förberedande test | TCx – fullständig körning | Kontroller

konc. (M) | utspädning | utspädning | konc. (M)

C0 | 0 | TCx-1 | 10000000 x | TCx-1 | 3000 x | PC | 3*10-6

C1 | 1*10-13 | TCx-2 | 1000000 x | TCx-2 | 1000 x | NC | 1*10-8

C2 | 3*10-13 | TCx-3 | 100000 x | TCx-3 | 300 x | C0 | 0

C3 | 1*10-12 | TCx-4 | 10000 x | TCx-4 | 100 x | SC | 0

C4 | 3*10-12 | TCx-5 | 1000 x | TCx-5 | 30 x

C5 | 6*10-12 | TCx-6 | 100 x | TCx-6 | 10 x

C6 | 1*10-11 | TCx-7 | 10 x | TCx-7 | 3 x

C7 | 3*10-11 | TCx-8 | 1 x | TCx-8 | 1 x

C8 | 1*10-10

Tabell 6 Koncentrationer och utspädningar av de referensstandarder, kontroller och testkemikalier som används för antagonistisk testning

Referenstamoxifen | TCx – förberedande test | TCx – fullständig körning | Kontroller

konc. (M) | utspädning | utspädning | konc. (M)

C0 | 0 | TCx-1 | 10000000 x | TCx-1 | 3000 x | PC | 1*10-9

C1 | 3*10-9 | TCx-2 | 1000000 x | TCx-2 | 1000 x | NC | 1*10-5

C2 | 1*10-8 | TCx-3 | 100000 x | TCx-3 | 300 x | C0 | 0

C3 | 3*10-8 | TCx-4 | 10000 x | TCx-4 | 100 x | SC | 0

C4 | 1*10-7 | TCx-5 | 1000 x | TCx-5 | 30 x

C5 | 3*10- | TCx-6 | 100 x | TCx-6 | 10 x | Kompletterad agonist

C6 | 1*10-6 | TCx-7 | 10 x | TCx-7 | 3 x | konc. (M)

C7 | 3*10-6 | TCx-8 | 1 x | TCx-8 | 1 x | 17β-östradiol | 3*10-12

C8 | 1*10-5

Insamling av data och dataanalys

56. Efter det förberedande testet och den fullständiga testomgångarna bör testkemikaliens EC10, EC50, PC10, PC50 och maximala induktion (TCxmax) bestämmas för agonistisk testning. För antagonistisk testning bör IC20, IC50, PC80, PC50 och minimal induktion (TCxmin) beräknas. En grafisk återgivning av dessa parametrar ges i figur 3 (agonistisk aktivitet) och figur 4 (antagonistisk aktivitet). De parametrar som behövs beräknas baserat på varje testkemikalies relativa induktion (i förhållande till referensstandardens maximala induktion (= 100 %)). Icke-linjär regression (variabel lutning, fyra parametrar) bör användas för datautvärderingen, enligt följande ekvation: Y Bottom Top Bottom 1 10 lgEC 50 X Hill Slope Där X = Log av dos eller koncentration Y = Respons (relativ induktion (%)) Top = Maximal induktion (%) Bottom = Minimal induktion (%) LogEC50 = log av koncentration vid vilken 50 % av den maximala responsen observeras. Hill-koefficient (Hill slope) = lutningsfaktor eller Hill slope.

57. Rådata från luminometern, uttryckt som relativa ljusenheter (RLU), bör överföras till det kalkylblad för dataanalysen som har utformats för det förberedande testet och de fullständiga testomgångarna. Rådatan bör uppfylla de acceptanskriterier som anges i tabellerna 3A och 3B (agonistisk analys) respektive tabellerna 4A och 4B (antagonistisk analys). Om rådatan uppfyller acceptanskriterierna utförs följande beräkningssteg för att bestämma de parametrar som behövs:

Agonistisk analys

Subtrahera genomsnittlig RLU för referensstandardens lösningsmedelskontroll från varje råanalysdata för referensstandarderna.

Subtrahera genomsnittlig RLU för testkemikaliens lösningsmedelskontroll från varje råanalysdata för testkemikalierna.

Beräkna den relativa induktionen från varje koncentration av referensstandarden. Sätt induktionen för den högsta koncentrationen av referensstandarden till 100 %.

Beräkna den relativa induktionen för varje koncentration av testkemikalien jämfört med den högsta koncentrationen av referensstandarden som 100 %.

Utvärdera analysresultaten enligt icke-linjär regression (variabel lutning, fyra parametrar).

Bestäm EC50 och EC10 för referensstandarden.

Bestäm EC50 och EC10 för testkemikalierna.

Bestäm den högsta relativa induktionen för testkemikalien (TCmax).

Bestäm PC10 och PC50 för testkemikalierna.

För testkemikalier är det kanske inte alltid möjligt att erhålla en fullständig dosresponskurva, t.ex. på grund av problem med cytotoxicitet eller löslighet. Det innebär i sin tur att EC50, EC10 och PC50 inte kan bestämmas. I sådana fall kan endast PC10 och TCmax bestämmas.

Antagonistisk analys

Subtrahera genomsnittlig RLU för den högsta koncentrationen av referensstandarden från varje råanalysdata för referensstandarderna.

Subtrahera genomsnittlig RLU för referensstandardens lösningsmedelskontroll från varje råanalysdata för testkemikalierna.

Beräkna den relativa induktionen från varje koncentration av referensstandarden. Sätt induktionen för den lägsta koncentrationen av referensstandarden till 100 %.

Beräkna den relativa induktionen för varje koncentration av testkemikalien jämfört med den lägsta koncentrationen av referensstandarden som 100 %.

Utvärdera analysresultaten enligt icke-linjär regression (variabel lutning, fyra parametrar).

Bestäm IC50 och IC20 för referensstandarden.

Bestäm IC50 och IC20 för testkemikalierna.

Bestäm den lägsta relativa induktionen för testkemikalien (TCmin).

Bestäm PC80 och PC50 för testkemikalierna.

Figur 3 Översikt över parametrar som bestäms i det agonistiska testet

EC10 = koncentration av ett ämne vid vilken 10 % av dess maximala respons observeras.

EC50 = koncentration av ett ämne vid vilken 50 % av dess maximala respons observeras.

PC10 = koncentration av en testkemikalie vid vilken dess respons motsvarar referensstandardens EC10.

PC50 = koncentration av en testkemikalie vid vilken dess respons motsvarar referensstandardens EC50.

TCxmax = testkemikaliens maximala relativa induktion.

Figur 4 Översikt över parametrar som bestäms i det antagonistiska testet

IC20 = koncentration av ett ämne vid vilken 80 % av dess maximala respons observeras (20 % inhibition).

IC50 = koncentration av ett ämne vid vilken 50 % av dess maximala respons observeras (50 % inhibition).

PC80 = koncentration av en testkemikalie vid vilken dess respons motsvarar referensstandardens IC20.

PC50 = koncentration av en testkemikalie vid vilken dess respons motsvarar referensstandardens IC50.

TCxmin = testkemikaliens minimala relativa induktion.

För testkemikalier är det kanske inte alltid möjligt att erhålla en fullständig dosresponskurva, t.ex. på grund av problem med cytotoxicitet eller löslighet. Följaktligen kan IC50, IC20 och PC50 inte fastställas. I sådana fall kan endast PC20 och TCmin bestämmas.

58. Resultaten bör baseras på två (eller tre) oberoende testomgångar. Om två testomgångar ger jämförbara och därför reproducerbara resultat är det inte nödvändigt att utföra en tredje testomgång. För att vara godtagbara bör resultaten uppfylla acceptanskriterierna (se Acceptanskriterier, punkterna 14–22), vara reproducerbara.

Datatolkningskriterier

59. Följande kriterier ska användas för datatolkning och beslut om huruvida en testkemikalie anses vara positiv eller negativ: Agonistisk analys För varje fullständig körning anses en testkemikalie vara positiv om 1 TCmax motsvarar eller överskrider 10 % av referensstandardens maximala respons (REF10), 2 minst två på varandra följande koncentrationer av testkemikalien motsvarar eller överskrider REF10. För varje fullständig körning anses en testkemikalie vara negativ om 1 TCmax inte motsvarar eller överskrider 10 % av referensstandardens maximala respons (REF10). 2 mindre än två på varandra följande koncentrationer av testkemikalien motsvarar eller överskrider REF10. Antagonistisk analys För varje fullständig körning anses en testkemikalie vara positiv om 1 TCmin motsvarar eller är lägre än 80 % av referensstandardens maximala respons (REF80 = 20 % inhibition). 2 minst två på varandra följande koncentrationer av testkemikalien motsvarar eller är lägre än REF80. För varje fullständig körning anses en testkemikalie vara negativ om 1 TCmin överskrider 80 % av referensstandardens maximala respons (REF80 = 20 % inhibition), 2 mindre än två på varandra följande koncentrationer av testkemikalien motsvarar eller är lägre än REF80.

60. För att karakterisera potensen hos den positiva responsen från en testkemikalie bör effektens omfattning (agonistisk analys TCmax, antagonistisk analys TCmin) samt den koncentration vid vilken effekten uppstår (agonistisk analys EC10, EC50, PC10, PC50. antagonistisk analys IC20, IC50, PC80, PC50) rapporteras.

TESTRAPPORT

61. Se punkt 20 i Komponenter i ER TA-testet.

LITTERATUR

1 OECD (2016). Draft Validation report of the (anti-) ERα CALUX bioassay – transactivation bioassay for the detection of compounds with (anti)estrogenic potential. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (nr 240). Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling, Paris

2 Sonneveld E., Jansen H.J., Riteco J.A., Brouwer A., van der Burg B. (2005). Development of androgen- and estrogen-responsive bioassays, members of a panel of human cell line-based highly selective steroid-responsive bioassays. Toxicol Sci. 83(1), 136–148.

3 Quaedackers M.E., van den Brink C.E., Wissink S., Schreurs R.H.M.M., Gustafsson J.A., van der Saag P.T. och van der Burg B. (2001). 4-Hydroxytamoxifen trans-represses nuclear factor-kB Activity in human osteoblastic U2OS cells through estrogen receptor (ER)α and not through ERβ. Endocrinology 142(3), 1156–1166.

4 Thorne N., Inglese J. och Auld D.S. (2010). Illuminating Insights into Firefly Luciferase and Other Bioluminescent Reporters Used in Chemical Biology, Chemistry and Biology17(6):646–57.

5 Escande A., Pillon A., Servant N., Cravedi J.P., Larrea F., Muhn P., Nicolas J.C., Cavaillès V. och Balaguer P.. (2006). Evaluation of ligand selectivity using reporter cell lines stably expressing estrogen receptor alpha or beta. Biochem. Pharmacol., 71, 1459–1469.

6 Kuiper G.G., Lemmen J.G., Carlsson B., Corton J.C., Safe S.H., van der Saag P.T., van der Burg B. och Gustafsson J.A. (1998). Interaction of estrogenic chemicals and phytoestrogens with estrogen receptor beta. Endocrinol., 139, 4252–4263.

7 Sotoca A.M., Bovee T.F.H., Brand W., Velikova N., Boeren S., Murk A.J., Vervoort J., Rietjens I.M.C.M. (2010). Superinduction of estrogen receptor mediated gene expression in luciferase based reporter gene assays is mediated by a post-transcriptional mechanism. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol., 122, 204–211.

8 Sonneveld E., Riteco J.A.C., Jansen H.J., Pieterse B., Brouwer A., Schoonen W.G., and van der Burg B. (2006). Comparison of in vitro and in vivo screening models for androgenic and estrogenic activities. Toxicol. Sci., 89(1), 173–187.

9 Kobayashi H., Yamamoto K., Eguchi M., Kubo M., Nakagami S., Wakisaka S., Kaizuka M. och Ishii H. (1995). Rapid detection of mycoplasma contamination in cell cultures by enzymatic detection of polymerase chain reaction (PCR) products. J. Vet. Med. Sci., 57(4), 769–771.

10 Zhang J-H., Chung T.D.Y. och Oldenburg K.R. (1999). A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throuphut screening assays. J. Biomol. Scr., 4, 67–73

11 Besselink H., Middelhof.I, och Felzel, E. (2014). Transactivation assay for the detection of compounds with (anti)estrogenic potential using ERα CALUX cells. BioDetection Systems BV (BDS). Amsterdam, Nederländerna,

Tillägg 4.1

VISUELL INSPEKTION AV CELLVIABILITET

< 5 % konfluens. Cellerna har just såtts. 100 % cellviabilitet: Klassificering: ingen cytotoxicitet | > 85 % konfluens. I detta skede exponeras cellerna för testkemikalier. > 95 % cellviabilitet. Klassificering: ingen cytotoxicitet

> 95 % konfluens. Cellerna packas tätt och börjar växa över. > 95 % cellviabilitet. Klassificering: ingen cytotoxicitet | < 25 % cellviabilitet. Cellerna släpper och kontakterna mellan dem minskar. Cellerna rundas. Klassificering: cytotoxicitet

< 5 % cellviabilitet. Cellerna har släppt fullständigt och kontakten mellan dem bryts. Cellerna rundas. Klassificering: cytotoxicitet

Tillägg 1

DEFINITIONER

Tillägg 2

FORMLER

Cytotoxicitet

För båda versionerna (agar och mikrotiterplatta) av MLA

Cytotoxicitet definieras som relativ total tillväxt (RTG), vilket omfattar relativ suspensionstillväxt (RSG) under expressionsperioden på två dagar och relativ kloningseffektivitet (RCE), som erhållits vid tidpunkten för mutanturvalet. RTG, RSG och RCE uttrycks i procent.

Beräkning av RSG: Suspensionstillväxt ett (SG1) är tillväxttakten mellan dag 0 och dag 1 (cellkoncentration på dag 1/cellkoncentration på dag 0), och suspensionstillväxt två (SG2) är tillväxttakten mellan dag 1 och dag 2 (cellkoncentration på dag 2/cellkoncentration på dag 1). RSG är den totala suspensionstillväxten (SG1 x SG2) för den behandlade odlingen jämfört med den obehandlade kontrollen/lösningsmedelskontrollen. Det innebär följande: RSG = [SG1(test) x SG2(test)] / [SG1(kontroll) x SG2(kontroll)]. SG1 bör beräknas från den ursprungliga cellkoncentration som användes i början av cellbehandlingen. Detta förklarar eventuell differentiell cytotoxicitet som förekommer i testodlingarna under cellbehandlingen.

RCE är testodlingens relativa kloningseffektivitet jämfört med kloningseffektiviteten hos den obehandlade kontroll/lösningsmedelskontroll som erhållits vid tidpunkten för mutanturvalet.

Relativ total tillväxt (RTG): RTG = RSG x RCE

TK6

Relativ överlevnad (RS):

Cytotoxicitet bedöms genom den relativa överlevnaden, dvs. kloningseffektiviteten för celler som överförts till platta omedelbart efter behandling justerat utifrån eventuell cellförlust under behandlingen jämfört med kloningseffektiviteten i negativa kontroller (som tilldelas en överlevnadskvot på 100 %). Justeringen för cellförlust under behandlingen kan beräknas som

RS för celler som behandlats av en testkemikalie beräknas på följande sätt:

Mutantfrekvens för både MLA och TK6

Mutantfrekvensen (MF) är kloningseffektiviteten hos mutantkolonier i ett selektivt medium CEM) justerat med kloningseffektiviteten i ett icke-selektivt medium vid tidpunkten för mutanturvalet (CEV). Det vill säga, MF=CEM/CEV. Beräkningen av kloningseffektivitet beskrivs nedan för kloningsmetoderna med agar och mikrotiterplatta.

Agarversionen av MLA: I mjukagarversionen av MLA erhålls antalet kolonier på plattan för mutanturvalet (CM) och antalet kolonier på plattan för icke utvalda kolonier eller kloningseffektivitet (viabilitetsräkning) (CV) genom att klonerna räknas direkt. När 600 celler överförs för kloningseffektivitet (CE) till plattorna för mutanturvalet (CEM) och plattorna för icke utvalda kolonier eller kloningseffektivitet (viabilitetsräkning) (CEV) och 3 x 106 celler används för mutanturval,

CEM = CM / (3 x 106) = (CM / 3) x 10-6

CEV = CV / 600

Mikrotiterversionen av MLA och TK6: I mikrotiterversionen av MLA CM och CV bestäms som produkten av det totala antalet hål (TW) och det förmodade antalet kolonier per hål (P) på mikrotiterplattorna.

CM = PM x TWM

CV = PV x TWV

Från nolltermen i Poissonfördelningen (Furth et al., 1981), P ges genom

P = - ln (EW / TW)

där EW är tomma hål och TW totalt antal hål. Därför

CEM = CM / TM = (PM x TWM) / TM

CEV = CV / TV = (PV x TWV) / TV

För mikrotiterversionen av MLA beräknas mutantfrekvenserna för små och stora kolonier på samma sätt, med användning av antalet tomma hål för små och stora kolonier.

För TK6 baseras mutantfrekvenserna för små och stora kolonier på tidigt och sent uppträdande mutanter.

Tillägg

DEFINITIONER

Tillägg 1

DEFINITIONER

Tillägg 2

HUVUDSAKLIGA DELAR I DE RHCE-TESTER SOM HAR VALIDERATS FÖR IDENTIFIERING AV KEMIKALIER SOM INTE KRÄVER KLASSIFICERING ELLER MÄRKNING FÖR ÖGONIRRITATION ELLER ALLVARLIG ÖGONSKADA

Testdelar | EpiOcular™ EIT (VRM1) | SkinEthic™ HCE EIT (VRM2)

Protokoll | Vätskor (pipetterbara vid 37 ± 1°C eller lägre temperaturer under 15 min.) | Ämnen i fast form (ej pipetterbara) | Vätskor och viskösa ämnen (pipetterbara) | Ämnen i fast form (ej pipetterbara)

Modellyta | 0,6 cm2 | 0,6 cm2 | 0,5 cm2 | 0,5 cm2

Antal vävnadsreplikat | Minst två | Minst två | Minst två | Minst två

Förkontroll av eventuell färginterferens | 50 μl + 1 ml H2O i 60 min. vid 37 ± 2 °C, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % relativ luftfuktighet (ofärgade testkemikalier), eller 50 μl + 2 ml isopropanol blandade i 2–3 timmar vid rumstemperatur (färgade testkemikalier) om testkemikaliens OD vid 570 ± 20 nm, efter subtraktion av OD för isopropanol eller vatten är > 0,08 (vilket motsvarar ungefär 5 % av den negativa kontrollens genomsnittliga OD-värde), bör anpassade kontroller med levande vävnad genomföras. | 50 mg + 1 ml H2O i 60 min. vid 37 ± 2 °C, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % relativ luftfuktighet (ofärgade testkemikalier), och/eller 50 mg + 2 ml isopropanol blandade i 2–3 timmar vid rumstemperatur (färgade och ofärgade testkemikalier) om testkemikaliens OD vid 570 ± 20 nm, efter subtraktion av OD för isopropanol eller vatten, är > 0,08 (vilket motsvarar ungefär 5 % av den negativa kontrollens genomsnittliga OD-värde), bör anpassade kontrolltester med levande vävnad genomföras. | 10 μl + 90 μl H2O blandade i 30 ± 2 min. vid rumstemperatur (RT, 18–28 °C) om testkemikalien är färgad, bör anpassade kontroller med levande vävnad genomföras | 10 mg + 90 μl H2O blandade i 30 ± 2 min. vid rumstemperatur om testkemikalien är färgad, bör anpassade kontroller med levande vävnad genomföras

Förkontroll av eventuell direkt MTT-reduktion | 50 μl + 1 ml av 1 mg/ml MTT-lösning under 180 ± 15 min. vid 37 ± 2 °C, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % relativ luftfuktighet om lösningen blir blå/lila, bör anpassade kontroller med frysdödad vävnad utföras (50 μl sterilt avjoniserat vatten i MTT-lösning används då som negativ kontroll) | 50 mg + 1 ml av 1 mg/ml MTT-lösning under 180 ± 15 min. vid 37 ± 2 °C, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % relativ luftfuktighet om lösningen blir blå/lila, bör anpassade kontrolltester med frysdödad vävnad utföras (50 μl sterilt avjoniserat vatten i MTT-lösning används då som negativ kontroll) | 30 μl + 300 μl av 1 mg/ml MTT-lösning i 180 ± 15 min. vid 37 ± 2 °C, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % relativ luftfuktighet om lösningen blir blå/lila, bör anpassade kontroller med vattendödad vävnad utföras (30 μl sterilt avjoniserat vatten i MTT-lösning används då som negativ kontroll) | 30 mg + 300 μl av 1 mg/ml MTT-lösning i 180 ± 15 min. vid 37 ± 2 °C, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % relativ luftfuktighet om lösningen blir blå/lila, bör anpassade kontroller med vattendödad vävnad utföras (30 μl sterilt avjoniserat vatten i MTT-lösning används då som negativ kontroll)

Förbehandling | 20 μl Ca2+/Mg2+-fri DPBS i 30 ± 2 min. vid 37 ± 2 oC, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % relativ luftfuktighet, skyddad från ljus. | 20 μl Ca2+/Mg2+-fri DPBS i 30 ± 2 min. vid 37 ± 2 °C, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % relativ luftfuktighet, skyddad från ljus. | — | —

Behandlingsdoser och applicering | 50 μl (83,3 μl/cm2) | 50 mg (83,3 mg/cm2) | 10 μl Ca2+/Mg2+-fri DPBS + 30 ± 2 μl (60 μl/cm2) För viskösa ämnen, använd ett nylonnät | 30 μl Ca2+/Mg2+-fri DPBS + 30 ± 2 mg (60 mg/cm2)

Exponering, tid och temperatur | 30 min. (± 2 min.) i odlingsmedium vid 37 ± 2 °C, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % relativ luftfuktighet | 6 timmar (± 0,25 timmar) i odlingsmedium vid 37 ± 2 °C, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % relativ luftfuktighet | 30 min. (± 2 min.) i odlingsmedium vid 37 ± 2 °C, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % relativ luftfuktighet | 4 timmar (± 0,1 timmar) i odlingsmedium vid 37 ± 2 °C, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % relativ luftfuktighet

Sköljning vid rumstemperatur | 3 gånger i 100 ml Ca2+/Mg2+-fri DPBS | 3 gånger i 100 ml Ca2+/Mg2+-fri DPBS | 20 ml Ca2+/Mg2+-fri DPBS | 25 ml Ca2+/Mg2+-fri DPBS

Nedsänkning efter exponering | 12 min. (± 2 min.) vid rumstemperatur i odlingsmedium | 25 min. (± 2 min.) vid rumstemperatur i odlingsmedium | 30 min. (± 2 min.) vid 37 °C, 5 % CO2, 95 % relativ luftfuktighet, i odlingsmedium | 30 min. (± 2 min.) vid rumstemperatur i odlingsmedium

Inkubation efter exponering | 120 min. (± 15 min.) i odlingsmedium vid 37 ± 2 °C, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % relativ luftfuktighet | 18 timmar (± 0,25 timmar) i odlingsmedium vid 37 ± 2 °C, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % relativ luftfuktighet | Ingen | 18 timmar (± 0,5 h) i odlingsmedium vid 37 ± 2 °C, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % relativ luftfuktighet

Negativ kontroll | 50 μl H2O Testas parallellt | 50 μl H2O Testas parallellt | 30 ± 2 μl Ca2+/Mg2+-fri DPBS Testas parallellt | 30 ± 2 μl Ca2+/Mg2+-fri DPBS Testas parallellt

Positiv kontroll | 50 μl metylacetat Testas parallellt | 50 μl metylacetat Testas parallellt | 30 ± 2μl metylacetat Testas parallellt | 30 ± 2μl metylacetat Testas parallellt

MTT-lösning | 300 μl 1 mg/ml | 300 μl 1 mg/ml | 300 μl 1 mg/ml | 300 μl 1 mg/ml

MTT-inkubation, tid och temperatur | 180 min. (± 15 min.) vid 37 ± 2 °C, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % relativ luftfuktighet | 180 min. (± 15 min.) vid 37 ± 2 °C, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % relativ luftfuktighet | 180 min. (± 15 min.) vid 37 ± 2 °C, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % relativ luftfuktighet | 180 min. (± 15 min.) vid 37 ± 2 °C, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % relativ luftfuktighet

Extraktionsmedel | 2 ml isopropanol (extraktion från iläggets topp och botten genom att sticka hål på vävnaden) | 2 ml isopropanol (extraktion av iläggets botten genom att sticka hål på vävnaden) | 1,5 ml isopropanol (extraktion från iläggets topp och botten) | 1,5 ml isopropanol (extraktion av iläggets botten)

Extraktion, tid och temperatur | 2–3 timmar med skak (~120 rpm) vid rumstemperatur eller över natt vid 4–10 °C | 2–3 timmar med skak (~120 rpm) vid rumstemperatur eller över natt vid 4–10 °C | 4 timmar med skak (~120 rpm) vid rumstemperatur eller åtminstone över natt utan skak vid 4–10 °C | Minst 2 timmar med skak (~120 rpm) vid rumstemperatur

Avläsning av optisk densitet | 570 nm (550–590 nm) utan referensfilter | 570 nm (550–590 nm) utan referensfilter | 570 nm (540–600 nm) utan referensfilter | 570 nm (540–600 nm) utan referensfilter

Kvalitetskontroll av vävnaden | Behandling med 100 μl 0,3-volymprocentig Triton X-100 12,2 min. ≤ ET50 ≤ 37,5 min. | Behandling med 100 μl 0,3-volymprocentig Triton X-100 12,2 min. ≤ ET50 ≤ 37,5 min. | 30 min. behandling med SDS (50 μl) 1,0 mg/ml ≤ IC50 ≤ 3,5 mg/ml | 30 min. behandling med SDS (50 μl) 1,0 mg/ml ≤ IC50 ≤ 3,2 mg/ml

Acceptanskriterier | 1. Genomsnittligt OD-värde för de vävnadsreplikat som behandlats med negativ kontroll ska vara > 0,8 och < 2,5. 2. Genomsnittlig viabilitet hos de vävnadsreplikat som exponerats för positiv kontroll under 30 min, uttryckt i procent av negativ kontroll, ska vara < 50 %. 3. Skillnaden i viabilitet mellan två vävnadsreplikat ska vara mindre än 20 %. | 1. Genomsnittligt OD-värde för de vävnadsreplikat som behandlats med negativ kontroll ska vara > 0,8 och < 2,5. 2. Genomsnittlig viabilitet hos de vävnadsreplikat som exponerats för positiv kontroll under 6 timmar, uttryckt i procent av negativ kontroll, ska vara < 50 %. 3. Skillnaden i viabilitet mellan två vävnadsreplikat ska vara mindre än 20 %. | 1. Genomsnittligt OD-värde för de vävnadsreplikat som behandlats med negativ kontroll ska vara > 1,0 och ≤ 2,5. 2. Genomsnittlig viabilitet hos de vävnadsreplikat som exponerats för positiv kontroll under 30 min, uttryckt i procent av negativ kontroll, ska vara ≤ 30 %. 3. Skillnaden i viabilitet mellan två vävnadsreplikat ska vara mindre än 20 %. | 1. Genomsnittligt OD-värde för de vävnadsreplikat som behandlats med negativ kontroll ska vara > 1,0 och ≤ 2,5. 2. Genomsnittlig viabilitet hos de vävnadsreplikat som exponerats för positiv kontroll under 4 timmar, uttryckt i procent av negativ kontroll, ska vara ≤ 20 %. 3. Skillnaden i viabilitet mellan två vävnadsreplikat ska vara mindre än 20 %.

Tillägg 3

ILLUSTRERANDE FLÖDESSCHEMA SOM GER VÄGLEDNING I HUR MAN IDENTIFIERAR OCH HANTERAR DIREKT MTT-REDUCERANDE ÄMNEN OCH/ELLER FÄRGINTERFERERANDE KEMIKALIER, BASERAT PÅ STANDARDFÖRFARANDET FÖR VRM1

Tillägg 4

ILLUSTRERANDE FLÖDESSCHEMA SOM GER VÄGLEDNING I HUR MAN IDENTIFIERAR OCH HANTERAR DIREKT MTT-REDUCERANDE ÄMNEN OCH/ELLER FÄRGINTERFERERANDE KEMIKALIER, BASERAT PÅ STANDARDFÖRFARANDET FÖR VRM2

Tillägg 5

NYCKELPARAMETRAR OCH ACCEPTANSKRITERIER FÖR KVALIFICERING AV ETT SPEKTROFOTOMETRISKT HPLC-/UPLC-SYSTEM FÖR MÄTNING AV MTT-FORMAZAN EXTRAHERAD FRÅN RHCE-VÄVNAD

Parameter | Protokoll baserat på FDA-vägledning (36) (38) | Acceptanskriterier

Selektivitet | Analys av isopropanol, levande blankprov (isopropanolextrakt från levande RhCE-vävnad utan någon behandling), dött blankprov (isopropanolextrakt från avdödad RhCE-vävnad utan någon behandling), och av ett färgämne (t.ex. metylenblått) | Areainterference ≤ 20 % av areaLLOQ

Precision | Kvalitetskontroller (dvs. MTT-formazan vid 1,6 μg/ml, 16 μg/ml och 160 μg/ml) i isopropanol (n = 5) | CV ≤ 15 % eller ≤ 20 % för LLOQ

Noggrannhet | Kvalitetskontroller i isopropanol (n = 5) | % Dev ≤ 15 % eller ≤ 20 % för LLOQ

Matriseffekt | Kvalitetskontroller i levande blankprov (n = 5) | 85 % ≤ % matriseffekt ≤ 115 %

Överföring | Analys av isopropanol mot en ULOQ-standard | Areainterference ≤ 20 % av areaLLOQ

Reproducerbarhet (mellan dagar) | Dag 1: En kalibreringskurva och kvalitetskontroller i isopropanol (n = 3) Dag 2: En kalibreringskurva och kvalitetskontroller i isopropanol (n = 3) Dag 3: En kalibreringskurva och kvalitetskontroller i isopropanol (n = 3)

Kortidsstabilitet för MTT-formazan i RhCE-vävnadsextrakt | Kvalitetskontroller i levande blankprov (n = 3), analyserade på beredningsdagen och efter 24 timmars förvaring i rumstemperatur | % Dev ≤ 15 %

Långtidsstabilitet för MTT-formazan i RhCE-vävnadsextrakt, om det krävs | Kvalitetskontroller i levande blankprov (n = 3), analyserade på beredningsdagen och efter några dygns förvaring i –20 °C | % Dev ≤ 15 %

1 LLOQ Nedre kvantifieringsgräns (Lower Limit of Quantification) fastställd att täcka 1–2 % vävnadsviabilitet, det vill säga 0,8 μg/ml.

2 ULOQ Övre kvantifieringsgräns (Upper Limit of Quantification) fastställd att åtminstone vara två gånger högre än den högsta förväntade MTT-formazan-koncentrationen i isopropanolextrakt från negativa kontroller (~70 μg/ml i VRM), det vill säga 200 μg/ml.

Tillägg 1

DEFINITIONER OCH FÖRKORTNINGAR

Tillägg 2

FREYBERGER-WILSONS IN VITRO-TESTER AV MÄTTNAD HOS RESPEKTIVE KOMPETITIV BINDNING TILL ÖSTROGENRECEPTOR (ERΑ) MED REKOMBINANT FULLÄNGDS-ERΑ

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR (SE ÄVEN ALLMÄN INLEDNING)

1. I detta in vitro-test av mättnad hos och kompetitiv bindning till östrogenreceptor (ERα) används human fullängds-ERαα-receptor (hrERα) som produceras i och isoleras från bakulovirusinfekterade insektsceller. Protokollet, som utvecklades av Freyberger och Wilson, prövades i en internationell valideringsstudie som involverade flera laboratorier (2) och vilken visade dess relevans och pålitlighet för det avsedda syftet.

2. Detta test är ett screeningförfarande för att identifiera ämnen som kan binda till fullängds-hrERα. Det används för att fastställa en testkemikalies förmåga att konkurrera med 17β-östradiol om att binda till hrERα. Kvantitativa testresultat kan omfatta IC50 (ett mått på den koncentration av testkemikalie som behövs för att tränga bort hälften av [3H]-17β-östradiolen från hrERα) och testkemikaliernas relativa bindningsaffiniteter för hrERα, jämförda med den hos 17β-östradiol. För kemisk screening kan godtagbara kvalitativa testresultat omfatta klassificeringar av testkemikalier som antingen hrERα-bindare, icke-bindare eller tvetydiga, utifrån de kriterier som beskrivits för bindningskurvorna.

3. Testet använder en radioaktiv ligand, vilket kräver att laboratoriet har licens för att hantera radioaktiva material. Allt handhavande av radioisotoper och farliga kemikalier ska följa de regelverk och rutiner som föreskrivs av nationell lagstiftning.

4. Läs ALLMÄN INLEDNING och hrER-BINDNINGSTESTETS DELAR innan testet används för tillsynsändamål. Definitioner och förkortningar som används i denna testriktlinje beskrivs i tillägg 1.

TESTETS PRINCIP (SE ÄVEN ALLMÄN INLEDNING)

5. Bindningstestet med hrERα mäter förmågan hos radioaktivt inmärkt ligand ([3H]-17β-östradiol) att binda till ER i närvaron av ökande koncentrationer av testkemikalie (dvs. konkurrerande ligand). Testkemikalier med hög affinitet för ER konkurrerar med den radioaktivt inmärkta liganden vid en lägre koncentration än de kemikalier som har lägre affinitet för receptorn.

6. Detta test består av två huvuddelar: ett mättnadsbindningsexperiment för att karakterisera receptor–ligandinteraktionsparametrar, följt av ett kompetitivt bindningsexperiment som karakteriserar konkurrensen mellan en testkemikalie och en radioaktivt inmärkt ligand vid inbindning till ER.

7. Mättnadsbindningsexperimentets syfte är att inför det kompetitiva bindningsexperimentet karakterisera en receptorsats med avseende på bindningsaffinitet och antal receptorer. Mättnadsbindningsexperimentet mäter, vid jämviktsförhållanden och en fast receptorkoncentration, östrogenreceptorns affinitet för dess naturliga ligand (mätt som dissociationskonstant, Kd) och koncentrationen av aktiva bindningsplatser (Bmax).

8. Det kompetitiva bindningsexperimentet mäter benägenheten hos ett ämne att konkurrera med [3H]-17β-östradiol om att binda till ER. Affiniteten kvantifieras genom koncentrationen av testkemikalie som, vid jämvikt, hämmar 50 % av den specifika bindningen av [3H]-17β-östradiol (kallad hämmande koncentration 50 %, eller IC50). Detta kan också utvärderas med hjälp av den relativa bindningsaffiniteten (RBA, affiniteten jämförd med IC50 för östradiol som mäts separat i samma testomgång). Det kompetitiva bindningsexperimentet mäter bindningen av [3H]-17β-östradiol vid en fast koncentration i närvaron av ett stort intervall (åtta tiopotenser) av testkemikaliekoncentrationer. Data anpassas sedan, där så är möjligt, till en form av Hill-ekvationen (Hill, 1910) som beskriver bortträngningen av den radioaktivt märkta liganden av en kompetitiv bindare som binder till en bindningsplats. Den utsträckning i vilken den radioaktivt inmärkta östradiolen trängs bort vid jämvikt används för att karakterisera testkemikalien som en bindare, en icke-bindare eller med tvetydig respons.

FÖRFARANDE

Fastställande av acceptabel proteinfunktion hos hrERα

Tabell 1 Prestandakriterier framtagna för referensöstrogen och svag bindare, FW-hrER-bindningstest

Ämne | Parameter | Medelvärde | Standardavvikelse (n) | 95 % konfidensintervall

Nedre gräns | Övre gräns

17β-östradiol. | Topp (%) | 100,44 | 10,84 (67) | 97,8 | 103,1

Botten (%) | 0,29 | 1,25 (67) | –0,01 | 0,60

Hill-koefficient (Hill slope) | –1,06 | 0,20 (67) | –1,11 | –1,02

Log(IC50) (M) | –8,92 | 0,18 (67) | –8,97 | –8,88

Noretynodrel | Topp (%) | 99,42 | 8,90 (68) | 97,27 | 101,60

Botten (%) | 2,02 | 3,42 (68) | 1,19 | 2,84

Hill-koefficient (Hill slope) | –1,01 | 0,38 (68) | –1,10 | –0,92

Log(IC50) (M) | –6,39 | 0,27 (68) | –6,46 | –6,33

Noretindron | Topp (%) | 96,14 | 8,44 (27) | 92,80 | 99,48

Botten (%) | 2,38 | 5,02 (27) | 0,40 | 4,37

Hill-koefficient (Hill slope) | –1,41 | 0,32 (27) | –1,53 | –1,28

Log(IC50 ) (M) | –5,73 | 0,27 (27) | –5,84 | –5,62

Demonstration av laboratoriets kompetens

10. Se punkterna 17 och 18 och tabell 2 i hrER-BINDNINGSTESTETS DELAR i denna testmetod. Varje test (mättnad och kompetitiv bindning) ska bestå av tre oberoende testomgångar (dvs. med nya spädningar av receptor, kemikalier och reagens) på olika dagar och varje omgång ska innehålla tre replikat.

Bestämning av hrERα-koncentration

11. Koncentrationen av aktiv receptor varierar något mellan satser och med förvaringsförhållanden. Därför ska koncentrationen av aktiv receptor som erhållits från leverantören fastställas. Detta ger tillämplig koncentration av aktiv receptor när testomgången ska göras.

12. Under förhållanden som motsvarar kompetitiv bindning (dvs. 1 nM [3H]-östradiol), ska nominella koncentrationer om 0,25, 0,5, 0,75, respektive 1 nM receptor inkuberas i frånvaro (total bindning) och närvaro (icke-specifik bindning) av 1 μM ej inmärkt östradiol. Specifik bindning, beräknad som differensen av total och icke-specifik bindning, ritas i ett diagram mot den nominella receptorkoncentrationen. Den receptorkoncentration som ger specifika bindningsvärden motsvarande 20 % av tillsatt radioaktivt inmärkt ligand relateras till motsvarande nominella receptorkoncentration, och denna ska användas vid tester av mättnad och kompetitiv bindning. Ofta överensstämmer en slutlig hrER-koncentration på 0,5 nM med detta förhållande.

13. Om 20-procentskriteriet vid upprepade försök inte kan uppfyllas ska experimentets uppställning kontrolleras för möjliga fel. Svårigheter att uppnå 20-procentskriteriet kan indikera att det finns väldigt lite aktiv receptor i satsen av rekombinant receptor och man bör då överväga att använda en annan sats.

Mättnadstest

14. Åtta ökande koncentrationer av [3H]-17β-östradiol ska utvärderas i tripletter, enligt följande tre betingelser (se tabell 2): I frånvaron av ej inmärkt 17β-östradiol och närvaro av ER. Här fastställs total bindning genom att mäta radioaktiviteten i de brunnar som enbart innehåller [3H]-17β-östradiol. I närvaron av 1000 gångers koncentrationsöverskott av ej inmärkt 17β-östradiol över inmärkt 17β-östradiol och närvaro av ER. Avsikten med denna betingelse är att mätta de aktiva bindningsplatserna med ej inmärkt 17β-östradiol och, genom att mäta radioaktiviteten i brunnarna, fastställa den icke-specifika bindningen. Eventuellt kvarvarande radioaktiv östradiol som kan binda till receptorn anses binda till en icke-specifik bindningsplats eftersom den tillsatta icke-radioaktiva östradiolen ska ha så hög koncentration att den har bundit till alla specifika bindningsplatser på receptorn. I frånvaro av ej inmärkt 17β-östradiol och frånvaro av ER (fastställande av total radioaktivitet).

Beredning av lösningar med [3H]-17β-östradiol respektive ej inmärkt 17β-östradiol

15. Spädningar av [3H]-17β-östradiol ska beredas genom att tillsätta testbuffert till en 12 nM stamlösning av [3H]-17β-östradiol för att få koncentrationer som initialt sträcker sig från 0,12 nM till 12 nM. Genom att tillsätta 40 μl av dessa lösningar till respektive testbrunnar i en 96-hålsmikrotiterplatta (till en slutvolym på 160 μl) erhålls slutliga testkoncentrationer på 0,03–3,0 nM. Beredning av testbuffert, stamlösning med [3H]-17β-östradiol samt spädningar och fastställande av koncentrationer beskrivs i detalj i FW-protokollet (2).

16. Spädningar av etanolinnehållande 17β-östradiollösningar ska beredas genom att tillsätta testbuffert och på så sätt erhålla åtta ökande koncentrationer, initialt från 0,06 μM till 6 μM. Genom att tillsätta 80 μl av dessa lösningar till respektive testbrunn i en 96-hålsmikrotiterplatta (till en slutvolym på 160 μl) erhålls slutliga testkoncentrationer på 0,03–3 μM. Slutkoncentrationen av ej inmärkt 17β-östradiol i de olika icke-specifika bindningstestbrunnarna bör vara 1000 gånger högre än koncentrationen av [3H]-17β-östradiol. Beredning av spädningar av ej inmärkt 17β-östradiol beskrivs i detalj i FW-protokollet (2).

17. Den nominella receptorkoncentration som ger specifik bindning av 20 ± 5 % bör användas (se punkterna 12–13). Lösningen med hrERα ska beredas omedelbart före användning.

18. Förbered 96-hålsmikrotiterplattorna enligt schema i tabell 2, med tre replikat per koncentration. Exempel på fördelning över plattan av koncentrationer och volymer av [3H]-17β-östradiol, ej inmärkt 17β-östradiol, buffert och receptor ges i tillägg 2.2.

Tabell 2 Upplägg för mikrotiterplatta till mättnadsbindningstest

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12

B | 0,30 nM [3H]E2 + ER | 0,60 nM [3H]E2 + ER | 1,0 nM [3H]E2 + ER | 3,0 nM [3H]E2 + ER

E | 0,30 nM [3H]E2 + ER + 0,30 μM E2 | 0,60 nM [3H]E2 + ER + 0,60 μM E2 | 1,0 nM [3H]E2 + ER + 1,0 μM E2 | 3,0 nM [3H]E2 + ER + 3,0 μM E2

19. Testmikrotiterplattor bör inkuberas på horisontellt cirkulerande skak vid 2–8 °C i 16–20 timmar.

Mätning av [3H]-17β-östradiol bunden till hrERα

20. Den [3H]-17β-östradiol som är bunden till hrERα ska separeras från fri [3H]-17β-östradiol genom tillsats av 80 μl kall DCC-suspension till varje brunn, plattorna skakas sedan i 10 minuter och centrifugeras i 10 minuter med ungefär 2500 varv per minut. För att minimera dissociationen av den bundna [3H]-17β-östradiolen från hrERα under denna procedur är det extremt viktigt att buffertarna och testbrunnarna håller en temperatur mellan 2 och 8 °C och att varje steg utförs snabbt. En skakapparat för mikrotiterplattor är nödvändig för snabb och effektiv hantering av plattorna.

21. Sedan tas 50 μl supernatant innehållande den hrERα-bundna [3H]-17β-östradiolen, men extremt försiktigt så att man inte råkar förorena brunnarna genom att vidröra DCC, och placeras i en andra mikrotiterplatta.

22. Sedan tillsätts 200 μl scintillationsvätska, som kan omvandla den nukleära strålningens rörelseenergi till ljus, till varje brunn (A1–B12 och D1–E12). Brunnarna G1–H12 (kvantifieras i totala dpm) utgör en seriespädning av [3H]-17β-östradiol (40 μl) som ska överföras direkt till scintillationsvätskan i mätplattans brunnar enligt tabell 3, dvs. dessa brunnar innehåller endast 200 μl scintillationsvätska och korrekt spädning av [3H]-17β-östradiol. Dessa mätningar visar, i dpm, hur mycket [3H]-17β-östradiol som tillsattes till varje uppsättning brunnar för total bindning och icke-specifik bindning.

Tabell 3 Upplägg av mikrotiterplatta vid mättnadsbindningstest, mätning av radioaktivitet

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12

B | 0,30 nM [3H]E2 + ER | 0,60 nM [3H]E2 + ER | 1,0 nM [3H]E2 + ER | 3,0 nM [3H]E2 + ER

E | 0,30 nM [3H]E2 + ER + 0,30 μM E2 | 0,60 nM [3H]E2 + ER + 0,60 μM E2 | 1,0 nM [3H]E2 + ER + 1,0 μM E2 | 3,0 nM [3H]E2 + ER + 3,0 μM E2

H | 0,30 nM [3H]E2 | 0,60 nM [3H]E2 | 1,0 nM [3H]E2 | 3,0 nM [3H]E2

23. Mätningarna ska starta med en fördröjning om minst 2 timmar och varje brunn ska mätas i 40 minuter. En scintillationsräknare för mikrotiterplattor bör användas för att fastställa dpm/brunn med korrigering för quenching. Om en scintillationsräknare för mikrotiterplattor inte finns att tillgå kan proverna mätas i en traditionell räknare. Under sådan förhållanden kan man överväga en kortare mättid.

Kompetitivt bindningstest

24. Det kompetitiva bindningstestet mäter bindningen av [3H]-17β-östradiol vid en viss koncentration i närvaro av ökande koncentration av testkemikalie. Tre parallella replikat bör användas för varje koncentration i varje testomgång. Dessutom bör tre icke-parallella testomgångar utföras för varje testad kemikalie. Testet bör utföras i en eller flera 96-hålsmikrotiterplattor.

Kontroller

25. Varje experiment ska inkludera parallella lösningsmedelprover och kontroller (dvs. referensöstrogen, svag bindare och icke-bindare). Fullständiga koncentrationskurvor för östrogenreferens och kontroller (dvs. svag bindare resp. icke-bindare) ska placeras i en platta vid varje testomgång. Alla andra plattor ska innehålla: i) en hög (maximal bortträngning) respektive medelhög (ungefär IC50) koncentration av E2 respektive svag bindare i tripletter, ii) lösningsmedelskontroll och icke-specifik bindning, båda som tripletter. Förfaranden för beredning av testbuffert, kontroller [3H]-17β-östradiol, hrERα och testkemikalielösningar beskrivs i referens 2 (bilaga K, se FW Assay Protocol).

Lösningsmedelskontroll

26. Lösningsmedelskontrollen indikerar att lösningsmedlet inte interagerar med testsystemet och mäter också total bindning (TB). Etanol är det mest lämpliga lösningsmedlet. Men om testkemikaliens högsta koncentration inte är löslig i etanol kan DMSO användas. Koncentrationen av etanol, eller DMSO om det används, blir 1,5 % i det slutliga testbrunnarna och får inte överstiga 2 %.

Buffertkontroll

27. Buffertkontrollen (BC) ska inte innehålla vare sig lösningsmedel eller testkemikalie men testets alla övriga ingående delar. Resultaten för buffertkontrollen jämförs med lösningsmedelskontrollen för att säkerställa att det valda lösningsmedlet inte påverkar testsystemet.

Stark bindare (referensöstrogen)

28. Den endogena liganden är 17β-östradiol (CAS-nr 50-28-2) och den binder med hög affinitet till alfa-subtypen av ER. En standardkurva med ej inmärkt 17β-östradiol ska upprättas för varje kompetitivt hrERα-bindningstest, för att möjliggöra en bedömning av variationen när testet, över tid, upprepas i samma laboratorium. Åtta lösningar av ej inmärkt 17β-östradiol ska beredas i etanol, med koncentrationer i testbrunnarna som sträcker sig från 100 nM–10 pM (–7[logM] till –11[logM]), med följande spridning (–7[logM], –8[logM], –8,5[logM], –9[logM], –9,5[logM], –10[logM], –11[logM]). Den högsta koncentrationen av ej inmärkt 17β-östradiol (1 μM) indikerar också icke-specifik bindning. Denna koncentration markeras med märkningen NSB i tabell 4 även om den också är en del av standardkurvan.

Svag bindare

29. En svag bindare (noretynodrel [CAS-nr 68-23-5] eller noretindron [CAS-nr 68-22-4]) bör inkluderas för att påvisa varje experiments känslighet och möjliggöra en bedömning av variation när testet används längre perioder. Åtta lösningar av den svaga bindaren ska beredas i etanol, med koncentrationer i testbrunnarna som sträcker sig från 3 nM till 30 μM (–8,5[logM] till –4,5logM]), med följande spridning: –4,5[logM], –5[logM], –5,5[logM], –6[logM], –6,5[logM], –7[logM], –7,5[logM], –8,5[logM].

Icke-bindare

30. Oktyltrietoxisilan (OTES, CAS-nr 2943-75-1) ska användas som negativ kontroll (icke-bindare). Den ger återkoppling om att testet, så som det utförs, detekterar när testkemikalier inte binder till hrERα. Åtta lösningar av icke-bindaren ska beredas i etanol, med koncentrationer som i testbrunnarna sträcker sig, i tiopotenssteg, från 0,1 nM–1000 μM (–10[logM] till –3[logM]). Di-n-butylftalat (DBP) kan användas som en alternativ icke-bindare-kontroll. Dess maximala löslighet har visats vara –4[logM].

hrERα-koncentration

31. Den mängd receptor som ger en specifik bindning på 20 ± 5 % av 1 nM radioaktivt märkt ligand bör användas (se punkterna 12–13 i tillägg 2). Lösningen med hrERα ska beredas omedelbart före användning.

[3H]-17β-östradiol.

32. Koncentrationen för [3H]-17β-östradiol i testbrunnarna bör vara 1,0 nM.

Testkemikalier

33. Vid det första tillfället är det nödvändigt att genomföra ett löslighetstest för att fastställa löslighetsgränsen för varje testkemikalie och för att identifiera lämpligt koncentrationsintervall att använda sig av under testet. Samtliga testkemikaliers respektive löslighetsgräns i lösningsmedlet ska fastställas initialt och vidare bekräftas under testbetingelser. Den slutkoncentration som används i testet ska inte överstiga 1 mM. Intervallsökningen görs med en lösningsmedelskontroll och åtta logaritmiska seriespädningar, där man börjar med maximal acceptabel koncentration (t.ex. 1 mM eller lägre, baserat på löslighetsgräns), och närvaron av grumlighet eller fällning (se också punkt 35). Testkemikalien ska testas med 8 koncentrationskurvor med logaritmisk spridning utifrån fynden i det föregående intervallsökningstestet. Koncentrationer i det andra och tredje experimenten bör anpassas för en bättre karakterisering av koncentration–responskurvan.

34. Spädningar av testkemikalien ska beredas i lämpligt lösningsmedel (se punkt 26 i tillägg 2). Om testkemikaliens högsta koncentration inte är löslig i vare sig etanol eller DMSO, och en tillsats av mer lösningsmedel skulle göra att koncentrationen av lösningsmedel i det slutliga provröret överskred den godtagbara gränsen, kan den högsta koncentrationen sänkas till nästa lägre koncentration. I sådana fall kan ytterligare en koncentration läggas till i den lägre änden av koncentrationsserien. Övriga koncentrationer i serien bör förbli oförändrade.

35. Testkemikalielösningarna ska iakttas noggrant vid tillsatsen till testbrunnen, eftersom testkemikalien kan fälla ut i detta steg. Data för alla brunnar som innehåller en fällning ska uteslutas från kurvanpassning och anledningen till uteslutningen av data noteras.

36. Om det sedan tidigare från andra källor finns information som tillhandahåller ett log(IC50)-värde för en testkemikalie, kan det vara lämpligt att geometriskt sprida spädningarna (dvs. 0,5 log-enheter runt det förväntade log[IC50]-värdet). Slutresultatet bör återspegla tillräcklig spridning av koncentrationer på båda sidor av log(IC50)-värdet, inklusive topp och botten, så att bindningskurvan kan karakteriseras tillfredsställande.

Organisering av testplattor

37. Märkta mikrotiterplattor ska beredas för sexfaldiga inkubationer med koder för lösningsmedelskontrollen, den högsta koncentrationen av referensöstrogen som också tjänar som indikator på icke-specifik bindning (NSB), och buffertkontrollen, samt för inkubation i tripletter med koder för var och en av de åtta koncentrationerna för icke-bindande kontroll (oktyltrietoxisilan), de sju lägre koncentrationerna av referensöstrogen, de åtta koncentrationsnivåerna för svag bindare och de åtta koncentrationerna av varje testkemikalie (TC). Ett exempel på upplägget av plattschemat för fullständiga koncentrationskurvor för referensöstrogen och kontroll ges nedan i tabell 4. Ytterligare mikrotiterplattor används för testkemikalierna och ska inkludera plattkontroller, dvs. 1) en hög koncentration (maximal bortträngning) och en mellankoncentration (ungefär IC50) av vardera E2 och svag bindare i tripletter, 2) lösningsmedelskontroll och icke-specifik bindning, båda sexfalt (tabell 5). Ett exempel på plattupplägg för ett kompetitivt test med tre okända testkemikalier ges i tillägg 2.3. De koncentrationer som anges i tabellerna 4 och 5 är testets slutkoncentrationer. Maximal koncentration för E2 ska vara 1 × 10-7 M och för den svaga bindaren bör den högsta koncentrationen som används för den svaga bindaren på platta 1 användas. Laboratoriet ska fastställa IC50 med hjälp av sin historiska kontrolldatabas. Detta värde kan förväntas vara jämförbart med det som iakttagits i valideringsstudierna (se tabell 1).

Tabell 4 Upplägg för mikrotiterplatta till kompetitivt bindningstest, fullständiga koncentrationskurvor för referensöstrogen och kontroller (platta 1)

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12

A | TB (endast lösningsmedel) | TB (endast lösningsmedel) | NSB | NSB

B | E2 (1 × 10-7) | E2 (1 × 10-8) | E2 (1 × 10-8,5) | E2 (1 × 10-9)

C | E2 (1 × 10-9,5) | E2 (1 × 10-10) | E2 (1 × 10-11) | Blankprov

D | NE (1 × 10-4,5) | NE (1 × 10-5) | NE (1 × 10-5,5) | NE (1 × 10-6)

E | NE (1 × 10-6,5) | NE (1 × 10-7) | NE (1 × 10-7,5) | NE (1 × 10-8,5)

F | OTES (1 × 10-3) | OTES (1 × 10-4) | OTES (1 × 10-5) | OTES (1 × 10-6)

G | OTES (1 × 10-7) | OTES (1 × 10-8) | OTES (1 × 10-9) | OTES (1 × 10-10)

H | Blankprov (radioaktivitet) | Blankprov (radioaktivitet) | Buffertkontroll | Buffertkontroll

Tabell 5 Upplägg för mikrotiterplatta till kompetitivt bindningstest, fullständiga koncentrationskurvor för testkemikalier och plattkontroller

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12

A | TB (endast lösningsmedel) | TB (endast lösningsmedel) | NSB | NSB

B | TC1 (1 × 10-3) | TC1 (1 × 10-4) | TC1 (1 × 10-5) | TC1 (1 × 10-6)

C | TC1 (1 × 10-7) | TC1 (1 × 10-8) | TC1 (1 × 10-9) | TC1 (1 × 10-10)

D | TC2 (1 × 10-3) | TC2 (1 × 10-4) | TC2 (1 × 10-5) | TC2 (1 × 10-6)

E | TC2 (1 × 10-7) | TC2 (1 × 10-8) | TC2 (1 × 10-9) | TC2 (1 × 10-10)

F | TC3 (1 × 10-3) | TC3 (1 × 10-4) | TC3 (1 × 10-5) | TC3 (1 × 10-6)

G | TC3 (1 × 10-7) | TC3 (1 × 10-8) | TC3 (1 × 10-9) | TC3 (1 × 10-10)

H | NE (IC50) | NE (1 × 10-4,5) | E2 (IC50) | E2 (1 × 10-7)

Slutförande av kompetitivt bindningstest

38. Som visas i tabell 6, ska 80 μl av lösningsmedelskontrollen, buffertkontrollen, östrogenreferensen, den svaga bindaren, icke-bindaren och testkemikalierna som har beretts i testbuffert tillsättas till brunnarna. Sedan ska 40 μl av en 4 nM [3H]-17β-östradiollösning tillsättas till varje brunn. Efter mild rotation i 10–15 minuter vid 2–8 °C, ska 40 μl hrERα-lösning tillsättas. Testmikrotiterplattor bör inkuberas på roterande skak vid 2–8 °C i 16–20 timmar.

Tabell 6 Tillsatsvolymer av beståndsdelar till kompetitivt bindningstest för hrER, i mikrotiterplattor

Volym (μl) | Beståndsdel

80 | Ej inmärkt 17β-östradiol, noretynodrel, OTES, testkemikalier, lösningsmedel eller buffert

40 | 4 nM [3H]-17β-östradiollösning

40 | hrERα-lösning, enligt fastställd koncentration

160 | Total volym i varje testbrunn

39. Kvantifieringen av [3H]-17β-östradiol bundet till hrERα, efter separation av [3H]-17β-östradiol bundet till hrERα från fritt [3H]-17β-östradiol genom tillsats av 80 μl av kall DCC-suspension till varje brunn, bör sedan utföras enligt instruktioner för mättnadsbindningstestet, i punkterna 20–23.

40. Brunnarna H1–6 (identifierade som blankprov [radioaktivitet] i tabell 4) anger dpm för [3H]-inmärkt östradiol i 40 μl. Dosen om 40 μl bör överföras direkt till scintillationsvätskan i brunnarna H1–H6.

Acceptanskriterier

Mättnadsbindningstest

41. Den specifika bindningskurvan bör nå en platå med ökande koncentrationer av [3H]-17β-östradiol, indikerande mättnad av hrERα med ligand.

42. Den specifika bindningen vid 1 nM av [3H]-17β-östradiol bör vara inom acceptansintervallet 15–25 % för genomsnittet av uppmätt total tillsatt radioaktivitet från de olika testomgångarna. Enstaka mindre avvikelser utanför detta intervall kan godtas, men om testomgångar konsekvent faller utanför intervallet eller om en viss omgång signifikant faller utanför intervallet bör proteinkoncentrationen justeras och mättnadstestet upprepas.

43. Data bör bilda ett linjärt Scatchard-diagram.

44. Den icke-specifika bindningen bör inte vara överdrivet stor. Storleken på den icke-specifika bindningen bör normalt vara < 35 % av den totala bindningen. Men kvoten kan emellanåt överskrida denna gräns vid mätningar av mycket låga dpm-tal för den lägsta koncentrationen av testad radioaktivt inmärkt 17β-östradiol.

Kompetitivt bindningstest

45. Ökande koncentrationer av ej inmärkt 17β-östradiol bör tränga bort [3H]-17β-östradiol från receptorn på ett sätt som överensstämmer med kompetitiv bindning till en bindningsplats.

46. Den hämmande koncentrationen, IC50, för referensöstrogenet (dvs. 17β-östradiol) bör ungefär motsvara den molära koncentrationen för [3H]-17β-östradiol plus Kd-värdet, som fastställts vid mättnadsbindningstestet.

47. Den totala specifika bindningen bör genomgående hamna inom acceptansintervallet på 20 ± 5 % när den genomsnittliga uppmätta totala radioaktiva koncentrationen, som har tillsatts till varje brunn, har varit 1 nM vid flera testomgångar. Enstaka mindre avvikelser utanför detta intervall kan godtas, men om testomgångar konsekvent faller utanför intervallet eller om en viss omgång signifikant hamnar utanför intervallet bör proteinkoncentrationen justeras.

48. Lösningsmedlet bör inte påverka vare sig testets känslighet eller reproducerbarhet. Resultaten för lösningsmedelskontrollen (TB-brunnar) jämförs med buffertkontrollen för att säkerställa att det valda lösningsmedlet inte påverkar testsystemet. Om lösningsmedlet inte har någon effekt på testet bör resultaten för TB och buffertkontroll vara jämförbara.

49. Icke-bindaren bör inte tränga bort mer än 25 % av [3H]-17β-östradiol från hrERα när den testas upp till 10–3 M (OTES) eller 10–4 M (DBP).

50. Prestandakriterier utarbetades för referensöstrogenet och två svaga bindare (t.ex. noretynodrel, noretindron) med hjälp av data från valideringsstudien av FW-hrER-bindningstestet (bilaga N till referens 2). I valideringsstudien uppges 95-procentiga konfidensintervall för genomsnittet (n) ± SD för deltagande laboratoriers alla kontrollomgångar. De 95-procentiga konfidensintervallen beräknades för kurvanpassningsparametrarna (dvs. topp, botten, Hill-koefficient [Hill slope], log[IC50]-värde) för referensöstrogenet och de svaga bindarna, och för log10RBA-värdet för de svaga bindarna jämförda med referensöstrogenet, och anges som prestandakriterier för de positiva kontrollerna. Tabell 1 anger förväntade intervall för kurvanpassningsparametrarna, vilka kan användas som prestandakriterier. I praktiken kan intervallet för IC50 variera något med Kd för receptorberedningen och ligandkoncentrationen.

51. Inga prestandakriterier för testkemikaliernas kurvanpassningsparametrar utarbetades på grund av den stora mängden möjliga testkemikalier och deras variation i möjliga affiniteter och utfall (t.ex. fullständig kurva, delkurva, ingen kurvanpassning). Men yrkesmässigt omdöme ska tillämpas vid granskning av resultaten från en testkemikalies alla testomgångar. Vidare ska man använda ett tillräckligt intervall av testkemikaliekoncentration för att klart kunna beskriva toppen (t.ex. 90–100 % bindning) på den kompetitiva bindningskurvan. Variationen mellan replikat vid varje koncentration av testkemikalie, liksom mellan de tre oberoende testomgångarna, ska vara rimlig och vetenskapligt försvarbar. Kontroller från en testkemikalies alla testomgångar bör hålla sig nära de prestandamätningar som har rapporterats för detta FW-test och överensstämma med historiska kontrolldata från respektive laboratorium.

DATAANALYS

Mättnadsbindningstest

52. Både total och icke-specifik bindning mäts. Från dessa värden beräknas specifik bindning av ökande koncentrationer av [3H]-17β-östradiol under jämviktsförhållanden genom att subtrahera icke-specifik från total. Ett diagram över specifik bindning mot [3H]-17β-östradiol-koncentration bör nå en platå för maximal specifik bindning, vilken indikerar ett hrERα mättat av [3H]-17β-östradiol. Dessutom bör dataanalysen klargöra inbindning av [3H]-17β-östradiol till en enda bindningsplats med hög affinitet. Icke-specifik, total och specifik bindning bör illustreras med en mättnadsbindningskurva. Vidare analys av dessa data bör använda sig av icke-linjär regressionsanalys (t.ex. BioSoft, McPherson, 1985, Motulsky, 1995) med en slutlig dataredovisning i form av ett Scatchard-diagram.

53. Dataanalysen bör fastställa Bmax och Kd enbart utifrån totala bindningsdata, med antagandet att den icke-specifika bindningen är linjär, om inte en motivering ges för att använda en annan metod. Dessutom ska robust regression användas i fastställande av bästa anpassning, om inte annat val motiveras. Val av robust regressionsmetod ska anges. Korrigering för liganduttömning (t.ex. med hjälp av Swillens metod 1995) bör alltid användas i fastställande av Bmax och Kd utifrån mättnadsbindningsdata.

Kompetitivt bindningstest

54. Kurvan över kompetitiv bindning ritas som specifik [3H]-17β-östradiol-bindning mot koncentrationen av konkurrerande ligand (log10-enheter). Den koncentration av testkemikalie som hämmar 50 % av den maximala specifika [3H]-17β-östradiol-bindningen är IC50-värdet.

55. Uppskattningar av log(IC50)-värden för de positiva kontrollerna (t.ex. referensöstrogen och svag bindare) ska fastställas med hjälp av lämplig programvara för icke-linjär kurvanpassning så att de passar en fyraparameters Hill-ekvation (t.ex. BioSoft, McPherson, 1985, Motulsky, 1995). Kurvans topp, botten, lutning och log(IC50)-värde ska i allmänhet lämnas utan restriktion (unconstrained) vid anpassning av dessa kurvor. Robust regression ska användas i fastställande av bästa anpassning, om inte annat val motiveras. Ingen korrigering för liganduttömning ska göras. Efter inledande analys ska varje bindningskurva granskas för att säkerställa korrekt anpassning till modellen. Den svaga bindarens relativa bindningsaffinitet (RBA) beräknas som procentuell andel av dess log(IC50)-värde i förhållande till 17β-östradiols log(IC50)-värde. Resultat från de positiva kontrollerna och den icke-bindande kontrollen ska utvärderas genom att använda måtten på testprestanda i punkterna 45–50 i detta tillägg 2.

56. Data för alla testkemikalier ska analyseras med en stegvis strategi för att säkerställa att data analyseras korrekt och att varje kurva för kompetitiv bindning klassificeras korrekt. Det är lämpligt att en testkemikalies alla testomgångar initialt underkastas en standardiserad dataanalys som är identisk med den som använts för referensöstrogen och kontroller med svaga bindare (se punkt 55 ovan). När den är klar bör en teknisk granskning av kurvanpassningsparametrarna göras, liksom en visuell granskning av hur väl data stämmer med den genererade kurvan över kompetitiv bindning, för varje testomgång. Under denna tekniska granskning är följande iakttagelser goda indikationer på att testet och dataanalyserna genomförts korrekt: en koncentrationsberoende minskning i procentuell, specifikt bunden [3H]-17β-östradiol, låg variation mellan de tekniska replikaten för varje kemisk koncentration och överensstämmelse mellan anpassningsparametrarna från de tre testomgångarna.

Tolkning av data

57. Förutsatt att samtliga acceptanskriterier är uppfyllda anses en testkemikalie binda till hrERα om data kan anpassas till en bindningskurva och den lägsta punkten på responskurvan, inom dataintervallet, är mindre än 50 % (figur 1).

58. Förutsatt att samtliga acceptanskriterier är uppfyllda, anses en testkemikalie inte binda till hrERα om data kan anpassas till en bindningskurva och den lägsta punkten på responskurvan, inom dataintervallet, är över 75 %, eller data inte kan anpassas till en bindningskurva och den lägsta, outjämnade genomsnittliga procentuella bindningen inom datamängdens koncentrationsgrupper är över 75 %.

59. Testkemikalier anses tvetydiga om inget av villkoren ovan uppfylls (t.ex. den lägsta punkten på den anpassade responskurvan ligger mellan 76 % och 51 %).

Tabell 7 Kriterier för klassificering utifrån en testkemikalies kurva över kompetitiv bindning

Klassificering | Kriterier

Bindarea | Data kan anpassas till en bindningskurva. Den lägsta punkten på responskurvan, inom dataintervallet, är mindre än 50 %.

Icke-bindareb | Om data kan anpassas till en bindningskurva och den lägsta punkten på den anpassade responskurvan, inom dataintervallet, är över 75 %. Om data inte kan anpassas till en bindningskurva och den lägsta, outjämnade genomsnittliga procentuella bindningen inom datamängdens koncentrationsgrupper är över 75 %.

Tvetydigc | Varje mätbar testomgång som varken är en bindare eller en icke-bindare (t.ex. den lägsta punkten längs den anpassade kurvan ligger mellan 76–51 %).

Figur 1 Exempel på klassificeringar av testkemikalier med hjälp av kurva för kompetitiv bindning

60. Flera testomgångar genomförda med en viss testkemikalie, i samma laboratorium, kombineras genom att tilldela numeriska värden till varje omgång och ta fram ett medelvärde enligt tabell 8. Resultaten för de kombinerade testomgångarna inom varje laboratorium jämförs med den förväntade klassificeringen för varje testkemikalie.

Tabell 8 Metod för klassificering av testkemikalier med användning av flera testomgångar inom ett laboratorium

Klassificering | Numeriskt värde

Bindare | 2

Tvetydig | 1

Icke-bindare | 0

Klassificering | Numeriskt värde

Bindare | Genomsnitt ≥ 1,5

Tvetydig | 0,5 ≤ genomsnitt < 1,5

Icke-bindare | Genomsnitt < 0,5

TESTRAPPORT

61. Se punkt 24 i hrER-BINDNINGSTESTETS DELAR i denna testmetod.

1 Medelvärde (n) ± standardavvikelse (Standard Deviation, SD) beräknades genom skattning av kurvanpassningsparametrar (fyraparameters Hill-ekvation) för kontrollomgångar som utförts av fyra laboratorier under valideringsstudien (se bilaga N i referens 2).

2 Gränserna för 95-procentigt konfidensintervall anges som en vägledning för acceptanskriterier.

3 Test av noretindron var valfritt för deluppgift 4 under valideringsstudien (se referens 2, deluppgift 4). Således beräknades medelvärdet ± SD (n) med hjälp av skattade kurvanpassningar (fyraparameters Hill-ekvation) för kontrollomgångar, utförda av två laboratorier. Intervallet för IC50 kommer att vara beroende av receptorberedningens Kd och koncentrationen av radioaktivt inmärkt ligand som används vid de olika laboratorierna. Lämplig justering för IC50-intervallet, baserad på de betingelser som används för att genomföra testet, kommer att kunna godtas.

8 Seriespädningarna av [3H]-inmärkt östradiol bör tillsättas direkt till 200 μl scintillationsvätska i brunnar G1–H12.

10 Faktiskt blankprov, brunnen används inte.

11 Blankprov ej använt under inkubationen, men till för att bekräfta total tillsatt mängd radioaktivitet.

Tillägg 2.1

TERMER

Tillägg 2.2

REPRESENTATIVT [3H]-17Β-ÖSTRADIOL-MÄTTNADSTEST MED REPLIKAT I TRE BRUNNAR

Representativt [3H]-17β-östradiol-mättnadstest med replikat i tre brunnar

A1 | 1 | H | 0,12 | 40 | 0,03 | — | — | — | 80 | 40 | 160

A2 | 2 | H | 0,12 | 40 | 0,03 | — | — | — | 80 | 40 | 160

A3 | 3 | H | 0,12 | 40 | 0,03 | — | — | — | 80 | 40 | 160

A4 | 1 | H | 0,24 | 40 | 0,06 | — | — | — | 80 | 40 | 160

A5 | 2 | H | 0,24 | 40 | 0,06 | — | — | — | 80 | 40 | 160

A6 | 3 | H | 0,24 | 40 | 0,06 | — | — | — | 80 | 40 | 160

A7 | 1 | H | 0,32 | 40 | 0,08 | — | — | — | 80 | 40 | 160

A8 | 2 | H | 0,32 | 40 | 0,08 | — | — | — | 80 | 40 | 160

A9 | 3 | H | 0,32 | 40 | 0,08 | — | — | — | 80 | 40 | 160

A10 | 1 | H | 0,40 | 40 | 0,10 | — | — | — | 80 | 40 | 160

A11 | 2 | H | 0,40 | 40 | 0,10 | — | — | — | 80 | 40 | 160

A12 | 3 | H | 0,40 | 40 | 0,10 | — | — | — | 80 | 40 | 160

B1 | 1 | H | 1,20 | 40 | 0,30 | — | — | — | 80 | 40 | 160

B2 | 2 | H | 1,20 | 40 | 0,30 | — | — | — | 80 | 40 | 160

B3 | 3 | H | 1,20 | 40 | 0,30 | — | — | — | 80 | 40 | 160

B4 | 1 | H | 2,40 | 40 | 0,60 | — | — | — | 80 | 40 | 160

B5 | 2 | H | 2,40 | 40 | 0,60 | — | — | — | 80 | 40 | 160

B6 | 3 | H | 2,40 | 40 | 0,60 | — | — | — | 80 | 40 | 160

B7 | 1 | H | 4,00 | 40 | 1,00 | — | — | — | 80 | 40 | 160

B8 | 2 | H | 4,00 | 40 | 1,00 | — | — | — | 80 | 40 | 160

B9 | 3 | H | 4,00 | 40 | 1,00 | — | — | — | 80 | 40 | 160

B10 | 1 | H | 12,00 | 40 | 3,00 | — | — | — | 80 | 40 | 160

B11 | 2 | H | 12,00 | 40 | 3,00 | — | — | — | 80 | 40 | 160

B12 | 3 | H | 12,00 | 40 | 3,00 | — | — | — | 80 | 40 | 160

D1 | 1 | HC | 0,12 | 40 | 0,03 | 0,06 | 80 | 0,03 | — | 40 | 160

D2 | 2 | HC | 0,12 | 40 | 0,03 | 0,06 | 80 | 0,03 | — | 40 | 160

D3 | 3 | HC | 0,12 | 40 | 0,03 | 0,06 | 80 | 0,03 | — | 40 | 160

D4 | 1 | HC | 0,24 | 40 | 0,06 | 0,12 | 80 | 0,06 | — | 40 | 160

D5 | 2 | HC | 0,24 | 40 | 0,06 | 0,12 | 80 | 0,06 | — | 40 | 160

D6 | 3 | HC | 0,24 | 40 | 0,06 | 0,12 | 80 | 0,06 | — | 40 | 160

D7 | 1 | HC | 0,32 | 40 | 0,08 | 0,16 | 80 | 0,08 | — | 40 | 160

D8 | 2 | HC | 0,32 | 40 | 0,08 | 0,16 | 80 | 0,08 | — | 40 | 160

D9 | 3 | HC | 0,32 | 40 | 0,08 | 0,16 | 80 | 0,08 | — | 40 | 160

D10 | 1 | HC | 0,40 | 40 | 0,10 | 0,2 | 80 | 0,1 | — | 40 | 160

D11 | 2 | HC | 0,40 | 40 | 0,10 | 0,2 | 80 | 0,1 | — | 40 | 160

D12 | 3 | HC | 0,40 | 40 | 0,10 | 0,2 | 80 | 0,1 | — | 40 | 160

E1 | 1 | HC | 1,20 | 40 | 0,30 | 0,6 | 80 | 0,3 | — | 40 | 160

E2 | 2 | HC | 1,20 | 40 | 0,30 | 0,6 | 80 | 0,3 | — | 40 | 160

E3 | 3 | HC | 1,20 | 40 | 0,30 | 0,6 | 80 | 0,3 | — | 40 | 160

E4 | 1 | HC | 2,40 | 40 | 0,60 | 1,2 | 80 | 0,6 | — | 40 | 160

E5 | 2 | HC | 2,40 | 40 | 0,60 | 1,2 | 80 | 0,6 | — | 40 | 160

E6 | 3 | HC | 2,40 | 40 | 0,60 | 1,2 | 80 | 0,6 | — | 40 | 160

E7 | 1 | HC | 4,00 | 40 | 1,00 | 2 | 80 | 1 | — | 40 | 160

E8 | 2 | HC | 4,00 | 40 | 1,00 | 2 | 80 | 1 | — | 40 | 160

E9 | 3 | HC | 4,00 | 40 | 1,00 | 2 | 80 | 1 | — | 40 | 160

E10 | 1 | HC | 12,00 | 40 | 3,00 | 6 | 80 | 3 | — | 40 | 160

E11 | 2 | HC | 12,00 | 40 | 3,00 | 6 | 80 | 3 | — | 40 | 160

E12 | 3 | HC | 12,00 | 40 | 3,00 | 6 | 80 | 3 | — | 40 | 160

G1 | 1 | Radioaktiv | 0,12 | 40 | 0,03 | — | — | — | — | — | 40

G2 | 2 | Radioaktiv | 0,12 | 40 | 0,03 | — | — | — | — | — | 40

G3 | 3 | Radioaktiv | 0,12 | 40 | 0,03 | — | — | — | — | — | 40

G4 | 1 | Radioaktiv | 0,24 | 40 | 0,06 | — | — | — | — | — | 40

G5 | 2 | Radioaktiv | 0,24 | 40 | 0,06 | — | — | — | — | — | 40

G6 | 3 | Radioaktiv | 0,24 | 40 | 0,06 | — | — | — | — | — | 40

G7 | 1 | Radioaktiv | 0,32 | 40 | 0,08 | — | — | — | — | — | 40

G8 | 2 | Radioaktiv | 0,32 | 40 | 0,08 | — | — | — | — | — | 40

G9 | 3 | Radioaktiv | 0,32 | 40 | 0,08 | — | — | — | — | — | 40

G10 | 1 | Radioaktiv | 0,40 | 40 | 0,10 | — | — | — | — | — | 40

G11 | 2 | Radioaktiv | 0,40 | 40 | 0,10 | — | — | — | — | — | 40

G12 | 3 | Radioaktiv | 0,40 | 40 | 0,10 | — | — | — | — | — | 40

H1 | 1 | Radioaktiv | 1,20 | 40 | 0,30 | — | — | — | — | — | 40

H2 | 2 | Radioaktiv | 1,20 | 40 | 0,30 | — | — | — | — | — | 40

H3 | 3 | Radioaktiv | 1,20 | 40 | 0,30 | — | — | — | — | — | 40

H4 | 1 | Radioaktiv | 2,40 | 40 | 0,60 | — | — | — | — | — | 40

H5 | 2 | Radioaktiv | 2,40 | 40 | 0,60 | — | — | — | — | — | 40

H6 | 3 | Radioaktiv | 2,40 | 40 | 0,60 | — | — | — | — | — | 40

H7 | 1 | Radioaktiv | 4,00 | 40 | 1,00 | — | — | — | — | — | 40

H8 | 2 | Radioaktiv | 4,00 | 40 | 1,00 | — | — | — | — | — | 40

H9 | 3 | Radioaktiv | 4,00 | 40 | 1,00 | — | — | — | — | — | 40

H10 | 1 | Radioaktiv | 12,00 | 40 | 3,00 | — | — | — | — | — | 40

H11 | 2 | Radioaktiv | 12,00 | 40 | 3,00 | — | — | — | — | — | 40

H12 | 3 | Radioaktiv | 12,00 | 40 | 3,00 | — | — | — | — | — | 40

Tillägg 2.3

UPPLÄGG FÖR BRUNNAR TILL TEST AV KOMPETITIV BINDNING

Fast | A1 | 1 | Total bindning | TB | TB1 | — | 40 | 40 | 80 | 160 | —

Fast | A2 | 2 | Total bindning | TB | TB2 | — | 40 | 40 | 80 | 160 | —

Fast | A3 | 3 | Total bindning | TB | TB3 | — | 40 | 40 | 80 | 160 | —

Fast | A4 | 1 | Total bindning | TB | TB4 | — | 40 | 40 | 80 | 160 | —

Fast | A5 | 2 | Total bindning | TB | TB5 | — | 40 | 40 | 80 | 160 | —

Fast | A6 | 3 | Total bindning | TB | TB6 | — | 40 | 40 | 80 | 160 | —

Fast | A7 | 1 | Icke-radioaktiv E2 (hög) | NSB | S0 | 2,00 × 10-6 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-6

Fast | A8 | 2 | Icke-radioaktiv E2 (hög) | NSB | S0 | 2,00 × 10-6 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-6

Fast | A9 | 3 | Icke-radioaktiv E2 (hög) | NSB | S0 | 2,00 × 10-6 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-6

Fast | A10 | 1 | Icke-radioaktiv E2 (hög) | NSB | S0 | 2,00 × 10-6 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-6

Fast | A11 | 2 | Icke-radioaktiv E2 (hög) | NSB | S0 | 2,00 × 10-6 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-6

Fast | A12 | 3 | Icke-radioaktiv E2 (hög) | NSB | S0 | 2,00 × 10-6 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-6

Fast | B1 | 1 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S1 | 2,00 × 10-7 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-7

Fast | B2 | 2 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S1 | 2,00 × 10-7 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-7

Fast | B3 | 3 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S1 | 2,00 × 10-7 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-7

Fast | B4 | 1 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S2 | 2,00 × 10-8 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-8

Fast | B5 | 2 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S2 | 2,00 × 10-8 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-8

Fast | B6 | 3 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S2 | 2,00 × 10-8 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-8

Fast | B7 | 1 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S3 | 6,00 × 10-9 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 3,0 × 10-9

Fast | B8 | 2 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S3 | 6,00 × 10-9 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 3,0 × 10-9

Fast | B9 | 3 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S3 | 6,00 × 10-9 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 3,0 × 10-9

Fast | B10 | 1 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S4 | 2,00 × 10-9 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-9

Fast | B11 | 2 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S4 | 2,00 × 10-9 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-9

Fast | B12 | 3 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S4 | 2,00 × 10-9 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-9

Fast | C1 | 1 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S5 | 6,00 × 10-10 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 3,0 × 10-10

Fast | C2 | 2 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S5 | 6,00 × 10-10 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 3,0 × 10-10

Fast | C3 | 3 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S5 | 6,00 × 10-10 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 3,0 × 10-10

Fast | C4 | 1 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S6 | 2,00 × 10-10 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-10

Fast | C5 | 2 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S6 | 2,00 × 10-10 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-10

Fast | C6 | 3 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S6 | 2,00 × 10-10 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-10

Fast | C7 | 1 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S7 | 2,00 × 10-11 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-11

Fast | C8 | 2 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S7 | 2,00 × 10-11 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-11

Fast | C9 | 3 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S7 | 2,00 × 10-11 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-11

Fast | C10 | 1 | Blankprov | Blankprov | B1 | — | — | 160 | — | — | 160 | —

Fast | C11 | 2 | Blankprov | Blankprov | B2 | — | — | 160 | — | — | 160 | —

Fast | C12 | 3 | Blankprov | Blankprov | B3 | — | — | 160 | — | — | 160 | —

Fast | D1 | 1 | Noretynodrel | NE | WP1 | 6,00 × 10-5 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 3,0 × 10-5

Fast | D2 | 1 | Noretynodrel | NE | WP1 | 6,00 × 10-5 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 3,0 × 10-5

Fast | D3 | 1 | Noretynodrel | NE | WP1 | 6,00 × 10-5 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 3,0 × 10-5

Fast | D4 | 1 | Noretynodrel | NE | WP2 | 2,00 × 10-5 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-5

Fast | D5 | 1 | Noretynodrel | NE | WP2 | 2,00 × 10-5 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-5

Fast | D6 | 1 | Noretynodrel | NE | WP2 | 2,00 × 10-5 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-5

Fast | D7 | 1 | Noretynodrel | NE | WP3 | 6,00 × 10-6 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 3,0 × 10-6

Fast | D8 | 1 | Noretynodrel | NE | WP3 | 6,00 × 10-6 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 3,0 × 10-6

Fast | D9 | 1 | Noretynodrel | NE | WP3 | 6,00 × 10-6 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 3,0 × 10-6

Fast | D10 | 1 | Noretynodrel | NE | WP4 | 2,00 × 10-6 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-6

Fast | D11 | 1 | Noretynodrel | NE | WP4 | 2,00 × 10-6 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-6

Fast | D12 | 1 | Noretynodrel | NE | WP4 | 2,00 × 10-6 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-6

Fast | E1 | 1 | Noretynodrel | NE | WP | 6,00 × 10-7 | 40 | 40 | 80 | 160 | 3,0 × 10-7

Fast | E2 | 2 | Noretynodrel | NE | WP | 6,00 × 10-7 | 40 | 40 | 80 | 160 | 3,0 × 10-7

Fast | E3 | 3 | Noretynodrel | NE | WP | 6,00 × 10-7 | 40 | 40 | 80 | 160 | 3,0 × 10-7

Fast | E4 | 1 | Noretynodrel | NE | WP | 2,00 × 10-7 | 40 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-7

Fast | E5 | 2 | Noretynodrel | NE | WP | 2,00 × 10-7 | 40 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-7

Fast | E6 | 3 | Noretynodrel | NE | WP | 2,00 × 10-7 | 40 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-7

Fast | E7 | 1 | Noretynodrel | NE | WP | 6,00 × 10-8 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 3,0 × 10-8

Fast | E8 | 2 | Noretynodrel | NE | WP | 6,00 × 10-8 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 3,0 × 10-8

Fast | E9 | 3 | Noretynodrel | NE | WP | 6,00 × 10-8 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 3,0 × 10-8

Fast | E10 | 1 | Noretynodrel | NE | WP | 6,00 × 10-9 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 3,0 × 10-9

Fast | E11 | 2 | Noretynodrel | NE | WP | 6,00 × 10-9 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 3,0 × 10-9

Fast | E12 | 3 | Noretynodrel | NE | WP | 6,00 × 10-9 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 3,0 × 10-9

Fast | F1 | 1 | OTES | N | OTES | 2,00 × 10-3 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-3

Fast | F2 | 2 | OTES | N | OTES | 2,00 × 10-3 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-3

Fast | F3 | 3 | OTES | N | OTES | 2,00 × 10-3 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-3

Fast | F4 | 1 | OTES | N | OTES | 2,00 × 10-4 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-4

Fast | F5 | 2 | OTES | N | OTES | 2,00 × 10-4 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-4

Fast | F6 | 3 | OTES | N | OTES | 2,00 × 10-4 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-4

Fast | F7 | 1 | OTES | N | OTES | 2,00 × 10-5 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 3,0 × 10-5

Fast | F8 | 2 | OTES | N | OTES | 2,00 × 10-5 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 3,0 × 10-5

Fast | F9 | 3 | OTES | N | OTES | 2,00 × 10-5 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 3,0 × 10-5

Fast | F10 | 1 | OTES | N | OTES | 2,00 × 10-6 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-6

Fast | F11 | 2 | OTES | N | OTES | 2,00 × 10-6 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-6

Fast | F12 | 3 | OTES | N | OTES | 2,00 × 10-6 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-6

Fast | G1 | 1 | OTES | N | OTES | 2,00 × 10-7 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 3,0 × 10-7

Fast | G2 | 2 | OTES | N | OTES | 2,00 × 10-7 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 3,0 × 10-7

Fast | G3 | 3 | OTES | N | OTES | 2,00 × 10-7 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 3,0 × 10-7

Fast | G4 | 1 | OTES | N | OTES | 2,00 × 10-8 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-8

Fast | G5 | 2 | OTES | N | OTES | 2,00 × 10-8 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-8

Fast | G6 | 3 | OTES | N | OTES | 2,00 × 10-8 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-8

Fast | G7 | 1 | OTES | N | OTES | 2,00 × 10-9 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-9

Fast | G8 | 2 | OTES | N | OTES | 2,00 × 10-9 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-9

Fast | G9 | 3 | OTES | N | OTES | 2,00 × 10-9 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-9

Fast | G10 | 1 | OTES | N | OTES | 2,00 × 10-10 | 40 | — | 40 | — | 160 | 1,0 × 10-10

Fast | G11 | 2 | OTES | N | OTES | 2,00 × 10-10 | 40 | — | 40 | — | 160 | 1,0 × 10-10

Fast | G12 | 3 | OTES | N | OTES | 2,00 × 10-10 | 40 | — | 40 | — | 160 | 1,0 × 10-10

Fast | H1 | 1 | Radioaktiv | H | H | — | — | — | 40 | — | 40 | —

Fast | H2 | 1 | Radioaktiv | H | H | — | — | — | 40 | — | 40 | —

Fast | H3 | 1 | Radioaktiv | H | H | — | — | — | 40 | — | 40 | —

Fast | H4 | 1 | Radioaktiv | H | H | — | — | — | 40 | — | 40 | —

Fast | H5 | 1 | Radioaktiv | H | H | — | — | — | 40 | — | 40 | —

Fast | H6 | 1 | Radioaktiv | H | H | — | — | — | 40 | — | 40 | —

Fast | H7 | 1 | Buffertkontroll | BC | BC | — | 40 | 80 | 40 | — | 160 | —

Fast | H8 | 1 | Buffertkontroll | BC | BC | — | 40 | 80 | 40 | — | 160 | —

Fast | H9 | 1 | Buffertkontroll | BC | BC | — | 40 | 80 | 40 | — | 160 | —

Fast | H10 | 1 | Buffertkontroll | BC | BC | — | 40 | 80 | 40 | — | 160 | —

Fast | H11 | 1 | Buffertkontroll | BC | BC | — | 40 | 80 | 40 | — | 160 | —

Fast | H12 | 1 | Buffertkontroll | BC | BC | — | 40 | 80 | 40 | — | 160 | —

Obs: brunnarna som märkts med radioaktiv är tomma under inkubationen. Dessa 40 μl tillsätts endast i scintillationsräkningssyfte.

Upplägg för brunnar till test av kompetitiv bindning

P1 | A1 | 1 | Total bindning | TB | TBB1B1 | — | 40 | — | 40 | 80 | 160 | —

P1 | A2 | 2 | Total bindning | TB | TB2 | — | 40 | — | 40 | 80 | 160 | —

P1 | A3 | 3 | Total bindning | TB | TB3 | — | 40 | — | 40 | 80 | 160 | —

P1 | A4 | 1 | Total bindning | TB | TB4 | — | 40 | — | 40 | 80 | 160 | —

P1 | A5 | 2 | Total bindning | TB | TB5 | — | 40 | — | 40 | 80 | 160 | —

P1 | A6 | 3 | Total bindning | TB | TB6 | — | 40 | — | 40 | 80 | 160 | —

P1 | A7 | 1 | Icke-radioaktiv E2 (hög) | NSB | S0 | 2,00 × 10-6 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-6

P1 | A8 | 2 | Icke-radioaktiv E2 (hög) | NSB | S0 | 2,00 × 10-6 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-6

P1 | A9 | 3 | Icke-radioaktiv E2 (hög) | NSB | S0 | 2,00 × 10-6 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-6

P1 | A10 | 1 | Icke-radioaktiv E2 (hög) | NSB | S0 | 2,00 × 10-6 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-6

P1 | A11 | 2 | Icke-radioaktiv E2 (hög) | NSB | S0 | 2,00 × 10-6 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-6

P1 | A12 | 3 | Icke-radioaktiv E2 (hög) | NSB | S0 | 2,00 × 10-6 | 40 | — | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-6

P1 | B1 | 1 | Testkemikalie 1 | TC1 | 1 | 2,00 × 10-3 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-3

P1 | B2 | 2 | Testkemikalie 1 | TC1 | 1 | 2,00 × 10-3 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-3

P1 | B3 | 3 | Testkemikalie 1 | TC1 | 1 | 2,00 × 10-3 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-3

P1 | B4 | 1 | Testkemikalie 1 | TC1 | 2 | 2,00 × 10-4 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-4

P1 | B5 | 2 | Testkemikalie 1 | TC1 | 2 | 2,00 × 10-4 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-4

P1 | B6 | 3 | Testkemikalie 1 | TC1 | 2 | 2,00 × 10-4 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-4

P1 | B7 | 1 | Testkemikalie 1 | TC1 | 3 | 2,00 × 10-5 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-5

P1 | B8 | 2 | Testkemikalie 1 | TC1 | 3 | 2,00 × 10-5 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-5

P1 | B9 | 3 | Testkemikalie 1 | TC1 | 3 | 2,00 × 10-5 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-5

P1 | B10 | 1 | Testkemikalie 1 | TC1 | 4 | 2,00 × 10-6 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-6

P1 | B11 | 2 | Testkemikalie 1 | TC1 | 4 | 2,00 × 10-6 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-6

P1 | B12 | 3 | Testkemikalie 1 | TC1 | 4 | 2,00 × 10-6 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-6

P1 | C1 | 1 | Testkemikalie 1 | TC1 | 5 | 2,00 × 10-7 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-7

P1 | C2 | 2 | Testkemikalie 1 | TC1 | 5 | 2,00 × 10-7 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-7

P1 | C3 | 3 | Testkemikalie 1 | TC1 | 5 | 2,00 × 10-7 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-7

P1 | C4 | 1 | Testkemikalie 1 | TC1 | 6 | 2,00 × 10-8 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-8

P1 | C5 | 2 | Testkemikalie 1 | TC1 | 6 | 2,00 × 10-8 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-8

P1 | C6 | 3 | Testkemikalie 1 | TC1 | 6 | 2,00 × 10-8 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-8

P1 | C7 | 1 | Testkemikalie 1 | TC1 | 7 | 2,00 × 10-9 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-9

P1 | C8 | 2 | Testkemikalie 1 | TC1 | 7 | 2,00 × 10-9 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-9

P1 | C9 | 3 | Testkemikalie 1 | TC1 | 7 | 2,00 × 10-9 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-9

P1 | C10 | 1 | Testkemikalie 1 | TC1 | 8 | 2,00 × 10-10 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-10

P1 | C11 | 2 | Testkemikalie 1 | TC1 | 8 | 2,00 × 10-10 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-10

P1 | C12 | 3 | Testkemikalie 1 | TC1 | 8 | 2,00 × 10-10 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-10

P1 | D1 | 1 | Testkemikalie 2 | TC2 | 1 | 2,00 × 10-3 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-3

P1 | D2 | 2 | Testkemikalie 2 | TC2 | 1 | 2,00 × 10-3 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-3

P1 | D3 | 3 | Testkemikalie 2 | TC2 | 1 | 2,00 × 10-3 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-3

P1 | D4 | 1 | Testkemikalie 2 | TC2 | 2 | 2,00 × 10-4 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-4

P1 | D5 | 2 | Testkemikalie 2 | TC2 | 2 | 2,00 × 10-4 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-4

P1 | D6 | 3 | Testkemikalie 2 | TC2 | 2 | 2,00 × 10-4 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-4

P1 | D7 | 1 | Testkemikalie 2 | TC2 | 3 | 2,00 × 10-5 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-5

P1 | D8 | 2 | Testkemikalie 2 | TC2 | 3 | 2,00 × 10-5 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-5

P1 | D9 | 3 | Testkemikalie 2 | TC2 | 3 | 2,00 × 10-5 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-5

P1 | D10 | 1 | Testkemikalie 2 | TC2 | 4 | 2,00 × 10-6 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-6

P1 | D11 | 2 | Testkemikalie 2 | TC2 | 4 | 2,00 × 10-6 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-6

P1 | D12 | 3 | Testkemikalie 2 | TC2 | 4 | 2,00 × 10-6 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-6

P1 | E1 | 1 | Testkemikalie 2 | TC2 | 5 | 2,00 × 10-7 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-7

P1 | E2 | 2 | Testkemikalie 2 | TC2 | 5 | 2,00 × 10-7 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-7

P1 | E3 | 3 | Testkemikalie 2 | TC2 | 5 | 2,00 × 10-7 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-7

P1 | E4 | 1 | Testkemikalie 2 | TC2 | 6 | — | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-8

P1 | E5 | 2 | Testkemikalie 2 | TC2 | 6 | — | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-8

P1 | E6 | 3 | Testkemikalie 2 | TC2 | 6 | — | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-8

P1 | E7 | 1 | Testkemikalie 2 | TC2 | 7 | 2,00 × 10-6 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-9

P1 | E8 | 2 | Testkemikalie 2 | TC2 | 7 | 2,00 × 10-6 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-9

P1 | E9 | 3 | Testkemikalie 2 | TC2 | 7 | 2,00 × 10-6 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-9

P1 | E10 | 1 | Testkemikalie 2 | TC2 | 8 | 2,00 × 10-6 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-10

P1 | E11 | 2 | Testkemikalie 2 | TC2 | 8 | 2,00 × 10-6 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-10

P1 | E12 | 3 | Testkemikalie 2 | TC2 | 8 | 2,00 × 10-6 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-10

P1 | F1 | 1 | Testkemikalie 3 | TC3 | 1 | 2,00 × 10-3 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-3

P1 | F2 | 2 | Testkemikalie 3 | TC3 | 1 | 2,00 × 10-3 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-3

P1 | F3 | 3 | Testkemikalie 3 | TC3 | 1 | 2,00 × 10-3 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-3

P1 | F4 | 1 | Testkemikalie 3 | TC3 | 2 | 2,00 × 10-4 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-4

P1 | F5 | 2 | Testkemikalie 3 | TC3 | 2 | 2,00 × 10-4 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-4

P1 | F6 | 3 | Testkemikalie 3 | TC3 | 2 | 2,00 × 10-4 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-4

P1 | F7 | 1 | Testkemikalie 3 | TC3 | 3 | 2,00 × 10-5 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-5

P1 | F8 | 2 | Testkemikalie 3 | TC3 | 3 | 2,00 × 10-5 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-5

P1 | F9 | 3 | Testkemikalie 3 | TC3 | 3 | 2,00 × 10-5 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-5

P1 | F10 | 1 | Testkemikalie 3 | TC3 | 4 | 2,00 × 10-6 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-6

P1 | F11 | 2 | Testkemikalie 3 | TC3 | 4 | 2,00 × 10-6 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-6

P1 | F12 | 3 | Testkemikalie 3 | TC3 | 4 | 2,00 × 10-6 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-6

P1 | G1 | 1 | Testkemikalie 3 | TC3 | 5 | 2,00 × 10-7 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-7

P1 | G2 | 2 | Testkemikalie 3 | TC3 | 5 | 2,00 × 10-7 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-7

P1 | G3 | 3 | Testkemikalie 3 | TC3 | 5 | 2,00 × 10-7 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-7

P1 | G4 | 1 | Testkemikalie 3 | TC3 | 6 | 2,00 × 10-8 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-8

P1 | G5 | 2 | Testkemikalie 3 | TC3 | 6 | 2,00 × 10-8 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-8

P1 | G6 | 3 | Testkemikalie 3 | TC3 | 6 | 2,00 × 10-8 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-8

P1 | G7 | 1 | Testkemikalie 3 | TC3 | 7 | 2,00 × 10-9 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-9

P1 | G8 | 2 | Testkemikalie 3 | TC3 | 7 | 2,00 × 10-9 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-9

P1 | G9 | 3 | Testkemikalie 3 | TC3 | 7 | 2,00 × 10-9 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-9

P1 | G10 | 1 | Testkemikalie 3 | TC3 | 8 | 2,00 × 10-10 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-10

P1 | G11 | 2 | Testkemikalie 3 | TC3 | 8 | 2,00 × 10-10 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-10

P1 | G12 | 3 | Testkemikalie 3 | TC3 | 8 | 2,00 × 10-10 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160 | 1,0 × 10-10

P1 | H1 | 1 | Noretynodrel | NE | IC50 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160

P1 | H2 | 2 | Noretynodrel | NE | IC50 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160

P1 | H3 | 3 | Noretynodrel | NE | IC50 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160

P1 | H4 | 1 | Noretynodrel | NE | 1,00 × 10-4,5 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160

P1 | H5 | 2 | Noretynodrel | NE | 1,00 × 10-4,5 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160

P1 | H6 | 3 | Noretynodrel | NE | 1,00 × 10-4,5 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160

P1 | H7 | 1 | Icke-radioaktiv E2 S | IC50 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160

P1 | H8 | 2 | Icke-radioaktiv E2 S | IC50 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160

P1 | H9 | 3 | Icke-radioaktiv E2 S | IC50 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160

P1 | H10 | 1 | Icke-radioaktiv E2 S | 1,00 × 10-7 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160

P1 | H11 | 2 | Icke-radioaktiv E2 S | 1,00 × 10-7 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160

P1 | H12 | 3 | Icke-radioaktiv E2 S | 1,00 × 10-7 | 40 | 0 | 40 | 80 | 160

Tillägg 3

CHEMICAL EVALUATION AND RESEARCH INSTITUTES (CERI) IN VITRO-TEST AV ÖSTROGENRECEPTORBINDNING MED HUMANT, REKOMBINANT, LIGANDBINDANDE ERΑ-DOMÄNPROTEIN

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR (SE ÄVEN ALLMÄN INLEDNING)

1. Detta in vitro-test av mättnad hos och kompetitiv bindning till östrogenreceptor (ERα) använder sig av den ligandbindande domänen (LBD) hos det humana ERα (hrERα). Denna proteinmodell har framställts av Chemicals evaluation research institute (CERI), Japan, och är ett glutation-S-transferas- (GST) fusionsprotein som uttrycks i E. coli. Protokollet prövades i en internationell valideringsstudie som involverade flera laboratorier (2) och vilken visade dess relevans och pålitlighet för det avsedda syftet.

2. Detta test är ett screeningförfarande för identifiering av ämnen som kan binda till hrERα. Det används för att fastställa en testkemikalies förmåga att konkurrera med 17β-östradiol i bindning till hrERα:s ligandbindande domän. Kvantitativa testresultat kan omfatta IC50 (ett mått på den koncentration av testkemikalie som behövs för att tränga bort hälften av [3H]-17β-östradiolen från hrERα) och testkemikaliernas relativa bindningsaffiniteter för hrERα, jämförda med den hos 17β-östradiol. För kemisk screening kan godtagbara kvalitativa testresultat omfatta klassificeringar av testkemikalier som antingen hrERα-bindare, icke-bindare eller tvetydiga, utifrån de kriterier som beskrivits för bindningskurvorna.

4. Läs ALLMÄN INLEDNING och hrER-BINDNINGSTESTETS DELAR innan testet används för tillsynsändamål. Definitioner och förkortningar som används i denna testriktlinje beskrivs i tillägg 1.

TESTETS PRINCIP (SE ÄVEN ALLMÄN INLEDNING)

FÖRFARANDE

Fastställande av acceptabel proteinfunktion hos hrERα

9. Innan rutinmässiga tester av mättnad och kompetitiv bindning genomförs ska varje ny sats av hrERα visas fungera korrekt i det laboratorium där den ska användas. En tvåstegsprocedur bör användas för att kontrollera prestanda. Dessa steg är som följer: Utför ett mättnadsbindningstest med [3H]-17β-östradiol för att fastställa specificitet och mättnad hos hrERα. Icke-linjär regressionsanalys av dessa data (t.ex. BioSoft, McPherson, 1985, Motulsky, 1995) och påföljande Scatchard-diagram ska dokumentera [3H]-17β-östradiolens bindningsaffinitet för hrERα (Kd) samt antalet receptorer (Bmax) för varje sats av hrERα. Genomför ett kompetitivt bindningstest med hjälp av kontrollämnen (referensöstrogen, 17β-östradiol), en svag bindare (t.ex. noretynodrel eller noretindron) och en icke-bindare (oktyltrietoxisilan, OTES). Varje laboratorium ska upprätta en historisk databas för att dokumentera överensstämmelsen hos IC50 och andra relevanta värden för referensöstrogenet och svaga bindaren, mellan olika experiment och olika hrERα-satser. Dessutom ska parametrarna för kontrollämnenas kurvor över kompetitiv bindning vara inom gränserna för 95-procentigt konfidensintervall (se tabell 1), vilka har tagits fram med data från laboratorier som deltog i valideringsstudien för detta test (2). Tabell 1 Prestandakriterier framtagna för referensöstrogen och svag bindare, CERI-hrER-bindningstest Ämne Parameter Medelvärde Standardavvikelse (n) 95 % konfidensintervall Nedre gräns Övre gräns 17β-östradiol. Topp 104,74 13,12 (70) 101,6 107,9 Botten 0,85 2,41 (70) 0,28 1,43 Hill-koefficient (Hill slope) –1,22 0,20 (70) –1,27 –1,17 Log(IC50)-värde –8,93 0,23 (70) –8,98 –8,87 Noretynodrel Topp 101,31 10,55 (68) 98,76 103,90 Botten 2,39 5,01 (68) 1,18 3,60 Hill-koefficient (Hill slope) –1,04 0,21 (68) –1,09 –0,99 Log(IC50)-värde –6,19 0,40 (68) –6,29 –6,10 Noretindron Topp 92,27 7,79 (23) 88,90 95,63 Botten 16,52 10,59 (23) 11,94 21,10 Hill-koefficient (Hill slope) –1,18 0,32 (23) –1,31 –1,04 Log(IC50)-värde –6,01 0,54 (23) –6,25 –5,78

Demonstration av laboratoriets kompetens

Bestämning av hrERα-koncentration

12. Under förhållanden som motsvarar kompetitiv bindning (dvs. 0,5 nM [3H]-inmärkt östradiol), ska nominella koncentrationer om 0,1, 0,2, 0,4 och 0,6 nM receptor inkuberas i frånvaro (total bindning) och närvaro (icke-specifik bindning) av 1 μM ej inmärkt östradiol. Specifik bindning, beräknad som differensen av total och icke-specifik bindning, ritas i ett diagram mot den nominella receptorkoncentrationen. Den receptorkoncentration som ger specifika bindningsvärden motsvarande 40 % av tillsatt radioaktivt inmärkt ligand relateras till motsvarande receptorkoncentration, och denna receptorkoncentration ska användas för tester av mättnad och kompetitiv bindning. Ofta överensstämmer en slutlig hrER-koncentration på 0,2 nM med detta förhållande.

13. Om 40-procentskriteriet vid upprepade försök inte kan uppfyllas ska experimentets uppställning kontrolleras för möjliga fel. Svårigheter att uppnå 40-procentskriteriet kan indikera att det finns väldigt lite aktiv receptor i satsen med rekombinant receptor och man bör då överväga att använda en annan sats.

Mättnadstest

14. Åtta ökande koncentrationer av [3H]-17β-östradiol ska utvärderas i tripletter, enligt följande tre betingelser (se tabell 2): a. I frånvaron av ej inmärkt 17β-östradiol och närvaro av ER. Här fastställs total bindning genom att mäta radioaktiviteten i de brunnar som enbart innehåller [3H]-17β-östradiol. b. I närvaron av 2000 gångers koncentrationsöverskott av ej inmärkt 17β-östradiol över inmärkt 17β-östradiol och närvaro av ER. Avsikten med denna betingelse är att mätta de aktiva bindningsplatserna med ej inmärkt 17β-östradiol och, genom att mäta radioaktiviteten i brunnarna, fastställa den icke-specifika bindningen. Eventuellt kvarvarande radioaktiv östradiol som kan binda till receptorn anses binda till en icke-specifik bindningsplats eftersom den tillsatta icke-radioaktiva östradiolen ska ha så hög koncentration att den har bundit till alla specifika bindningsplatser på receptorn. c. I frånvaro av ej inmärkt 17β-östradiol och frånvaro av ER (fastställande av total radioaktivitet). Beredning av lösningar med [3H]-17β-östradiol respektive ej inmärkt 17β-östradiol och hrERα 15. En 40 nM lösning av [3H]-17β-östradiol ska beredas från en 1 μM stamlösning av [3H]-17β-östradiol i DMSO, genom att tillsätta DMSO (för att bereda 200 nM) och testbuffert vid rumstemperatur (för att bereda 40 nM). Med hjälp av denna 40 nM-lösning, bereds seriespädningen av [3H]-17β-östradiol i koncentrationer från 0,313 nM till 40 nM med rumstempererad testbuffert (som angivet i kolumn 12 i tabell 2). De slutliga testkoncentrationerna, från 0,0313 nM till 4,0 nM, erhålls genom att tillsätta 10 μl av dessa lösningar till respektive testbrunnar i en 96-hålsmikrotiterplatta (se tabellerna 2 och 3) Beredning av testbuffert, beräkning av ursprunglig stamlösning av [3H]-17β-östradiol utifrån dess specifika aktivitet, beredning av spädningar och fastställande av koncentrationer beskrivs i detalj i CERI-protokollet (2). 16. Spädningar av ej inmärkta 17β-östradiollösningar ska beredas från en 1 nM 17β-östradiol-stamlösning genom att tillsätta testbuffert och på så sätt erhålla åtta ökande koncentrationer, initialt från 0,625 μM till 80 μM. De slutliga testkoncentrationerna, från 0,0625 till 8 μM, erhålls genom att tillsätta 10 μl av dessa lösningar till respektive testbrunnar i en 96-hålsmikrotiterplatta som reserverats för att mäta icke-specifik bindning (se tabellerna 2 och 3). Beredning av spädningar av ej inmärkt 17β-östradiol beskrivs i detalj i CERI-protokollet (2). 17. Den receptorkoncentration som ger specifik bindning av 40 ± 10 % bör användas (se punkterna 12–13). Lösningen med hrERα ska beredas med iskall testbuffert omedelbart före dess användning, det vill säga efter att alla brunnar för total bindning, icke-specifik bindning och enbart radioaktiv ligand har beretts. 18. Förbered 96-hålsmikrotiterplattorna enligt schema i tabell 2, med 3 replikat per [3H]-17β-östradiolkoncentration. Fördelning över plattan av volymer av [3H]-17β-östradiol, ej inmärkt 17β-östradiol, buffert och receptor ges i tabell 3. Tabell 2 Upplägg för mikrotiterplatta till mättnadsbindningstest TB Total bindning. NSB Icke-specifik bindning. [3H]E2 [3H]-17β-östradiol. E2 ej inmärkt 17β-östradiol. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 För mätning av TB För mätning av NSB För kvantitativ analys av enbart radioaktiv ligand Ej inmärkta E2-spädningar för plattkolumn 4–6 [3H]E2-spädningar för plattkolumn 1–9 A 0,0313 nM [3H]E2 + ER 0,0313 nM [3H]E2 + 0,0625 μM E2 + ER 0,0313 nM 0,625 μM 0,313 nM B 0,0625 nM [3H]E2+ ER 0,0625 nM [3H]E2+ 0,125 μM E2+ ER 0,0625 nM 1,25 μM 0,625 nM C 0,125 nM [3H]E2+ ER 0,125 nM [3H]E2+ 0,25 μM E2+ ER 0,125 nM 2,5 μM 1,25 nM D 0,250 nM [3H]E2+ ER 0,250 nM [3H]E2+ 0,5 μM E2+ ER 0,250 nM 5 μM 2,5 nM E 0,50 nM [3H]E2+ ER 0,50 nM [3H]E2+ 1 μM E2+ ER 0,50 nM 10 μM 5 nM F 1,00 nM [3H]E2+ ER 1,00 nM [3H]E2+ 2 μM E2+ ER 1,00 nM 20 μM 10 nM G 2,00 nM [3H]E2+ ER 2,00 nM [3H]E2+ 4 μM E2+ ER 2,00 nM 40 μM 20 nM H 4,00 nM [3H]E2+ ER 4,00 nM [3H]E2+ 8 μM E2+ ER 4,00 nM 80 μM 40 nM Tabell 3 Volymer för reagenser till mättnadstest i mikrotiterplatta Kolumn-nummer 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Beredningssteg TB-brunnar NSB-brunnar Endast radioaktivt märkt ligand Volymer för beståndsdelar till ovannämnda reaktionsbrunnar och turordning för tillsats Buffert 60 μl 50 μl 90 μl Ej inmärkt E2 från kolumn 11 i tabell 2 – 10 μl – [3H]E2 från kolumn 12 i tabell 2 10 μl 10 μl 10 μl hrERα 30 μl 30 μl – Total reaktionsvolym 100 μl 100 μl 100 μl Inkubation EFTER 2 TIMMARS INKUBATION Kvantifiering av radioaktiviteten precis efter beredning. Ingen inkubation Behandling med 0,4 % DCC Ja Ja Nej Volym av 0,4 % DCC 100 μl 100 μl – Filtrering Ja Ja Nej DPM-MÄTNING Kvantifieringsvolym att tillsätta till scintillationsblandningen 100 μl 100 μl 50 μl 19. Testmikrotiterplattor avsedda för bestämning av total bindning och icke-specifik bindning bör inkuberas vid rumstemperatur (22 °C till 28 °C) i två timmar.

Mätning av [3H]-17β-östradiol bunden till hrERα

20. Efter två timmars inkubation ska den [3H]-17β-östradiol som bundit till hrERα separeras från obunden [3H]-17β-östradiol genom tillsats av 100 μl iskall 0,4 % DCC-suspension till brunnarna. Plattorna ska då placeras på is i 10 minuter och reaktionsblandningen och DCC-suspensionen filtreras, genom att överföras till ett mikrotiterplattefilter, för att avlägsna DCC. Därefter ska 100 μl av filtratet tillsättas till scintillationsvätskan i scintillationsvialer för bestämning av sönderfall per minut (disintegrations per minute, dpm) i varje vial med hjälp av vätskescintillationsräknare.

21. Alternativt, om mikrotiterplattefilter inte finns att tillgå, kan DCC avlägsnas genom centrifugering. Sedan tas 50 μl supernatant, innehållande den hrERα-bundna [3H]-17β-östradiolen, extremt försiktigt så att man inte råkar förorena brunnarna genom att vidröra DCC och används för scintillationsräkning.

22. Betingelsen med enbart radioaktivt märkt ligand används för att fastställa sönderfall per minut (dpm) hos den [3H]-17β-östradiol som har tillsatts till testbrunnarna. Radioaktiviteten ska kvantifieras precis efter beredning. Dessa brunnar ska inte inkuberas och inte heller behandlas med DCC-suspension utan tillsättas direkt till scintillationsvätskan. Dessa mätningar visar, i dpm, hur mycket [3H]-17β-östradiol som tillsattes till varje uppsättning brunnar för total bindning och icke-specifik bindning.

Kompetitivt bindningstest

23. Det kompetitiva bindningstestet mäter bindningen av [3H]-17β-östradiol vid en viss koncentration i närvaro av ökande koncentration av testkemikalie. Tre parallella replikat bör användas för varje koncentration i varje testomgång. Dessutom bör tre icke-parallella testomgångar utföras för varje testad kemikalie. Testet bör utföras i en eller flera 96-hålsmikrotiterplattor.

Kontroller

24. Varje experiment ska inkludera parallella lösningsmedelprover och kontroller (dvs. referensöstrogen, svag bindare och icke-bindare). Fullständiga koncentrationskurvor för östrogenreferens och kontroller (dvs. svag bindare resp. icke-bindare) ska placeras i en platta vid varje testomgång. Alla andra plattor ska innehålla: i) en hög koncentration (maximal bortträngning, dvs. ungefär fullständig bortträngning av radioaktivt inmärkt ligand) och en mellankoncentration (ungefär IC50) av E2 respektive svag bindare i tripletter, ii) lösningsmedelskontroll och icke-specifik bindning, båda som tripletter. Förfaranden för beredning av testbuffert [3H]-17β-östradiol, hrERα och testkemikalielösningar beskrivs ingående i CERI-protokollet (2).

Lösningsmedelskontroll

25. Lösningsmedelskontrollen indikerar att lösningsmedlet inte interagerar med testsystemet och mäter också total bindning (TB). Det mest lämpliga lösningsmedlet är DMSO. Men om testkemikaliens högsta koncentration inte är löslig i DMSO kan etanol användas. Koncentrationen av DMSO i de slutliga testbrunnarna ska vara 2,05 % och kan ökas till 2,5 % om testkemikalien visar bristande löslighet. Koncentrationer av DMSO över 2,5 % ska inte användas eftersom högre koncentrationer av lösningsmedel interfererar med testet. Till testkemikalier som inte är lösliga i DMSO men lösliga i etanol kan ett maximum av 2 % etanol användas i testet utan interferens.

Buffertkontroll

26. Buffertkontrollen (BC) ska inte innehålla vare sig lösningsmedel eller testkemikalie men testets alla övriga ingående delar. Resultaten för buffertkontrollen jämförs med lösningsmedelskontrollen för att säkerställa att det valda lösningsmedlet inte påverkar testsystemet.

Stark bindare (referensöstrogen)

27. Den endogena liganden är 17β-östradiol (CAS-nr 50-28-2) och den binder med hög affinitet till alfa-subtypen av ER. En standardkurva med ej inmärkt 17β-östradiol ska upprättas för varje kompetitivt hrERα-bindningstest, för att möjliggöra en bedömning av variationen när testet, över tid, upprepas i samma laboratorium. Åtta lösningar av ej inmärkt 17β-östradiol ska beredas i DMSO och testbuffert för att användas till standardkurvan, med slutlig koncentration i testbrunnarna och spridning som följer: 10–6, 10–7, 10–8, 10–8,5, 10–9, 10–9,5, 10–10, 10–11 M. Den högsta koncentrationen av ej inmärkt 17β–östradiol (1 μM) bör tjäna som indikator för icke-specifik bindning. Denna koncentration markeras med märkningen NSB i tabell 4 även om den också är en del av standardkurvan.

Svag bindare

28. En svag bindare (noretynodrel [CAS-nr 68-23-5] eller alternativt noretindron [CAS-nr 68-22-4]) bör inkluderas för att påvisa varje experiments känslighet och möjliggöra en bedömning av variation när testet används längre perioder. Åtta lösningar av den svaga bindaren ska beredas i DMSO och testbuffert för att användas till standardkurvan, med slutlig koncentration i testbrunnarna som följer: 10–4,5, 10–5,5, 10–6, 10–6,5, 10–7, 10–7,5, 10–8 och 10–9 M.

Icke-bindare

29. Oktyltrietoxisilan (OTES, CAS-nr 2943-75-1) ska användas som negativ kontroll (icke-bindare). Den ger återkoppling om att testet, så som det utförs, kommer att detektera testkemikalier som inte binder till hrERα. Åtta lösningar av icke-bindaren ska beredas i DMSO och testbuffert för att användas till standardkurvan, med slutlig koncentration i testbrunnarna som följer: 10–3,10–4, 10–5, 10–6, 10–7, 10–8, 10–9, 10–10 M. Di-n-butylftalat (DBP, CAS-nr 84-72-2) kan användas som alternativ icke-bindare, men är endast testad upp till 10–4 M. Maximal löslighet för DBP i testet har visats vara 10–4 M.

hrERα-koncentration

30. Den mängd receptor som ger en specifik bindning på 40 ± 10 % bör användas (se punkterna 12–13 i tillägg 3). Lösningen med hrERα ska beredas genom spädning av funktionellt hrERα i iskall testbuffert, omedelbart före användning.

[3H]-17β-östradiol

31. Slutkoncentrationen av [3H]-17β-östradiol i testbrunnarna bör vara 0,5 nM.

Testkemikalier

32. Vid det första tillfället är det nödvändigt att genomföra ett löslighetstest för att fastställa löslighetsgränsen för varje testkemikalie och för att identifiera lämpligt koncentrationsintervall att använda sig av under testet. Samtliga testkemikaliers respektive löslighetsgräns i lösningsmedlet ska fastställas initialt och vidare bekräftas under testbetingelser. Den i testet testade slutkoncentrationen bör inte överstiga 1 mM. Intervallsökning omfattar en lösningsmedelskontroll och minst åtta logaritmiska seriespädningar, som börjar vid maximal acceptabel koncentration (t.ex. 1 mM eller lägre, baserat på löslighetsgräns), och närvaron av iakttagen grumlighet eller fällning (se även punkt 35 i tillägg 3). När koncentrationsintervallet för testet har fastställts, ska en testkemikalie testas med åtta logaritmiska koncentrationer, lämpligt utspridda enligt definitionen i det föregående intervallsökningstestet. Koncentrationer i det andra och tredje experimenten bör, vid behov, anpassas ytterligare för en bättre identifiering av koncentration–responskurvan.

33. Spädningar av testkemikalien ska beredas i lämpligt lösningsmedel (se punkt 25 i tillägg 3). Om testkemikaliens högsta koncentration inte är löslig i vare sig DMSO eller etanol, och en tillsats av mer lösningsmedel skulle göra att koncentrationen av lösningsmedel i det slutliga provröret överskred den godtagbara gränsen, kan den högsta koncentrationen sänkas till nästa lägre koncentration. I sådana fall kan ytterligare en koncentration läggas till i den lägre änden av koncentrationsserien. Övriga koncentrationer i serien bör förbli oförändrade.

34. Testkemikalielösningarna ska iakttas noggrant vid tillsatsen till testbrunnen, eftersom testkemikalien kan fälla ut i detta steg. Data för alla brunnar som innehåller en fällning ska uteslutas från kurvanpassning och anledningen till uteslutningen av data noteras.

35. Om det sedan tidigare från andra källor finns information som tillhandahåller ett log(IC50)-värde för en testkemikalie, kan det vara lämpligt att geometriskt sprida spädningarna närmre runt det förväntade log(IC50)-värdet (dvs. 0,5 log-enheter). Slutresultaten bör återspegla tillräcklig spridning av koncentrationer på båda sidor om log(IC50)-värdet, inklusive topp och botten, så att bindningskurvan kan karakteriseras tillfredsställande.

Organisering av testplattor

36. Märkta mikrotiterplattor ska beredas för sexfaldiga inkubationer med lösningsmedelskontrollen, den högsta koncentrationen av referensöstrogen (E2) som också tjänar som indikator på icke-specifik bindning (NSB), buffertkontrollen, och trefaldiga inkubationer för var och en av de åtta koncentrationerna av icke-bindande kontroll (oktyltrietoxisilan), de sju lägre koncentrationerna av referensöstrogenet (E2), de åtta koncentrationerna av svag bindare (noretynodrel eller noretindron) och de åtta koncentrationerna av varje testkemikalie (TC). Ett exempel på upplägget med plattschema över fullständiga koncentrationskurvor för referensöstrogenet och kontroller ges nedan i tabell 4. Ytterligare mikrotiterplattor används för testkemikalierna och ska inkludera plattkontroller, det vill säga i) en hög koncentration (maximal bortträngning) och en mellankoncentration (ungefär IC50) av vardera E2 och svag bindare i triplikat, ii) lösningsmedelskontroll (som total bindning) och icke-specifik bindning, båda sexfaldiga (tabell 5). Ett exempel på plattupplägg för ett kompetitivt test med tre okända testkemikalier ges i tillägg 3.3. De koncentrationer som anges i tabellen, samt i tabeller 4 och 5, avser slutkoncentrationer i testbrunnarna. Maximal koncentration för E2 ska vara 1 × 10-7 M och för den svaga bindaren bör den högsta koncentrationen som används för den svaga bindaren på platta 1 användas. Laboratoriet ska fastställa IC50 med hjälp av sin historiska kontrolldatabas. Detta värde kan förväntas vara jämförbart med det som iakttagits i valideringsstudierna (se tabell 1).

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12

Buffertkontroll och positiv kontroll (E2) | Svagt positiv (Noretynodrel) | Negativ kontroll (OTES) | TB och NSB

A | Blankprov | 1 × 10–9 M | 1 × 10–10 M | TB (lösningsmedelskontroll) (2,05 % DMSO)

B | E2 (1 × 10–11 M) | 1 × 10–8 M | 1 × 10–9 M

C | E2 (1 × 10–10 M) | 1 × 10–7,5 M | 1 × 10–8 M | NSB (10–6 M E2)

D | E2 (1 × 10–9,5 M) | 1 × 10–7 M | 1 × 10–7 M

E | E2 (1 × 10–9 M) | 1 × 10–6,5 M | 1 × 10–6 M | Buffertkontroll

F | E2 (1 × 10–8,5 M) | 1 × 10–6 M | 1 × 10–5 M

G | E2 (1 × 10–8 M) | 1 × 10–5,5 M | 1 × 10–4 M | Blankprov (radioaktivitet)

H | E2 (1 × 10–7 M) | 1 × 10–4,5 M | 1 × 10–3 M

Tabell 5 Upplägg för mikrotiterplatta till kompetitivt bindningstest, tillkommande plattor för testkemikalier (TC) och plattkontroller

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12

Testkemikalie 1 (TC-1) | Testkemikalie-2 (TC-2) | Testkemikalie-3 (TC-3) | Kontroller

A | TC-1 (1 × 10–10 M) | TC-2 (1 × 10–10 M) | TC-3 (1 × 10–10 M) | E2 (1 × 10–7 M)

B | TC-1 (1 × 10–9 M) | TC-2 (1 × 10–9 M) | TC-3 (1 × 10–9 M) | E2 (IC50)

C | TC-1 (1 × 10–8 M) | TC-2 (1 × 10–8 M) | TC-3 (1 × 10–8 M) | NE (1 × 10–4,5 M)

D | TC-1 (1 × 10–7 M) | TC-2 (1 × 10–7 M) | TC-3 (1 × 10–7 M) | NE (IC50)

E | TC-1 (1 × 10–6 M) | TC-2 (1 × 10–6 M) | TC-3 (1 × 10–6 M) | NSB (10–6 M E2)

F | TC-1 (1 × 10–5 M) | TC-2 (1 × 10–5 M) | TC-3 (1 × 10–5 M)

G | TC-1 (1 × 10–4 M) | TC-2 (1 × 10–4 M) | TC-3 (1 × 10–4 M) | (TB) (Lösningsmedelskontroll)

H | TC-1 (1 × 10–3 M) | TC-2 (1 × 10–3 M) | TC-3 (1 × 10–3 M)

Slutförande av kompetitivt bindningstest

37. Med undantag för brunnarna för total bindning och blankprov (för radioaktiv märkning), så som visas i tabell 6, ska 50 μl av testbufferten överföras till varje brunn och blandas med 10 μl lösningsmedelskontroll, referensöstrogen (E2), svag bindare, icke-bindare eller testkemikalier och 10 μl av en 5 nM [3H]-17β-östradiollösning. Sedan tillsätts 30 μl iskall receptorlösning till varje platta och blandas försiktigt. Lösningen med hrERα ska vara den sista reagens som tillsätts till brunnarna. Testmikrotiterplattorna inkuberas i rumstemperatur (22–28 °C) i 2 timmar. Tabell 6 Tillsatsvolymer av beståndsdelar till kompetitivt bindningstest för hrER, i mikrotiterplattor Beredningssteg Andra än TB-brunnar TB-brunnar Blankprov (för radioaktiv märkning) Volymer för beståndsdelar till ovannämnda reaktionsbrunnar och turordning för tillsats Rumstempererad testbuffert 50 μl 60 μl 90 μl Ej inmärkt E2, svag bindare, icke-bindare, lösningsmedel och testkemikalier 10 μl — — [3H]-17β-östradiol för att ge en slutkoncentration på 0,5 nM (dvs. 5 nM) 10 μl 10 μl 10 μl Fastställd hrERα-koncentration (se punkterna 12–13) 30 μl 30 μl – Total volym i varje testbrunn 100 μl 100 μl 100 μl

38. Kvantifieringen av [3H]-17β-östradiol bunden till hrERα, efter separation av [3H]-17β-östradiol bunden till hrERα från fri [3H]-17β-östradiol genom tillsats av 100 μl av iskall DCC-suspension till varje brunn, bör sedan utföras enligt instruktioner för mättnadsbindningstestet, i punkterna 21–23 i tillägg 3.

39. Brunnarna G10–12 och H10–12 (identifierade som blankprov [för radioaktiv märkning] i tabell 4) anger dpm för [3H]-inmärkt östradiol i 10 μl. Dosen om 10 μl bör överföras direkt till scintillationsvätskan.

Acceptanskriterier

Mättnadsbindningstest

40. Den specifika bindningskurvan bör nå en platå med ökande koncentrationer av [3H]-17β-östradiol, indikerande mättnad av hrERα med ligand.

41. Den specifika bindningen vid 0,5 nM av [3H]-17β-östradiol bör vara inom acceptansintervallet 30–50 % för genomsnittet av uppmätt total tillsatt radioaktivitet från de olika testomgångarna. Enstaka mindre avvikelser utanför detta intervall kan godtas, men om testomgångar konsekvent faller utanför intervallet eller om en viss omgång signifikant faller utanför intervallet bör proteinkoncentrationen justeras och mättnadstestet upprepas.

42. Data bör bilda ett linjärt Scatchard-diagram.

43. Den icke-specifika bindningen bör inte vara överdrivet stor. Storleken på den icke-specifika bindningen bör normalt vara < 35 % av den totala bindningen. Men kvoten kan emellanåt överskrida denna gräns vid mätningar av mycket låga dpm-tal för den lägsta koncentrationen av testad radioaktivt inmärkt 17β-östradiol.

Kompetitivt bindningstest

44. Ökande koncentrationer av ej inmärkt 17β-östradiol bör tränga bort [3H]-17β-östradiol från receptorn på ett sätt som överensstämmer med kompetitiv bindning till en bindningsplats.

45. Den hämmande koncentrationen, IC50, för referensöstrogenet (dvs. 17β-östradiol) bör ungefär motsvara den molära koncentrationen för [3H]-17β-östradiol plus Kd-värdet, som fastställts vid mättnadsbindningstestet.

46. Den totala specifika bindningen bör genomgående hamna inom acceptansintervallet på 40 ± 10 % när den genomsnittliga uppmätta totala radioaktiva koncentrationen, som har tillsatts till varje brunn, har varit 0,5 nM vid flera testomgångar. Enstaka mindre avvikelser utanför detta intervall kan godtas, men om testomgångar konsekvent faller utanför intervallet eller om en viss omgång signifikant hamnar utanför intervallet bör proteinkoncentrationen justeras.

47. Lösningsmedlet bör inte påverka vare sig testets känslighet eller reproducerbarhet. Resultaten för lösningsmedelskontrollen (TB-brunnar) jämförs med buffertkontrollen för att säkerställa att det valda lösningsmedlet inte påverkar testsystemet. Om lösningsmedlet inte har någon effekt på testet bör resultaten för TB och buffertkontroll vara jämförbara.

48. Icke-bindaren bör inte tränga bort mer än 25 % av [3H]-17β-östradiolen från hrERα när den testas upp till 10–3 M (OTES) eller 10–4 M (DBP).

49. Prestandakriterier utarbetades för referensöstrogenet och två svaga bindare (t.ex. noretynodrel, noretindron) med hjälp av data från valideringsstudien av CERI-hrER-bindningstestet (bilaga N i referens 2). I valideringsstudien uppges 95-procentiga konfidensintervall för genomsnittet ± SD (n) för de deltagande fyra laboratoriernas alla kontrollomgångar. De 95-procentiga konfidensintervallen beräknades för kurvanpassningsparametrarna (dvs. topp, botten, Hill-koefficient [Hill slope], log[IC50]-värde) för referensöstrogenet och de svaga bindarna, och log10RBA-värdet för de svaga bindarna jämförda med referensöstrogenet. Tabell 1 anger förväntade intervall för kurvanpassningsparametrarna, vilka kan användas som prestandakriterier. I praktiken kan intervallet för IC50 variera något med det experimentellt erhållna Kd-värdet för den receptorberedning och ligandkoncentration som använts i testet.

50. Inga prestandakriterier för testkemikaliernas kurvanpassningsparametrar utarbetades på grund av den stora mängden möjliga testkemikalier och deras variation i möjliga affiniteter och utfall (t.ex. fullständig kurva, delkurva, ingen kurvanpassning). Men yrkesmässigt omdöme ska tillämpas vid granskning av resultaten från en testkemikalies alla testomgångar. Vidare ska man använda ett tillräckligt intervall av testkemikaliekoncentration för att klart kunna beskriva toppen (t.ex. 90–100 % bindning) på den kompetitiva bindningskurvan. Variationen mellan replikat vid varje koncentration av testkemikalie, liksom mellan de tre oberoende testomgångarna, ska vara rimlig och vetenskapligt försvarbar. Kontroller från en testkemikalies alla testomgångar bör hålla sig nära de prestandamätningar som har rapporterats för detta CERI-test och överensstämma med historiska kontrolldata från respektive laboratorium.

DATAANALYS

Mättnadsbindningstest

51. Både total och icke-specifik bindning mäts. Från dessa värden beräknas specifik bindning av ökande koncentrationer av [3H]-17β-östradiol under jämviktsförhållanden genom att subtrahera icke-specifik från total. Ett diagram över specifik bindning mot [3H]-17β-östradiol-koncentration bör nå en platå för maximal specifik bindning, vilken indikerar ett hrERα mättat av [3H]-17β-östradiol. Dessutom bör dataanalysen klargöra inbindning av [3H]-17β-östradiol till en enda bindningsplats med hög affinitet. Icke-specifik, total och specifik bindning bör illustreras med en mättnadsbindningskurva. Vidare analys av dessa data bör använda sig av icke-linjär regressionsanalys (t.ex. BioSoft, McPherson, 1985, Motulsky, 1995) med en slutlig dataredovisning i form av ett Scatchard-diagram.

52. Dataanalysen bör fastställa Bmax och Kd enbart utifrån totala bindningsdata, med antagandet att den icke-specifika bindningen är linjär, om inte en motivering ges för att använda en annan metod. Dessutom ska robust regression användas i fastställande av bästa anpassning, om inte annat val motiveras. Val av robust regressionsmetod ska anges. Korrigering för liganduttömning (t.ex. med hjälp av Swillens metod 1995) bör alltid användas i fastställande av Bmax och Kd utifrån mättnadsbindningsdata.

Kompetitivt bindningstest

53. Kurvan över kompetitiv bindning ritas som specifik [3H]-17β-östradiol-bindning mot koncentrationen av konkurrerande ligand (log10-enheter). Den koncentration av testkemikalie som hämmar 50 % av den maximala specifika [3H]-17β-östradiol-bindningen är IC50-värdet.

54. Uppskattningar av log(IC50)-värden för de positiva kontrollerna (t.ex. referensöstrogen och svag bindare) ska fastställas med hjälp av lämplig programvara för icke-linjär kurvanpassning så att de passar en fyraparameters Hill-ekvation (t.ex. BioSoft, McPherson, 1985, Motulsky, 1995). Kurvans topp, botten, lutning och log(IC50)-värde ska i allmänhet lämnas utan restriktion (unconstrained) vid anpassning av dessa kurvor. Robust regression ska användas i fastställande av bästa anpassning, om inte annat val motiveras. Ingen korrigering för liganduttömning ska göras. Efter inledande analys ska varje bindningskurva granskas för att säkerställa korrekt anpassning till modellen. Den svaga bindarens relativa bindningsaffinitet (RBA) beräknas som procentuell andel av dess log(IC50)-värde i förhållande till 17β-östradiols log(IC50)-värde. Resultat från de positiva kontrollerna och den icke-bindande kontrollen ska utvärderas genom att använda måtten på testprestanda i punkterna 44–49 i detta tillägg 3.

55. Data för alla testkemikalier ska analyseras med en stegvis strategi för att säkerställa att data analyseras korrekt och att varje kurva för kompetitiv bindning klassificeras korrekt. Det är lämpligt att en testkemikalies alla testomgångar initialt underkastas en standardiserad dataanalys som är identisk med den som använts för referensöstrogen och kontroller med svaga bindare (se punkt 54 i detta tillägg 3). När den är klar bör en teknisk granskning av kurvanpassningsparametrarna göras, liksom en visuell granskning av hur väl data stämmer med den genererade kurvan över kompetitiv bindning, för varje testomgång. Under denna tekniska granskning är följande iakttagelser goda indikationer på att testet och dataanalyserna har genomförts korrekt: en koncentrationsberoende minskning i procentuell, specifikt bunden [3H]-17β-östradiol, låg variation mellan de tekniska replikaten för varje kemisk koncentration och överensstämmelse mellan anpassningsparametrarna från de tre testomgångarna.

Tolkning av data

56. Förutsatt att samtliga acceptanskriterier är uppfyllda anses en testkemikalie binda till hrERα om data kan anpassas till en bindningskurva och den lägsta punkten på responskurvan, inom dataintervallet, är mindre än 50 % (figur 1).

57. Förutsatt att samtliga acceptanskriterier är uppfyllda, anses en testkemikalie inte binda till hrERα om data kan anpassas till en bindningskurva och den lägsta punkten på responskurvan, inom dataintervallet, är över 75 %, eller data inte kan anpassas till en bindningskurva och den lägsta, outjämnade genomsnittliga procentuella bindningen inom datamängdens koncentrationsgrupper är över 75 %.

58. Testkemikalier anses tvetydiga om inget av villkoren ovan uppfylls (t.ex. den lägsta punkten på den anpassade responskurvan ligger mellan 76 % och 51 %).

Tabell 7 Kriterier för klassificering utifrån en testkemikalies kurva över kompetitiv bindning

Klassificering | Kriterier

Bindarea | Data kan anpassas till en bindningskurva. Den lägsta punkten på responskurvan, inom dataintervallet, är mindre än 50 %.

Tvetydigc | Varje mätbar testomgång som varken är en bindare eller en icke-bindare (t.ex. den lägsta punkten längs den anpassade kurvan ligger mellan 76–51 %).

Figur 1 Exempel på klassificeringar av testkemikalier med hjälp av kurva för kompetitiv bindning.

59. Flera testomgångar genomförda med en viss testkemikalie, i samma laboratorium, kombineras genom att tilldela numeriska värden till varje testomgång och ta fram ett medelvärde enligt tabell 8. Resultaten för de kombinerade testomgångarna inom varje laboratorium jämförs med den förväntade klassificeringen för varje testkemikalie.

Tabell 8 Metod för klassificering av testkemikalier med användning av flera testomgångar inom ett laboratorium

Tilldelning av numeriska värden för enskilda testomgångar:

Klassificering | Numeriskt värde

Bindare | 2

Tvetydig | 1

Icke-bindare | 0

Klassificering av genomsnittligt numeriskt värde vid flera testomgångar:

Klassificering | Numeriskt värde

Bindare | Genomsnitt ≥ 1,5

Tvetydig | 0,5 ≤ Genomsnitt < 1,5

Icke-bindare | Genomsnitt < 0,5

TESTRAPPORT

60. Se punkt 24 i hrER-BINDNINGSTESTETS DELAR i denna testmetod.

1 Medelvärde ± standardavvikelse (SD) med provantal (n) beräknades genom skattning av kurvanpassningsparametrar (fyraparameters Hill-ekvation) för kontrollomgångar som utförts av fyra laboratorier under valideringsstudien (se bilaga N i referens 2).

2 Gränserna för 95-procentigt konfidensintervall anges som en vägledning för acceptanskriterier.

7 Här angivna koncentrationer är slutkoncentrationerna i varje brunn.

8 Spädningarna av ej inmärkt E2 och [3H]E2 kan beredas i en annan platta.

20 Om en vätskescintillationsräknare för mikrotiterplattor används för dpm-mätning är det inte lämpligt att bereda enbart radioaktivt märkt ligand i samma platta som TB och NSB. Den radioaktivt märkta liganden ska beredas separat i en annan platta.

21 Om centrifugering används för att avskilja DCC bör de 50 μl supernatant mätas i vätskescintillationsräknare för att undvika att DCC förorenar provet.

29 Provuppsättning för standard-mikrotiterplatta som ska ingå i varje experiment.

30 Notera att denna mikrotiterplatta ställs i ordning genom att använda de spädningar i spädningsplattan som beskrevs för standarder i föregående avsnitt. I detta exempel är den svaga bindaren noretinodrel (NE).

31 Faktiskt blankprov, brunnen används inte.

32 Blankprov, används inte under inkubationen, men för att bekräfta total, tillsatt radioaktivitet.

35 Korrekt beredda så att de ger slutkoncentration inom godtagbar lösningsmedelskoncentration.

Tillägg 3.1

TERMER

Tillägg 3.2

UPPLÄGG FÖR BRUNNAR TILL TEST AV KOMPETITIV BINDNING

Fast | A1 | 1 | Blankprov | BK | BK1 | — | — | — | — | — | — | —

Fast | A2 | 2 | Blankprov | BK | BK2 | — | — | — | — | — | — | —

Fast | A3 | 3 | Blankprov | BK | BK3 | — | — | — | — | — | — | —

Fast | B1 | 1 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S1 | 1,00 × 10-10 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-11

Fast | B2 | 2 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S1 | 1,00 × 10-10 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-11

Fast | B3 | 3 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S1 | 1,00 × 10-10 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-11

Fast | C1 | 1 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S2 | 1,00 × 10-9 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-10

Fast | C2 | 2 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S2 | 1,00 × 10-9 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-10

Fast | C3 | 3 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S2 | 1,00 × 10-9 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-10

Fast | D1 | 1 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S3 | 3,16 × 10-9 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 3,2 × 10-10

Fast | D2 | 2 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S3 | 3,16 × 10-9 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 3,2 × 10-10

Fast | D3 | 3 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S3 | 3,16 × 10-9 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 3,2 × 10-10

Fast | E1 | 1 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S4 | 1,00 × 10-8 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-9

Fast | E2 | 2 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S4 | 1,00 × 10-8 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-9

Fast | E3 | 3 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S4 | 1,00 × 10-8 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-9

Fast | F1 | 1 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S5 | 3,16 × 10-8 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 3,2 × 10-9

Fast | F2 | 2 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S5 | 3,16 × 10-8 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 3,2 × 10-9

Fast | F3 | 3 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S5 | 3,16 × 10-8 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 3,2 × 10-9

Fast | G1 | 1 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S6 | 1,00 × 10-7 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-8

Fast | G2 | 2 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S6 | 1,00 × 10-7 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-8

Fast | G3 | 3 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S6 | 1,00 × 10-7 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-8

Fast | H1 | 1 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S7 | 1,00 × 10-6 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-7

Fast | H2 | 2 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S7 | 1,00 × 10-6 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-7

Fast | H3 | 3 | Icke-radioaktiv E2 | Fast | S7 | 1,00 × 10-6 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-7

Fast | A4 | 1 | Noretynodrel | NE | WP1 | 1,00 × 10-8 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-9

Fast | A5 | 2 | Noretynodrel | NE | WP1 | 1,00 × 10-8 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-9

Fast | A6 | 3 | Noretynodrel | NE | WP1 | 1,00 × 10-8 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-9

Fast | B4 | 1 | Noretynodrel | NE | WP2 | 1,00 × 10-7 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-8

Fast | B5 | 2 | Noretynodrel | NE | WP2 | 1,00 × 10-7 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-8

Fast | B6 | 3 | Noretynodrel | NE | WP2 | 1,00 × 10-7 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-8

Fast | C4 | 1 | Noretynodrel | NE | WP3 | 3,16 × 10-7 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 3,2 × 10-8

Fast | C5 | 2 | Noretynodrel | NE | WP3 | 3,16 × 10-7 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 3,2 × 10-8

Fast | C6 | 3 | Noretynodrel | NE | WP3 | 3,16 × 10-7 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 3,2 × 10-8

Fast | D4 | 1 | Noretynodrel | NE | WP4 | 1,00 × 10-6 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-7

Fast | D5 | 2 | Noretynodrel | NE | WP4 | 1,00 × 10-6 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-7

Fast | D6 | 3 | Noretynodrel | NE | WP4 | 1,00 × 10-6 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-7

Fast | E4 | 1 | Noretynodrel | NE | WP5 | 3,16 × 10-6 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 3,2 × 10-7

Fast | E5 | 2 | Noretynodrel | NE | WP5 | 3,16 × 10-6 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 3,2 × 10-7

Fast | E6 | 3 | Noretynodrel | NE | WP5 | 3,16 × 10-6 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 3,2 × 10-7

Fast | F4 | 1 | Noretynodrel | NE | WP6 | 1,00 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-6

Fast | F5 | 2 | Noretynodrel | NE | WP6 | 1,00 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-6

Fast | F6 | 3 | Noretynodrel | NE | WP6 | 1,00 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-6

Fast | G4 | 1 | Noretynodrel | NE | WP7 | 3,16 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 3,2 × 10-6

Fast | G5 | 2 | Noretynodrel | NE | WP7 | 3,16 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 3,2 × 10-6

Fast | G6 | 3 | Noretynodrel | NE | WP7 | 3,16 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 3,2 × 10-6

Fast | H4 | 1 | Noretynodrel | NE | WP8 | 3,16 × 10-4 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 3,2 × 10-5

Fast | H5 | 2 | Noretynodrel | NE | WP8 | 3,16 × 10-4 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 3,2 × 10-5

Fast | H6 | 3 | Noretynodrel | NE | WP8 | 3,16 × 10-4 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 3,2 × 10-5

Fast | A7 | 1 | OTES | N | OTES1 | 1,00 × 10-9 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-10

Fast | A8 | 2 | OTES | N | OTES1 | 1,00 × 10-9 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-10

Fast | A9 | 3 | OTES | N | OTES1 | 1,00 × 10-9 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-10

Fast | B7 | 1 | OTES | N | OTES2 | 1,00 × 10-8 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-9

Fast | B8 | 2 | OTES | N | OTES2 | 1,00 × 10-8 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-9

Fast | B9 | 3 | OTES | N | OTES2 | 1,00 × 10-8 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-9

Fast | C7 | 1 | OTES | N | OTES3 | 1,00 × 10-7 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-8

Fast | C8 | 2 | OTES | N | OTES3 | 1,00 × 10-7 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-8

Fast | C9 | 3 | OTES | N | OTES3 | 1,00 × 10-7 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-8

Fast | D7 | 1 | OTES | N | OTES4 | 1,00 × 10-6 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-7

Fast | D8 | 2 | OTES | N | OTES4 | 1,00 × 10-6 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-7

Fast | D9 | 3 | OTES | N | OTES4 | 1,00 × 10-6 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-7

Fast | E7 | 1 | OTES | N | OTES5 | 1,00 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-6

Fast | E8 | 2 | OTES | N | OTES5 | 1,00 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-6

Fast | E9 | 3 | OTES | N | OTES5 | 1,00 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-6

Fast | F7 | 1 | OTES | N | OTES6 | 1,00 × 10-4 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-5

Fast | F8 | 2 | OTES | N | OTES6 | 1,00 × 10-4 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-5

Fast | F9 | 3 | OTES | N | OTES6 | 1,00 × 10-4 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-5

Fast | G7 | 1 | OTES | N | OTES7 | 1,00 × 10-3 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-4

Fast | G8 | 2 | OTES | N | OTES7 | 1,00 × 10-3 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-4

Fast | G9 | 3 | OTES | N | OTES7 | 1,00 × 10-3 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-4

Fast | H7 | 1 | OTES | N | OTES8DBP7 | 1,00 × 10-2 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-3

Fast | H8 | 2 | OTES | N | OTES88 | 1,00 × 10-2 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-3

Fast | H9 | 3 | OTES | N | OTES8 | 1,00 × 10-2 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-3

Fast | A10 | 1 | Total bindning | TB | TB1 | — | 30 | 60 | 10 | — | 100 | —

Fast | A11 | 2 | Total bindning | TB | TB2 | — | 30 | 60 | 10 | — | 100 | —

Fast | A12 | 3 | Total bindning | TB | TB3 | — | 30 | 60 | 10 | — | 100 | —

Fast | B10 | 4 | Total bindning | TB | TB4 | — | 30 | 60 | 10 | — | 100 | —

Fast | B11 | 5 | Total bindning | TB | TB5 | — | 30 | 60 | 10 | — | 100 | —

Fast | B12 | 6 | Total bindning | TB | TB6 | — | 30 | 60 | 10 | — | 100 | —

Fast | C10 | 1 | Icke-radioaktiv E2 (hög) | NSB | S1 | 1,00 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-6

Fast | C11 | 2 | Icke-radioaktiv E2 (hög) | NSB | S2 | 1,00 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-6

Fast | C12 | 3 | Icke-radioaktiv E2 (hög) | NSB | S3 | 1,00 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-6

Fast | D10 | 4 | Icke-radioaktiv E2 (hög) | NSB | S4 | 1,00 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-6

Fast | D11 | 5 | Icke-radioaktiv E2 (hög) | NSB | S5 | 1,00 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-6

Fast | D12 | 6 | Icke-radioaktiv E2 (hög) | NSB | S6 | 1,00 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-6

Fast | E10 | 1 | Buffertkontroll | BC | BC1 | — | — | 100 | — | — | 100 | —

Fast | E11 | 2 | Buffertkontroll | BC | BC2 | — | — | 100 | — | — | 100 | —

Fast | E12 | 3 | Buffertkontroll | BC | BC3 | — | — | 100 | — | — | 100 | —

Fast | F10 | 4 | Buffertkontroll | BC | BC4 | — | — | 100 | — | — | 100 | —

Fast | F11 | 5 | Buffertkontroll | BC | BC5 | — | — | 100 | — | — | 100 | —

Fast | F12 | 6 | Buffertkontroll | BC | BC6 | — | — | 100 | — | — | 100 | —

Fast | G10 | 1 | Blankprov (för radioaktiv märkning) | Radioaktiv | H1 | — | 90 | — | 10 | — | 100 | —

Fast | G11 | 2 | Blankprov (för radioaktiv märkning) | Radioaktiv | H2 | — | 90 | — | 10 | — | 100 | —

Fast | G12 | 3 | Blankprov (för radioaktiv märkning) | Radioaktiv | H3 | — | 90 | — | 10 | — | 100 | —

Fast | H10 | 4 | Blankprov (för radioaktiv märkning) | Radioaktiv | H4 | — | 90 | — | 10 | — | 100 | —

Fast | H11 | 5 | Blankprov (för radioaktiv märkning) | Radioaktiv | H5 | — | 90 | — | 10 | — | 100 | —

Fast | H12 | 6 | Blankprov (för radioaktiv märkning) | Radioaktiv | H6 | — | 90 | — | 10 | — | 100 | —

P1 | A1 | 1 | Okänd 1 | U1 | 1 | 1,00 × 10-9 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-10

P1 | A2 | 2 | Okänd 1 | U1 | 1 | 1,00 × 10-9 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-10

P1 | A3 | 3 | Okänd 1 | U1 | 1 | 1,00 × 10-9 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-10

P1 | B1 | 1 | Okänd 1 | U1 | 2 | 1,00 × 10-8 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-9

P1 | B2 | 2 | Okänd 1 | U1 | 2 | 1,00 × 10-8 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-9

P1 | B3 | 3 | Okänd 1 | U1 | 2 | 1,00 × 10-8 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-9

P1 | C1 | 1 | Okänd 1 | U1 | 3 | 1,00 × 10-7 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-8

P1 | C2 | 2 | Okänd 1 | U1 | 3 | 1,00 × 10-7 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-8

P1 | C3 | 3 | Okänd 1 | U1 | 3 | 1,00 × 10-7 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-8

P1 | D1 | 1 | Okänd 1 | U1 | 4 | 1,00 × 10-6 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-7

P1 | D2 | 2 | Okänd 1 | U1 | 4 | 1,00 × 10-6 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-7

P1 | D3 | 3 | Okänd 1 | U1 | 4 | 1,00 × 10-6 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-7

P1 | E1 | 1 | Okänd 1 | U1 | 5 | 1,00 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-6

P1 | E2 | 2 | Okänd 1 | U1 | 5 | 1,00 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-6

P1 | E3 | 3 | Okänd 1 | U1 | 5 | 1,00 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-6

P1 | F1 | 1 | Okänd 1 | U1 | 6 | 1,00 × 10-4 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-5

P1 | F2 | 2 | Okänd 1 | U1 | 6 | 1,00 × 10-4 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-5

P1 | F3 | 3 | Okänd 1 | U1 | 6 | 1,00 × 10-4 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-5

P1 | G1 | 1 | Okänd 1 | U1 | 7 | 1,00 × 10-3 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-4

P1 | G2 | 2 | Okänd 1 | U1 | 7 | 1,00 × 10-3 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-4

P1 | G3 | 3 | Okänd 1 | U1 | 7 | 1,00 × 10-3 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-4

P1 | H1 | 1 | Okänd 1 | U1 | 8 | 1,00 × 10-2 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-3

P1 | H2 | 2 | Okänd 1 | U1 | 8 | 1,00 × 10-2 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-3

P1 | H3 | 3 | Okänd 1 | U1 | 8 | 1,00 × 10-2 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-3

P1 | A4 | 1 | Okänd 2 | U2 | 1 | 1,00 × 10-9 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-10

P1 | A5 | 2 | Okänd 2 | U2 | 1 | 1,00 × 10-9 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-10

P1 | A6 | 3 | Okänd 2 | U2 | 1 | 1,00 × 10-9 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-10

P1 | B4 | 1 | Okänd 2 | U2 | 2 | 1,00 × 10-8 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-9

P1 | B5 | 2 | Okänd 2 | U2 | 2 | 1,00 × 10-8 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-9

P1 | B6 | 3 | Okänd 2 | U2 | 2 | 1,00 × 10-8 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-9

P1 | C4 | 1 | Okänd 2 | U2 | 3 | 1,00 × 10-7 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-8

P1 | C5 | 2 | Okänd 2 | U2 | 3 | 1,00 × 10-7 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-8

P1 | C6 | 3 | Okänd 2 | U2 | 3 | 1,00 × 10-7 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-8

P1 | D4 | 1 | Okänd 2 | U2 | 4 | 1,00 × 10-6 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-7

P1 | D5 | 2 | Okänd 2 | U2 | 4 | 1,00 × 10-6 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-7

P1 | D6 | 3 | Okänd 2 | U2 | 4 | 1,00 × 10-6 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-7

P1 | E4 | 1 | Okänd 2 | U2 | 5 | 1,00 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-6

P1 | E5 | 2 | Okänd 2 | U2 | 5 | 1,00 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-6

P1 | E6 | 3 | Okänd 2 | U2 | 5 | 1,00 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-6

P1 | F4 | 1 | Okänd 2 | U2 | 6 | 1,00 × 10-4 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-5

P1 | F5 | 2 | Okänd 2 | U2 | 6 | 1,00 × 10-4 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-5

P1 | F6 | 3 | Okänd 2 | U2 | 6 | 1,00 × 10-4 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-5

P1 | G4 | 1 | Okänd 2 | U2 | 7 | 1,00 × 10-3 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-4

P1 | G5 | 2 | Okänd 2 | U2 | 7 | 1,00 × 10-3 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-4

P1 | G6 | 3 | Okänd 2 | U2 | 7 | 1,00 × 10-3 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-4

P1 | H4 | 1 | Okänd 2 | U2 | 8 | 1,00 × 10-2 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-3

P1 | H5 | 2 | Okänd 2 | U2 | 8 | 1,00 × 10-2 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-3

P1 | H6 | 3 | Okänd 2 | U2 | 8 | 1,00 × 10-2 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-3

P1 | A7 | 1 | Okänd 3 | U3 | 1 | 1,00 × 10-9 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-10

P1 | A8 | 2 | Okänd 3 | U3 | 1 | 1,00 × 10-9 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-10

P1 | A9 | 3 | Okänd 3 | U3 | 1 | 1,00 × 10-9 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-10

P1 | B7 | 1 | Okänd 3 | U3 | 2 | 1,00 × 10-8 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-9

P1 | B8 | 2 | Okänd 3 | U3 | 2 | 1,00 × 10-8 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-9

P1 | B9 | 3 | Okänd 3 | U3 | 2 | 1,00 × 10-8 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-9

P1 | C7 | 1 | Okänd 3 | U3 | 3 | 1,00 × 10-7 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-8

P1 | C8 | 2 | Okänd 3 | U3 | 3 | 1,00 × 10-7 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-8

P1 | C9 | 3 | Okänd 3 | U3 | 3 | 1,00 × 10-7 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-8

P1 | D7 | 1 | Okänd 3 | U3 | 4 | 1,00 × 10-6 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-7

P1 | D8 | 2 | Okänd 3 | U3 | 4 | 1,00 × 10-6 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-7

P1 | D9 | 3 | Okänd 3 | U3 | 4 | 1,00 × 10-6 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-7

P1 | E7 | 1 | Okänd 3 | U3 | 5 | 1,00 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-6

P1 | E8 | 2 | Okänd 3 | U3 | 5 | 1,00 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-6

P1 | E9 | 3 | Okänd 3 | U3 | 5 | 1,00 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-6

P1 | F7 | 1 | Okänd 3 | U3 | 6 | 1,00 × 10-4 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-5

P1 | F8 | 2 | Okänd 3 | U3 | 6 | 1,00 × 10-4 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-5

P1 | F9 | 3 | Okänd 3 | U3 | 6 | 1,00 × 10-4 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-5

P1 | G7 | 1 | Okänd 3 | U3 | 7 | 1,00 × 10-3 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-4

P1 | G8 | 2 | Okänd 3 | U3 | 7 | 1,00 × 10-3 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-4

P1 | G9 | 3 | Okänd 3 | U3 | 7 | 1,00 × 10-3 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-4

P1 | H7 | 1 | Okänd 3 | U3 | 8 | 1,00 × 10-2 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-3

P1 | H8 | 2 | Okänd 3 | U3 | 8 | 1,00 × 10-2 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-3

P1 | H9 | 3 | Okänd 3 | U3 | 8 | 1,00 × 10-2 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-3

P1 | A10 | 1 | Kontroll E2 (max) | Fast | E2max1 | 1,00 × 10-6 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,00 × 10-7

P1 | A11 | 2 | Kontroll E2 (max) | Fast | E2max2 | 1,00 × 10-6 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,00 × 10-7

P1 | A12 | 3 | Kontroll E2 (max) | Fast | E2max3 | 1,00 × 10-6 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,00 × 10-7

P1 | B10 | 1 | Kontroll E2 (IC50) | Fast | E2IC501 | E2IC50 × 10 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | E2IC50

P1 | B11 | 2 | Kontroll E2 (IC50) | Fast | E2IC502 | E2IC50 × 10 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | E2IC50

P1 | B12 | 3 | Kontroll E2 (IC50) | Fast | E2IC503 | E2IC50 × 10 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | E2IC50

P1 | C10 | 1 | Kontroll NE (max) | Fast | Nemax1 | 1,00 × 10-3,5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,00 × 10-4,5

P1 | C11 | 2 | Kontroll NE (max) | Fast | Nemax2 | 1,00 × 10-3,5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,00 × 10-4,5

P1 | C12 | 3 | Kontroll NE (max) | Fast | Nemax3 | 1,00 × 10-3,5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,00 × 10-4,5

P1 | D10 | 1 | Kontroll NE (IC50) | Fast | NEIC501 | NEIC50 × 10 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | NEIC50

P1 | D11 | 2 | Kontroll NE (IC50) | Fast | NEIC502 | NEIC50 × 10 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | NEIC50

P1 | D12 | 3 | Kontroll NE (IC50) | Fast | NEIC503 | NEIC50 × 10 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | NEIC50

P1 | E10 | 1 | Icke-radioaktiv E2 (hög) | NSB | S1 | 1,00 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-6

P1 | E11 | 2 | Icke-radioaktiv E2 (hög) | NSB | S2 | 1,00 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-6

P1 | E12 | 3 | Icke-radioaktiv E2 (hög) | NSB | S3 | 1,00 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-6

P1 | F10 | 4 | Icke-radioaktiv E2 (hög) | NSB | S4 | 1,00 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-6

P1 | F11 | 5 | Icke-radioaktiv E2 (hög) | NSB | S5 | 1,00 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-6

P1 | F12 | 6 | Icke-radioaktiv E2 (hög) | NSB | S6 | 1,00 × 10-5 | 30 | 50 | 10 | 10 | 100 | 1,0 × 10-6

P1 | G10 | 1 | Total bindning | TB | TB1 | — | 30 | 60 | 10 | — | 100 | —

P1 | G11 | 2 | Total bindning | TB | TB2 | — | 30 | 60 | 10 | — | 100 | —

P1 | G12 | 3 | Total bindning | TB | TB3 | — | 30 | 60 | 10 | — | 100 | —

P1 | H10 | 4 | Total bindning | TB | TB4 | — | 30 | 60 | 10 | — | 100 | —

P1 | H11 | 5 | Total bindning | TB | TB5 | — | 30 | 60 | 10 | — | 100 | —

P1 | H12 | 6 | Total bindning | TB | TB6 | — | 30 | 60 | 10 | — | 100 | —

1 Obs: brunnarna som märkts med radioaktiv är tomma under inkubationen. Dessa 10 μl tillsätts endast i scintillationsräkningssyfte.

Tillägg 4

ÖVERVÄGANDEN INFÖR ANALYS AV DATA FRÅN KOMPETITIVT BINDNINGSTEST FÖR HRER

1. Det kompetitiva bindningstestet för hrERα mäter bindningen av [3H]-17β-östradiol vid en viss koncentration i närvaro av ökande koncentrationer av en testkemikalie. Kurvan över kompetitiv bindning ritas som specifik [3H]-17β-östradiol-bindning mot koncentrationen av konkurrerande ligand (log10-enheter). Den koncentration av testkemikalie som hämmar 50 % av den maximala specifika [3H]-17β-östradiol-bindningen är IC50.

Analys av data för referensöstrogen och svag bindare (1)

2. Data från kontrollomgångarna omvandlas (dvs. procentuell, specifik [3H]-17β-östradiol-bindning och log-koncentrationen av kontrollkemikalien) för vidare analys. Uppskattningar av log(IC50)-värden för de positiva kontrollerna (t.ex. referensöstrogen och svag bindare) ska fastställas med hjälp av lämplig programvara för icke-linjär kurvanpassning så att de passar en fyraparameters Hill-ekvation (t.ex. BioSoft, GraphPad Prism) (2). Kurvans topp, botten, lutning och log(IC50)-värde kan i allmänhet lämnas utan restriktion (unconstrained) vid anpassning av dessa kurvor. Robust regression ska användas i fastställande av bästa anpassning, om inte annat val motiveras. Val av robust regressionsmetod ska anges. Korrigering av liganduttömning behövdes inte för FW- eller CERI-hrER-tester, men kan vid behov övervägas. Efter inledande analys ska varje bindningskurva granskas för att säkerställa korrekt anpassning till modellen. Den svaga bindarens relativa bindningsaffinitet (RBA) kan beräknas procentuellt som dess log(IC50)-värde i förhållande till log(IC50)-värdet för 17β-östradiol. Resultat för de positiva kontrollerna och den icke-bindande kontrollen bör utvärderas med mått på testprestanda och acceptanskriterier som beskrivits i denna testmetod (punkt 20), tillägg 2 (FW-test, punkterna 41–51) och tillägg 3 (CERI-test, punkterna 41–51). Exempel på 3 testomgångar för referensöstrogen och svag bindare visas i figur 1.

Figur 1 Exempel på kurvor över kompetitiv bindning för referensöstrogen och kontrollen med svag bindare

Dataanalys för testkemikalier

3. Data för alla testkemikalier ska analyseras med en stegvis strategi för att säkerställa att data analyseras korrekt och att varje kurva för kompetitiv bindning klassificeras korrekt. Det är lämpligt att en testkemikalies alla testomgångar initialt underkastas en standardiserad dataanalys som är identisk med den som använts för referensöstrogen och kontroller med svaga bindare. När den är klar bör en teknisk granskning av kurvanpassningsparametrarna göras, liksom en visuell granskning av hur väl data stämmer med den genererade kurvan över kompetitiv bindning, för varje testomgång. Under denna tekniska granskning är följande iakttagelser goda indikationer på att testet och dataanalyserna har genomförts korrekt: en koncentrationsberoende minskning i procentuell, specifikt bunden [3H]-17β-östradiol, låg variation mellan de tekniska replikaten för varje kemisk koncentration och överensstämmelse mellan anpassningsparametrarna från de tre testomgångarna. Yrkesmässigt omdöme ska tillämpas vid granskning av resultaten från en testkemikalies alla testomgångar och de data som används för att klassificera respektive testkemikalie som bindare eller icke-bindare ska vara vetenskapligt försvarbara.

4. Emellanåt kan det finnas data som kräver ytterligare beaktande för att man ska kunna analysera och tolka hrER-bindningsdata korrekt. Olika studier har uppvisat fall där analys och tolkning av kompetitiva receptorbindningsdata kan kompliceras av en uppgång i procentuell specifik bindning när kemikalier testas vid sina högsta koncentrationer (figur 2). Detta är ett välkänt fenomen som har påträffats vid användning av protokoll för ett antal olika kompetitiva receptorbindningstester (3). I dessa fall observeras en koncentrationsberoende respons vid lägre koncentrationer, men när testkemikaliens koncentration närmar sig löslighetsgränsen minskar inte längre bortträngningen av [3H]-17β-östradiol. I dessa fall indikerar data för de högre koncentrationerna att man har nått testets biologiska gräns. Till exempel är detta fenomen många gånger förknippat med kemisk olöslighet och utfällning vid höga koncentrationer, alternativ återspeglar det att man har överskridit det dextran-täckta träkolets förmåga att binda den icke-bundna, radioaktivt inmärkta liganden under separationssteget, vid den högsta kemiska koncentrationen. Att lämna kvar sådana datapunkter vid anpassning av kompetitiva bindningsdata till en sigmoidal kurva kan ibland leda till en felklassificering av testkemikaliens ER-bindningspotential (figur 2). För att undvika detta ingår det i FW- och CERI-hrER-bindningstesterna en möjlighet att från analyserna utesluta datapunkter där medelvärdet för replikaten när det gäller andelen specifikt bunden [3H]-17β-östradiol är 10 % eller mer över det observerade medelvärdet vid en lägre koncentration (detta betecknas ofta som 10-procentsregeln). Denna regel kan endast användas en gång för varje enskild kurva, och det måste finnas kvar data från minst sex koncentrationer för att kurvan ska kunna klassificeras korrekt.

Figur 2 Exempel på kompetitiva bindningskurvor med och utan användning av 10-procentsregeln

5. Lämplig användning av 10-procentsregeln för att korrigera dessa kurvor ska övervägas noga och förbehållas de fall där det finns starka indikationer på att ämnet är en hrER-bindare. I samband med utförande av experimenten för valideringsstudien av FW-hrER-bindningstestet noterade att 10-procentsregeln ibland ledde till en oavsiktlig och oförutsedd konsekvens. Kemikalier som inte interagerade med receptorn (dvs. faktiska icke-bindare) visade ofta en variation runt 100 % bunden radioaktivt märkt ligand som var större än 10 % över det testade koncentrationsintervallet. Om det lägsta värdet råkade vara vid en låg koncentration riskerade data från alla högre koncentrationer att uteslutas från analysen genom användning av 10-procentsregeln, även om dessa koncentrationer kunde vara användbara för att fastställa att kemikalien är en icke-bindare. Figur 3 visar exempel där det är olämpligt att använda 10-procentsregeln.

Figur 3 Exempel, kompetitiva bindningsdata där det är olämpligt att använda 10-procentsregeln

Litteratur

(1) OECD (2015). Integrated Summary Report: Validation of Two Binding Assays Using Human Recombinant Estrogen Receptor Alpha (hrERα), Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 226), Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD), Paris.

(2) Motulsky H. och Christopoulos A. (2003). The law of mass action, I: Fitting Models to Biological Data Using Linear and Non-linear Regression. GraphPad Software Inc., San Diego, CA, s. 187-191. Www.graphpad.com/manuals/Prism4/RegressionBook.pdf

(3) Laws SC, Yavanhxay S, Cooper RL, Eldridge JC. (2006). Nature of the Binding Interaction for 50 Structurally Diverse Chemicals with Rat Estrogen Receptors. Toxicological Sci. 94(1):46-56.

Tillägg 1

IN VITRO-TEST AVSEENDE HUDSENSIBILISERING: H-CLAT (HUMAN CELL LINE ACTIVATION TEST)

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR

1. h-CLAT-testet kvantifierar förändringar i uttrycket av cellytemarkörer som är kopplade till aktiveringsprocessen för monocyter och dendritiska celler (det vill säga CD86 och CD54) i den humana cellinjen THP-1 (med ursprung i monocytisk leukemi) efter exponering för sensibiliserande ämnen (1) (2). De uppmätta uttrycksnivåerna för cellytemarkörerna CD86 och CD54 används sedan för att understödja uppdelningen mellan hudsensibiliserande ämnen och icke-hudsensibiliserande ämnen.

2. h-CLAT-testet har utvärderats i en valideringsstudie samordnad av Europeiska unionens referenslaboratorium för alternativ till djurförsök (EURL ECVAM) med efterföljande oberoende kollegial granskning av EURL ECVAM:s rådgivande vetenskapliga kommitté (ESAC, EURL ECVAM Scientific Advisory Committee). Med beaktande av alla tillgängliga bevis och inkomna åsikter från tillsynsmyndigheter och intressenter, rekommenderades h-CLAT-testet av EURL ECVAM (3) att användas som en del av en IATA för att understödja uppdelningen mellan hudsensibiliserande ämnen och icke-hudsensibiliserande ämnen för faroklassificering och -märkning. Exempel på användning av data från h-CLAT-test i kombination med annan information finns redovisade i litteraturen (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11).

3. h-CLAT-testet har visat sig vara överförbart till laboratorier som har erfarenhet av cellodlingstekniker och flödescytometrisk analys. Testets förväntade reproducerbarhet i fråga om prediktioner är i storleksordningen 80 % inom och mellan laboratorier (3) (12). De erhållna resultaten i valideringsstudien (13) och andra publicerade studier (14) visar sammantaget att jämfört med LLNA-resultat är noggrannheten när det gäller att skilja mellan hudsensibiliserande ämnen (det vill säga kategori 1 enligt GHS/CLP-förordningen) och icke-hudsensibiliserande ämnen 85 % (N = 142), med en sensitivitet på 93 % (94/101) och en specificitet på 66 % (27/41) (baserat på en ny analys av EURL ECVAM [12] med beaktande av alla befintliga data och utan hänsyn tagen till negativa resultat för kemikalier med ett log Kow-värde över 3,5, enligt beskrivningen i punkt 4). Det är mer sannolikt att falska negativa prediktioner med h-CLAT-testet gäller kemikalier som uppvisar en låg till måttlig hudsensibiliserande styrka (det vill säga underkategori 1B enligt GHS/CLP-förordningen) än kemikalier som uppvisar en hög hudsensibiliserande styrka (det vill säga underkategori 1A enligt GHS/CLP-förordningen) (4) (13) (15). Sammantaget visar informationen att h-CLAT-testet på ett användbart sätt bidrar till identifieringen av risker för hudsensibilisering. De noggrannhetsvärden som anges här för h-CLAT-testet som ett fristående test är dock endast vägledande, eftersom testet bör beaktas i kombination med andra informationskällor inom ramen för en IATA och i enlighet med bestämmelserna i punkterna 7 och 8 i Allmän inledning. Vid utvärdering av tester utan djurförsök gällande hudsensibilisering bör man dessutom tänka på att såväl LLNA-testet som andra djurförsök eventuellt inte avspeglar situationen för människor fullt ut.

4. h-CLAT-testet har, baserat på de uppgifter som finns tillgängliga för närvarande, visat sig vara tillämpligt för testkemikalier som omfattar en rad olika organiska funktionella grupper, reaktionsmekanismer, hudsensibiliseringsstyrkor (vilket har fastställts i in vivo-undersökningar) och fysikalisk-kemiska egenskaper (3) (14) (15). h-CLAT-testet är tillämpligt för testkemikalier som är lösliga eller som bildar en stabil dispersion (det vill säga en kolloid eller en suspension i vilken testkemikalien inte sjunker till botten eller separeras från lösningsmedlet/vehikeln till olika faser) i ett lämpligt lösningsmedel/en lämplig vehikel (se punkt 14). Testkemikalier som har ett log Kow-värde över 3,5 tenderar att ge falska negativa resultat (14). Negativa resultat som erhålls med testkemikalier med ett log Kow-värde över 3,5 ska därför inte tas i beaktande. Positiva resultat som erhålls med testkemikalier med ett log Kow-värde över 3,5 kan dock fortfarande användas som stöd för att identifiera testkemikalien som ett hudsensibiliserande ämne. På grund av den begränsade metaboliska kapaciteten hos den använda cellinjen (16) och testbetingelserna kan dessutom prohaptener (det vill säga ämnen som kräver enzymatisk aktivering, till exempel via P450-enzymer) och prehaptener (det vill säga ämnen som aktiveras av oxidation), i synnerhet om de har en långsam oxidationshastighet, också ge negativa resultat i h-CLAT-testet (15). Fluorescerande testkemikalier kan bedömas med h-CLAT-testet (17), men det bör noteras att kraftigt fluorescerande testkemikalier som sänder ut ljus med samma våglängd som fluoresceinisotiocyanat (FITC) eller propidiumjodid (PI) kommer att störa den flödescytometriska detekteringen och därför inte kan bedömas korrekt med användning av FITC-konjugerade antikroppar eller PI. I sådana fall kan andra fluorokrommärkta antikroppar respektive andra markörer för cytotoxicitet användas, så länge det kan visas att de ger liknande resultat som FITC-märkta antikroppar (se punkt 24) eller PI (se punkt 18), till exempel genom test av kvalifikationsämnena i tillägg 1.2. Mot bakgrund av det ovanstående bör negativa resultat tolkas utifrån de fastställda begränsningarna och tillsammans med andra informationskällor, inom ramen för en IATA. Om det finns bevis för att h-CLAT-testet inte är tillämpligt för andra specifika kategorier av testkemikalier, bör det inte användas för dessa specifika kategorier.

5. Som beskrivs ovan kan h-CLAT-testet användas för att understödja uppdelningen mellan hudsensibiliserande ämnen och icke-hudsensibiliserande ämnen. Eventuellt kan testet även bidra till bedömningen av sensibiliseringens styrka (4) (5) (9) när det används i integrerade arbetssätt, exempelvis en IATA. Det krävs dock ytterligare arbete, företrädesvis baserat på data gällande människor, för att avgöra hur h-CLAT-resultat skulle kunna ligga till grund för en bedömning av sensibiliseringens styrka.

6. Definitioner av begrepp finns i tillägg 1.1.

TESTETS PRINCIP

7. h-CLAT-testet är ett in vitro-test som kvantifierar förändringar i uttrycket av cellytemarkörer (det vill säga CD86 och CD54) hos celler från den humana cellinjen THP-1 (med ursprung i monocytisk leukemi), efter 24 timmars exponering för testkemikalien. Dessa ytmolekyler är typiska markörer för monocytisk THP-1-aktivering och kan efterlikna aktiveringen av dendritiska celler, som spelar en avgörande roll vid priming av T-celler. Förändringarna i uttrycket av cellytemarkörer mäts genom flödescytometri efter infärgning av cellerna med fluorokrommärkta antikroppar. Mätningar av cytotoxiciteten utförs också parallellt för att bedöma huruvida uppregleringar av uttrycket av cellytemarkörer förekommer vid subcytotoxiska koncentrationer. Den relativa fluorescensintensiteten hos ytmarkörerna jämfört med lösningsmedels-/vehikelkontrollen beräknas och används i prediktionsmodellen (se punkt 26) för att understödja uppdelningen mellan hudsensibiliserande ämnen och icke-hudsensibiliserande ämnen.

DEMONSTRATION AV KOMPETENS

8. Innan testet som beskrivs i detta tillägg till testmetod B.71 används rutinmässigt, bör laboratoriet visa sin tekniska kompetens med användning av de tio kvalifikationsämnen som anges i tillägg 1.2. Dessutom bör användare av testet föra en historisk databas över data som erhålls genom reaktivitetskontrollerna (se punkt 11) och genom de positiva kontrollerna och lösningsmedels-/vehikelkontrollerna (se punkterna 20–22) och använda dessa data för att styrka att testets reproducerbarhet bibehålls i laboratoriet över tid.

FÖRFARANDE

9. Det här testet är baserat på h-CLAT DB-ALM-protokoll (DataBase service on ALternative Methods to animal experimentation) nr 158 (18), som är det protokoll som användes för den EURL ECVAM-samordnade valideringsstudien. Det rekommenderas att detta protokoll tillämpas när h-CLAT-testet införs och används i laboratoriet. Nedan följer en beskrivning av de viktigaste delarna i och förfarandena för h-CLAT-testet, som utgörs av två steg: ett dosfinnande test och en mätning av CD86/CD54-uttryck.

Förberedelse av celler

10. Den humana cellinjen THP-1 (med ursprung i monocytisk leukemi) ska användas vid utförandet av h-CLAT-testet. Det rekommenderas att celler (TIB-202™) erhålls från en välmeriterad cellbank, exempelvis American Type Culture Collection.

11. THP-1-celler odlas, vid 37°C i en fuktad atmosfär med 5 % CO2, i RPMI-1640-medium som har kompletterats med 10 % fetalt bovint serum (FBS), 0,05 mM 2-merkaptoetanol, 100 enheter/ml penicillin och 100 μg/ml streptomycin. Om så önskas går det att utelämna användningen av penicillin och streptomycin i odlingsmediet. I sådana fall ska dock användarna verifiera att frånvaron av antibiotika i odlingsmediet inte har någon inverkan på resultaten, till exempel genom att testa de kvalifikationsämnen som anges i tillägg 1.2. För att minimera risken för föroreningar ska, under alla omständigheter, goda rutiner för cellodling följas, oberoende av om antibiotika ingår i cellodlingsmediet eller inte. THP-1-celler sås regelbundet ut, varannan till var tredje dag, med en densitet på 0,1 till 0,2 × 106 celler/ml. Cellernas densitet bör hållas mellan 0,1 och 1,0 × 106 celler/ml. Innan de används för testning bör cellerna genomgå en kvalificering i form av en reaktivitetskontroll. Reaktivitetskontrollen av cellerna bör utföras med användning av de positiva kontrollerna 2,4-dinitroklorbensen (DNCB) (CAS-nr 97-00-7, ≥ 99 % renhet) och nickelsulfat (NiSO4) (CAS-nr 10101-97-0, ≥ 99 % renhet) och den negativa kontrollen mjölksyra (LA) (CAS-nr 50-21-5, ≥ 85 % renhet), vilket ska ske två veckor efter upptining. Såväl DNCB som NiSO4 ska ge positiv respons för både cellytemarkören CD86 och cellytemarkören CD54, och LA ska ge negativ respons för både cellytemarkören CD86 och cellytemarkören CD54. Endast celler som har klarat reaktivitetskontrollen ska användas för testet. Celler kan förökas upp till två månader efter upptining. Antalet passager bör inte överstiga 30. Reaktivitetskontrollen bör utföras i enlighet med de förfaranden som beskrivs i punkterna 20–24.

12. För testet sås THP-1-celler ut med en densitet på antingen 0,1 × 106 celler/ml eller 0,2 × 106 celler/ml, varefter de förodlas i odlingsflaskor under 72 timmar respektive 48 timmar. Det är viktigt att celldensiteten i odlingsflaskan direkt efter förodlingsperioden är så likartad som möjligt för varje experiment (genom användning av en av de båda förodlingsbetingelser som beskrivs ovan), eftersom celldensiteten i odlingsflaskan direkt efter förodlingen kan påverka det allergeninducerade uttrycket av CD86/CD54 (19). På testdagen resuspenderas de skördade cellerna från odlingsflaskorna med nytt odlingsmedium, så att en koncentration på 2 × 106 celler/ml erhålls. Därefter fördelas cellerna i en flatbottnad 24-hålsplatta (500 μl per brunn, 1 × 106 celler/brunn) eller en flatbottnad 96-hålsplatta (80 μl per brunn, 1,6 × 105 celler/brunn).

Dosfinnande test

13. Ett dosfinnande test utförs för att fastställa CV75-värdet, som är den koncentration av testkemikalien som resulterar i 75 % cellviabilitet (CV) jämfört med lösningsmedels-/vehikelkontrollen. CV75-värdet används för att fastställa testkemikaliekoncentrationen för mätningen av CD86/CD54-uttrycket (se punkterna 20–24).

Beredning av testkemikalier och kontrollämnen

14. Testkemikalierna och kontrollämnena bereds på testdagen. För h-CLAT-testet löses testkemikalierna upp eller dispergeras i en stabil dispersion (se även punkt 4) i saltlösning eller medium som primärt lösningsmedels-/vehikelalternativ eller dimetylsulfoxid (DMSO, ≥ 99 % renhet) som sekundärt lösningsmedels-/vehikelalternativ om testkemikalien inte är löslig eller inte bildar en stabil dispersion i de tidigare båda lösningsmedlen/vehiklarna, till en slutlig koncentration på 100 mg/ml (i saltlösning eller medium) eller 500 mg/ml (i DMSO). Andra lösningsmedel/vehiklar än de som beskrivs ovan kan användas om en tillfredsställande vetenskaplig motivering tillhandahålls. Testkemikaliens stabilitet i det slutliga lösningsmedlet/den slutliga vehikeln ska tas i beaktande.

15. Med utgångspunkt i testkemikaliernas stamlösningar på 100 mg/ml (i saltlösning eller medium) eller 500 mg/ml (i DMSO) ska följande utspädningssteg utföras: För saltlösning eller medium som lösningsmedel/vehikel: Åtta stamlösningar (åtta koncentrationer) bereds, genom tvåfaldiga serieutspädningar med användning av motsvarande lösningsmedel/vehikel. Dessa stamlösningar späds sedan vidare 50-faldigt i odlingsmedium (arbetslösningar). Om den högsta slutliga koncentrationen i plattan på 1000 μg/ml är icke-toxisk, ska den maximala koncentrationen fastställas på nytt genom att ett nytt cytotoxicitetstest utförs. Den slutliga koncentrationen i plattan bör inte överstiga 5000 μg/ml för testkemikalier som är upplösta eller dispergerade i en stabil dispersion i saltlösning eller medium. För DMSO som lösningsmedel/vehikel: Åtta stamlösningar (åtta koncentrationer) bereds, genom tvåfaldiga serieutspädningar med användning av motsvarande lösningsmedel/vehikel. Dessa stamlösningar späds sedan vidare 250-faldigt i odlingsmedium (arbetslösningar). Den slutliga koncentrationen i plattan bör inte överstiga 1000 μg/ml, inte ens om denna koncentration är icke-toxisk. Arbetslösningarna används slutligen för exponeringen genom att en lika stor volym arbetslösning som volymen THP-1-cellsuspension tillsätts till plattan (se även punkt 17), vilket ger en ytterligare tvåfaldig spädning (normalt är det slutliga intervallet av koncentrationer i plattan 7,81–1000 μg/ml).

16. Lösningsmedels-/vehikelkontrollen som används i h-CLAT-testet utgörs av odlingsmedium (för testkemikalier som är upplösta eller dispergerade i en stabil dispersion [se punkt 4] i antingen medium eller saltlösning) eller DMSO (för testkemikalier som är upplösta eller dispergerade i en stabil dispersion i DMSO) som testas vid en enda slutlig koncentration i plattan på 0,2 %. Kontrollen genomgår samma utspädning som beskrivs för arbetslösningarna i punkt 15.

Applicering av testkemikalier och kontrollämnen

17. Odlingsmediet eller arbetslösningarna som beskrivs i punkterna 15 och 16 blandas 1:1 (volymförhållande) med de cellsuspensioner som beretts i den flatbottnade 24- eller 96-hålsplattan (se punkt 12). De behandlade plattorna inkuberas därefter i 24 ± 0,5 timmar vid 37°C i en atmosfär med 5 % CO2. Se till att flyktiga testkemikalier inte avdunstar och att det inte sker någon korskontaminering mellan testkemikalier i olika brunnar, till exempel genom att plattan förseglas innan testkemikalierna inkuberas (20).

Infärgning med propidiumjodid (PI)

18. Efter 24 ± 0,5 timmars exponering överförs cellerna till provrör och samlas upp genom centrifugering. Supernatanterna kasseras och de kvarvarande cellerna resuspenderas med 200 μl (vid användning av en 96-hålsplatta) eller 600 μl (vid användning av en 24-hålsplatta) av en fosfatbuffrad saltlösning som innehåller 0,1 % bovint serumalbumin (infärgningsbuffert). 200 μl cellsuspension överförs till en rundbottnad 96-hålsplatta (vid användning av en 96-hålsplatta) eller mikrorör (vid användning av en 24-hålsplatta) och tvättas två gånger med 200 μl (vid användning av en 96-hålsplatta) eller 600 μl (vid användning av en 24-hålsplatta) infärgningsbuffert. Slutligen resuspenderas cellerna i infärgningsbuffert (till exempel 400 μl) varpå PI-lösning (till exempel 20 μl) tillsätts (den slutliga koncentrationen PI kan till exempel vara 0,625 μg/ml). Andra cytotoxicitetsmarkörer, som 7-aminoaktinomycin D (7-AAD), trypanblått eller annan markör, kan användas om det kan visas att den alternativa infärgningen ger liknande resultat som PI, till exempel genom test av kvalifikationsämnena i tillägg 1.2.

Cytotoxicitetsmätning genom flödescytometri och uppskattning av CV75-värdet

19. Upptaget av PI analyseras med hjälp av flödescytometri, med användning av fluorescenskanalen FL-3. Totalt 10000 levande celler (PI-negativa) mäts. Cellviabiliteten kan beräknas av cytometriundersökningens analysprogram med användning av nedanstående formel. Om cellviabiliteten är låg bör upp till 30000 celler, inklusive döda celler, mätas. Alternativt kan data samlas in under en minut från det att analysen påbörjas. Cellviabilitet Antal levande celler Totalt antal registrerade celler 100 CV75-värdet (se punkt 13), det vill säga en koncentration som uppvisar 75 % överlevnad hos THP-1-cellerna (25 % cytotoxicitet), beräknas genom log-linjär interpolering med användning av följande formel: Log CV75 75 c Log b 75 a Log d a c där a är minimivärdet för en cellviabilitet över 75 %, c är maximivärdet för en cellviabilitet under 75 %, b och d är koncentrationerna som ger upphov till cellviabilitetsvärdena a respektive c. Andra metoder för att få fram CV75-värdet kan användas så länge det kan visas att detta inte har någon inverkan på resultaten (till exempel genom test av kvalifikationsämnena).

Mätning av CD86/CD54-uttryck

Beredning av testkemikalier och kontrollämnen

20. Lämpligt lösningsmedel/lämplig vehikel (saltlösning, medium eller DMSO, se punkt 14) används för att lösa upp testkemikalierna eller dispergera dem i en stabil dispersion. Testkemikalierna späds först till den koncentration som motsvarar 100-faldig (för saltlösning eller medium) eller 500-faldig (för DMSO) koncentration i förhållande till 1,2 × CV75-värdet som fastställdes i det dosfinnande testet (se punkt 19). Om CV75-värdet inte kan fastställas (det vill säga om tillräcklig cytotoxicitet inte kan observeras i det dosfinnande testet), ska den högsta lösliga eller stabilt dispergerade koncentrationen av testkemikalien som beretts med varje lösningsmedel/vehikel användas som startkoncentration. Observera att den slutliga koncentrationen i plattan inte bör överstiga 5000 μg/ml (för saltlösning eller medium) eller 1000 μg/ml (för DMSO). Därefter görs 1,2-faldiga serieutspädningar med användning av motsvarande lösningsmedel/vehikel för att erhålla de stamlösningar (åtta koncentrationer som sträcker sig från 100 × 1,2 × CV75 till 100 × 0,335 × CV75 [för saltlösning eller medium] eller från 500 × 1,2 × CV75 till 500 × 0,335 × CV75 [för DMSO]) som ska testas med h-CLAT-testet (se DB ALM-protokoll nr 158 för ett exempel på doseringsprocedur). Stamlösningarna späds sedan vidare 50-faldigt (för saltlösning eller medium) eller 250-faldigt (för DMSO) i odlingsmediet (arbetslösningar). Dessa arbetslösningar används slutligen för exponeringen med en ytterligare avslutande tvåfaldig utspädningsfaktor i plattan. Om resultaten inte uppfyller acceptanskriterierna som beskrivs i punkterna 29 och 30 i fråga om cellviabilitet, kan det dosfinnande testet upprepas för att fastställa ett mer exakt CV75-värde. Observera att endast 24-hålsplattor kan användas för mätningen av CD86/CD54-uttryck.

21. Lösningsmedels-/vehikelkontrollen bereds enligt beskrivningen i punkt 16. Den positiva kontroll som används i h-CLAT-testet utgörs av DNCB (se punkt 11), för vilken stamlösningar bereds i DMSO och späds enligt beskrivningen för stamlösningar i punkt 20. DNCB bör användas som positiv kontroll för mätning av CD86/CD54-uttryck i en enda slutlig koncentration i plattan (normalt 4,0 μg/ml). För att uppnå en koncentration på 4,0 μg/ml DNCB i plattan bereds en stamlösning med 2 mg/ml DNCB i DMSO, som sedan späds vidare 250-faldigt med odlingsmedium till en arbetslösning på 8 μg/ml. Alternativt kan även CV75-värdet för DNCB, som fastställs inom varje testanläggning, användas som koncentration för positiv kontroll. Andra lämpliga positiva kontroller kan användas om historiska data finns att tillgå för att härleda jämförbara acceptanskriterier. För positiva kontroller bör den slutliga och enda koncentrationen i plattan inte överstiga 5000 μg/ml (för saltlösning eller medium) eller 1000 μg/ml (för DMSO). Acceptanskriterierna är desamma som de som beskrivs för testkemikalien (se punkt 29), förutom vad gäller det sista acceptanskriteriet eftersom den positiva kontrollen testas vid endast en koncentration.

Applicering av testkemikalier och kontrollämnen

22. För varje testkemikalie och kontrollämne krävs ett experiment för att erhålla en prediktion. Varje experiment består av åtminstone två oberoende testomgångar för mätning av CD86/CD54-uttryck (se punkterna 26–28). De oberoende testomgångarna ska utföras på olika dagar, alternativt på samma dag under förutsättning att följande gäller för varje testomgång: a) oberoende färska stamlösningar och arbetslösningar av testkemikalien och antikroppslösningar bereds och b) oavhängigt skördade celler används (det vill säga celler hämtas från olika odlingsflaskor); cellerna får dock komma från samma passage. Testkemikalier och kontrollämnen som beretts som arbetslösningar (500 μl) blandas med 500 μl suspenderade celler (1 × 106 celler) i förhållandet 1:1, varpå cellerna inkuberas i 24 ± 0,5 timmar enligt beskrivningen i punkterna 20 och 21. För varje testomgång räcker det med ett enda replikat för varje koncentration av testkemikalien och kontrollämnet, eftersom en prediktion erhålls från åtminstone två oberoende testomgångar.

Cellinfärgning och analys

23. Efter 24 ± 0,5 timmars exponering överförs cellerna från 24-hålsplattan till provrör, samlas upp genom centrifugering och tvättas sedan två gånger med 1 ml infärgningsbuffert (vid behov kan ytterligare tvättsteg genomföras). Efter tvättningen blockeras cellerna med 600 μl blockeringslösning (infärgningsbuffert innehållande 0,01 % [vikt/volym] globulin [Cohn-fraktion II, III från människa; SIGMA, nr G2388-10G eller motsvarande]) och inkuberas vid 4°C i 15 minuter. Efter blockeringen delas cellerna upp i tre alikvoter om 180 μl i en rundbottnad 96-hålsplatta eller mikrorör.

24. Efter centrifugering färgas cellerna med 50 μl FITC-märkta antikroppar av typ anti-CD86, anti-CD54 eller IgG1 från mus (isotyp) vid 4°C under 30 minuter. Antikropparna som beskrivs i h-CLAT DB-ALM-protokoll nr 158 (18) bör användas genom utspädning 3:25 (volymförhållande) (för CD86 [BD-PharMingen, nr 555657; klon: Fun-1]) eller 3:50 (volymförhållande) (för CD54 [DAKO, nr F7143; klon: 6.5B5] och IgG1 [DAKO, nr X0927]) med infärgningsbuffert. Dessa utspädningsfaktorer för antikropparna har definierats av testutvecklarna som de som ger det bästa signal-brusförhållandet. Enligt testutvecklarnas erfarenhet är fluorescensintensiteten hos antikropparna vanligtvis likartad mellan olika satser. Användarna kan dock överväga att titrera antikropparna under de egna laboratorieförhållandena för att få fram de bästa användningskoncentrationerna. Andra fluorokrommärkta antikroppar av typ anti-CD86 och/eller anti-CD54 kan användas om det kan visas att de ger liknande resultat som FITC-konjugerade antikroppar, till exempel genom test av kvalifikationsämnena i tillägg 1.2. Det bör noteras att byte av klon eller leverantör av antikropparna, enligt beskrivningen i h-CLAT DB-ALM-protokoll nr 158 (18), kan påverka resultaten. Efter två eller flera tvättar med 150 μl infärgningsbuffert resuspenderas cellerna i infärgningsbuffert (till exempel 400 μl) och PI-lösningen (till exempel 20 μl för att erhålla en slutlig koncentration på 0,625 μg/ml) eller en annan lösning med en cytotoxicitetsmarkör (se punkt 18) tillsätts. Uttrycksnivåerna för CD86 och CD54 och cellviabiliteten analyseras med hjälp av flödescytometri.

DATA OCH RAPPORTERING

Utvärdering av data

25. Uttrycket av CD86 och CD54 analyseras genom flödescytometri med användning av fluorescenskanalen FL-1. Baserat på det geometriska medelvärdet för fluorescensintensiteten (MFI) beräknas den relativa fluorescensintensiteten (RFI) för CD86 och CD54 för celler använda för positiv kontroll och kemikaliebehandlade celler enligt följande formel: RFI MFI för kemikaliebehandlade celler MFI för kemikaliebehandlade isotyp–kontrollceller MFI för lösningsmedels– vehikelbehandlade kontrollceller MFI för lösningsmedels– vehikelbehandlade isotyp–kontrollceller 100 Cellviabiliteten för isotyp-kontrollcellerna (som är färgade med IgG1-antikroppar från mus [isotyp]) beräknas också enligt den formel som beskrivs i punkt 19.

Prediktionsmodell

26. För mätningen av CD86/CD54-uttryck testas varje testkemikalie i minst två oberoende testomgångar för att få fram en enda prediktion (POSITIV eller NEGATIV). En h-CLAT-prediktion anses vara POSITIV om åtminstone ett av följande villkor uppfylls i två av två, eller i åtminstone två av tre, oberoende testomgångar; i annat fall anses h-CLAT-prediktionen vara NEGATIV (figur 1): RFI-värdet för CD86 är lika med eller större än 150 % vid någon testad koncentration (med cellviabilitet ≥ 50 %). RFI-värdet för CD54 är lika med eller större än 200 % vid någon testad koncentration (med cellviabilitet ≥ 50 %).

27. Baserat på ovanstående gäller att om båda de första två testomgångarna är positiva för CD86 och/eller för CD54 anses h-CLAT-prediktionen vara POSITIV och någon tredje testomgång behöver inte genomföras. På motsvarande sätt gäller att om de första två testomgångarna är negativa för båda markörerna anses h-CLAT-prediktionen vara NEGATIV (med hänsyn tagen till bestämmelserna i punkt 30) utan att någon tredje testomgång behöver genomföras. Om de första två testomgångarna emellertid inte ger samma resultat för minst en av markörerna (CD54 eller CD86), krävs en tredje testomgång och den slutliga prediktionen baseras då på majoritetsresultatet för de tre enskilda testomgångarna (det vill säga två av tre). I detta sammanhang bör det noteras att om två oberoende testomgångar genomförs och en endast är positiv för CD86 (nedan kallat P1) och den andra endast är positiv för CD54 (nedan kallat P2) krävs en tredje testomgång. Om denna tredje testomgång är negativ för båda markörerna (nedan kallat N) anses h-CLAT-prediktionen vara NEGATIV. Om å andra sidan den tredje testomgången är positiv för någon av markörerna (P1 eller P2) eller för båda markörerna (nedan kallat P12) anses h-CLAT-prediktionen vara POSITIV. Figur 1: Prediktionsmodell som används för h-CLAT-testet. En h-CLAT-prediktion bör beaktas inom ramen för en IATA och i enlighet med bestämmelserna i punkterna 7 och 8 i Allmän inledning. P1: testomgång med endast CD86 positiv, P2: testomgång med endast CD54 positiv, P12: testomgång med både CD86 och CD54 positiva, N: testomgång med varken CD86 eller CD54 positiva. * Rutorna visar de relevanta kombinationerna av resultat från de första två testomgångarna, oberoende av i vilken ordning de kan ha erhållits. # Rutorna visar de relevanta kombinationerna av resultat från de tre testomgångarna baserat på resultaten från de första två testomgångarna i rutan ovanför, men återspeglar inte den ordning i vilken de kan ha erhållits.

28. För testkemikalier som predikteras vara POSITIVA med h-CLAT-testet kan, om så önskas, två EC-värden (effektiv koncentration) fastställas, EC150 för CD86 och EC200 för CD54, det vill säga de koncentrationer vid vilka testkemikalierna ger upphov till ett RFI-värde på 150 eller 200. Dessa EC-värden kan potentiellt bidra till bedömningen av sensibiliseringsstyrka (9) när de används i integrerade arbetssätt, som exempelvis en IATA (4) (5) (6) (7) (8). De kan beräknas med hjälp av följande formler: EC 150 (för CD86) = Bkonc + [(150 - BRFI)/ARFI - BRFI) × (Akonc - Bkonc)] EC 200 (för CD86) = Bkonc + [(200 - BRFI)/ARFI - BRFI) × (Akonc - Bkonc)] där Akonc är den lägsta koncentration i μg/ml vid vilken RFI > 150 (CD86) eller 200 (CD54), Bkonc är den högsta koncentration i μg/ml vid vilken RFI < 150 (CD86) eller 200 (CD54), ARFI är RFI-värdet vid den lägsta koncentration vid vilken RFI > 150 (CD86) eller 200 (CD54), BRFI är RFI-värdet vid den högsta koncentration vid vilken RFI < 150 (CD86) eller 200 (CD54). För att få fram mer exakta EC150- och EC200-värden kan tre oberoende testomgångar för mätning av CD86/CD54-uttryck krävas. De slutliga EC150- och EC200-värdena fastställs sedan som medianvärdet för EC-värdena som räknats fram utifrån de tre oberoende testomgångarna. Om endast två av tre oberoende testomgångar uppfyller kriterierna för positivt resultat (se punkterna 26–27) används det högre EC150- eller EC200-värdet av de två beräknade värdena.

Acceptanskriterier

29. Följande acceptanskriterier ska vara uppfyllda vid användning av h-CLAT-testet (22) (27): Cellviabiliteten ska vara högre än 90 % för medium- och lösningsmedels-/vehikelkontrollerna. I lösningsmedels-/vehikelkontrollen får inte RFI-värdena för vare sig CD86 eller CD54 överstiga kriterierna för positivt resultat (CD86 RFI ≥ 150 % och CD54 RFI ≥ 200 %). RFI-värdena för lösningsmedels-/vehikelkontrollen beräknas med användning av formeln som beskrivs i punkt 25 (MFI för kemikalie ska bytas ut mot MFI för lösningsmedel/vehikel och MFI för lösningsmedel/vehikel ska bytas ut mot MFI för [medium-] kontroll). För såväl medium- som lösningsmedels-/vehikelkontrollerna ska MFI-förhållandet för både CD86 och CD54 gentemot isotypkontrollen vara > 105 %. I den positiva kontrollen (DNCB) ska RFI-värdena för både CD86 och CD54 uppfylla kriterierna för positivt resultat (CD86 RFI ≥ 150 och CD54 RFI ≥ 200) och cellviabiliteten ska vara högre än 50 %. För testkemikalien ska cellviabiliteten vara högre än 50 % i minst fyra testade koncentrationer i varje testomgång.

30. Negativa resultat godtas endast för testkemikalier som uppvisar en cellviabilitet som är lägre än 90 % vid den högsta testade koncentrationen (det vill säga 1,2 × CV75 enligt den procedur för serieutspädning som beskrivs i punkt 20). Om cellviabiliteten vid 1,2 × CV75 är lika med eller högre än 90 % ska det negativa resultatet förkastas. När så är fallet rekommenderas det att man försöker förfina dosvalet genom att upprepa fastställandet av CV75-värdet. Det bör noteras att när 5000 μg/ml i saltlösning (eller medium eller andra lösningsmedel/vehiklar), 1000 μg/ml i DMSO eller den högsta lösliga koncentrationen används som maximal testkoncentration för en testkemikalie är ett negativt resultat godtagbart även om cellviabiliteten är över 90 %.

Testrapport

31. Testrapporten ska innehålla följande information: Testkemikalie Monokomponentämne: Kemisk identifiering, t.ex. med IUPAC- eller CAS-namn, CAS-nummer, Smiles- eller InChI-kod, strukturformel och/eller andra identifieringar. Fysikaliskt tillstånd, log Kow, vattenlöslighet, löslighet i DMSO, molekylvikt och andra relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper, i den mån sådana uppgifter finns tillgängliga. Renhet, kemisk identitet för föroreningar i förekommande fall och när så är praktiskt möjligt. Behandling före testning, om detta är tillämpligt (t.ex. uppvärmning eller finfördelning). Testad koncentration/testade koncentrationer. Uppgifter om lagringsförhållanden och stabilitet i den mån sådana uppgifter finns tillgängliga. Motivering för valet av lösningsmedel/vehikel för varje testkemikalie. Multikomponentämne, UVCB och blandning: Karakteriseras så långt det är möjligt genom exempelvis kemisk identitet (se ovan), renhet, kvantitativ förekomst och relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper (se ovan) hos beståndsdelarna, i den mån sådana uppgifter finns tillgängliga. Fysikaliskt tillstånd, vattenlöslighet, löslighet i DMSO och andra relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper, i den mån sådana uppgifter finns tillgängliga. Molekylvikt eller uppskattad molekylvikt för blandningar/polymerer med kända sammansättningar eller annan information som är relevant för utförandet av undersökningen. Behandling före testning, om detta är tillämpligt (t.ex. uppvärmning eller finfördelning). Testad koncentration/testade koncentrationer. Uppgifter om lagringsförhållanden och stabilitet i den mån sådana uppgifter finns tillgängliga. Motivering för valet av lösningsmedel/vehikel för varje testkemikalie. Kontroller Positiv kontroll: Kemisk identifiering, t.ex. med IUPAC- eller CAS-namn, CAS-nummer, Smiles- eller InChI-kod, strukturformel och/eller andra identifieringar. Fysikaliskt tillstånd, log Kow, vattenlöslighet, löslighet i DMSO, molekylvikt och andra relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper, i den mån sådana uppgifter finns tillgängliga och när så är tillämpligt. Renhet, kemisk identitet för föroreningar i förekommande fall och när så är praktiskt möjligt. Behandling före testning, om detta är tillämpligt (t.ex. uppvärmning eller finfördelning). Testad koncentration/testade koncentrationer. Uppgifter om lagringsförhållanden och stabilitet i den mån sådana uppgifter finns tillgängliga. Hänvisning till tidigare resultat för positiv kontroll som visar på lämpliga acceptanskriterier för testomgångar, om detta är tillämpligt. Negativ kontroll och lösningsmedels-/vehikelkontroll: Kemisk identifiering, t.ex. med IUPAC- eller CAS-namn, CAS-nummer, Smiles- eller InChI-kod, strukturformel och/eller andra identifieringar. Renhet, kemisk identitet för föroreningar i förekommande fall och när så är praktiskt möjligt. Fysikaliskt tillstånd, molekylvikt och andra relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper om annat lösningsmedel/annan vehikel för kontroll än de som anges i testriktlinjen används, i den mån sådana uppgifter finns tillgängliga. Uppgifter om lagringsförhållanden och stabilitet i den mån sådana uppgifter finns tillgängliga. Motivering för valet av lösningsmedel/vehikel för varje testkemikalie. Testbetingelser Namn och adress för sponsor, testanläggning och försöksledare. Beskrivning av använt test. Använd cellinje samt dess lagringsförhållanden och källa (till exempel den anläggning varifrån cellerna erhölls). Använd utrustning för flödescytometri (till exempel modell), inklusive använda instrumentinställningar, använt globulin och använda antikroppar och cytotoxicitetsmarkörer. Det förfarande som använts för att visa att laboratoriet är kvalificerat att utföra testet, genom test av kvalifikationsämnen, samt det förfarande som använts för att visa att testet kan reproduceras över tid, till exempel historiska kontrolldata och/eller historiska data för reaktivitetskontroller. Testets acceptanskriterier Erhållna värden för cellviabilitet, MFI och RFI med lösningsmedels-/vehikelkontrollen jämfört med de godkända intervallen. Erhållna värden för cellviabilitet och RFI med den positiva kontrollen jämfört med de godkända intervallen. Cellviabiliteten för alla testade koncentrationer av den testade kemikalien. Testförfarande Antal utförda testomgångar. Testkemikaliens koncentrationer, applicering och exponeringstid (vid avvikelser från rekommendationerna). Beskrivning av de utvärderings- och beslutskriterier som använts. Beskrivning av eventuella modifieringar av testförfarandet. Resultat Tabelluppställning av erhållna data, inklusive CV75 (om detta är tillämpligt), individuella geometriska MFI-, RFI- och cellviabilitetsvärden samt EC150/EC200-värden (om detta är tillämpligt), för testkemikalien och för den positiva kontrollen i varje testomgång, samt en indikering av testkemikaliens klassificering enligt prediktionsmodellen. Beskrivning av andra relevanta observationer, i förekommande fall. Diskussion kring resultaten Diskussion kring de resultat som har erhållits med h-CLAT-testet. Beaktande av testets resultat inom ramen för en IATA, om annan relevant information finns att tillgå. Slutsatser

LITTERATUR

1 Ashikaga T, Yoshida Y, Hirota M, Yoneyama K, Itagaki H, Sakaguchi H, Miyazawa M, Ito Y, Suzuki H, Toyoda H. (2006). Development of an in vitro skin sensitization test using human cell lines: The human Cell Line Activation Test (h-CLAT) I. Optimization of the h-CLAT protocol. Toxicol. In Vitro 20, s. 767–773.

2 Miyazawa M, Ito Y, Yoshida Y, Sakaguchi H, Suzuki H. (2007). Phenotypic alterations and cytokine production in THP-1 cells in response to allergens. Toxicol. In Vitro 21, s. 428–437.

3 EC EURL-ECVAM (2013). Recommendation on the human Cell Line Activation Test (h-CLAT) for skin sensitisation testing. Finns på https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/eurl-ecvam-recommendations

4 Takenouchi O, Fukui S, Okamoto K, Kurotani S, Imai N, Fujishiro M, Kyotani D, Kato Y, Kasahara T, Fujita M, Toyoda A, Sekiya D, Watanabe S, Seto H, Hirota M, Ashikaga T, Miyazawa M. (2015). Test battery with the human cell line activation test, direct peptide reactivity assay and DEREK based on a 139 chemical data set for predicting skin sensitizing potential and potency of chemicals. J Appl Toxicol. 35, s. 1318–1332.

5 Hirota M, Fukui S, Okamoto K, Kurotani S, Imai N, Fujishiro M, Kyotani D, Kato Y, Kasahara T, Fujita M, Toyoda A, Sekiya D, Watanabe S, Seto H, Takenouchi O, Ashikaga T, Miyazawa M. (2015). Evaluation of combinations of in vitro sensitization test descriptors for the artificial neural network-based risk assessment model of skin sensitization. J Appl Toxicol. 35, s. 1333–1347.

6 Bauch C, Kolle SN, Ramirez T, Fabian E, Mehling A, Teubner W, van Ravenzwaay B, Landsiedel R. (2012). Putting the parts together: combining in vitro methods to test for skin sensitizing potencials. Regul Toxicol Parmacol. 63, s. 489–504.

7 Van der Veen JW, Rorije E, Emter R, Natch A, van Loveren H, Ezendam J. (2014). Evaluating the performance of integrated approaches for hazard identification of skin sensitizing chemicals. Regul Toxicol Pharmacol. 69, s. 371–379.

8 Urbisch D, Mehling A, Guth K, Ramirez T, Honarvar N, Kolle S, Landsiedel R, Jaworska J, Kern PS, Gerberick F, Natsch A, Emter R, Ashikaga T, Miyazawa M, Sakaguchi H. (2015). Assessing skin sensitization hazard in mice and men using non-animal test methods. Regul Toxicol Parmacol. 71, s. 337–351.

9 Jaworska JS, Natsch A, Ryan C, Strickland J, Ashikaga T, Miyazawa M. (2015). Bayesian integrated testing strategy (ITS) for skin sensitization potency assessment: a decision support system for quantitative weight of evidence and adaptive testing strategy. Arch Toxicol. 89, s. 2355–2383.

10 Strickland J, Zang Q, Kleinstreuer N, Paris M, Lehmann DM, Choksi N, Matheson J, Jacobs A, Lowit A, Allen D, Casey W. (2016). Integrated decision strategies for skin sensitization hazard. J Appl Toxicol. DOI 10.1002/jat.3281.

11 Nukada Y, Ashikaga T, Miyazawa M, Hirota M, Sakaguchi H, Sasa H, Nishiyama N. (2012). Prediction of skin sensitization potency of chemicals by human Cell Line Activation Test (h-CLAT) and an attempt at classifying skin sensitization potency. Toxicol. In Vitro 26, s. 1150–1160.

12 EC EURL ECVAM (2015). Re-analysis of the within and between laboratory reproducibility of the human Cell Line Activation Test (h-CLAT). Finns på https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/eurl-ecvam-recommendations/eurl-ecvam-recommendation-on-the-human-cell-line-activation-test-h-clat-for-skin-sensitisation-testing

13 EC EURL ECVAM (2012). human Cell Line Activation Test (h-CLAT) Validation Study Report. Finns på https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/eurl-ecvam-recommendations

14 Takenouchi O, Miyazawa M, Saito K, Ashikaga T, Sakaguchi H. (2013). Predictive performance of the human Cell Line Activation Test (h-CLAT) for lipophilic with high octanol-water partition coefficients. J. Toxicol. Sci. 38, s. 599–609.

15 Ashikaga T, Sakaguchi H, Sono S, Kosaka N, Ishikawa M, Nukada Y, Miyazawa M, Ito Y, Nishiyama N, Itagaki H. (2010). A comparative evaluation of in vitro skin sensitisation tests: the human cell-line activation test (h-CLAT) versus the local lymph node assay (LLNA). Altern. Lab. Anim. 38, s. 275–284.

16 Fabian E., Vogel D., Blatz V., Ramirez T., Kolle S., Eltze T., van Ravenzwaay B., Oesch F., Landsiedel R. (2013). Xenobiotic metabolizin enzyme activities in cells used for testing skin sensitization in vitro. Arch Toxicol 87, s. 1683–1969.

17 Okamoto K, Kato Y, Kosaka N, Mizuno M, Inaba H, Sono S, Ashikaga T, Nakamura T, Okamoto Y, Sakaguchi H, Kishi M, Kuwahara H, Ohno Y. (2010). The Japanese ring study of a human Cell Line Activation Test (h-CLAT) for predicting skin sensitization potential (6th report): A study for evaluating oxidative hair dye sensitization potential using h-CLAT. ATLA 15, s. 81–88.

18 DB-ALM (INVITTOX) (2014). Protocol 158: human Cell Line Activation Test (h-CLAT), s. 23. Finns på http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/

19 Mizuno M, Yoshida M, Kodama T, Kosaka N, Okamato K, Sono S, Yamada T, Hasegawa S, Ashikaga T, Kuwahara H, Sakaguchi H, Sato J, Ota N, Okamoto Y, Ohno Y. (2008). Effects of pre-culture conditions on the human Cell Line Activation Test (h-CLAT) results; Results of the 4th Japanese inter-laboratory study. ATLA 13, s. 70–82.

20 Sono S, Mizuno M, Kosaka N, Okamoto K, Kato Y, Inaba H, Nakamura T, Kishi M, Kuwahara H, Sakaguchi H, Okamoto Y, Ashikaga T, Ohno Y. (2010). The Japanese ring study of a human Cell Line Activation Test (h-CLAT) for predicting skin sensitization potential (7th report): Evaluation of volatile, poorly soluble fragrance materials. AATEX 15, s. 89–96.

21 OECD (2005). Guidance Document No 34 on The Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. OECD Series on Testing and Assessment. Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD), Paris, Frankrike, 2005, s. 96.

22 OECD (2012). The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence. Series on Testing and Assessment No 168. Finns på http://www.oecd.org/officialdocuments/publicdisplaydocumentpdf/?cote=ENV/JM/MONO(2012)10/PART1&docLanguage=En

23 Förenta nationerna (FN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS, det globalt harmoniserade systemet för klassificering och märkning av kemikalier). Femte reviderade utgåvan. New York och Genève: United Nations Publications. ISBN: 978-92-1-117006-1. Finns på http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html

24 ECETOC (2003). Contact sensitization: Classification according to potency. European Centre for Ecotoxicology & Toxicology of Chemicals (Technical Report No 87).

25 Ashikaga T, Sakaguchi H, Okamoto K, Mizuno M, Sato J, Yamada T, Yoshida M, Ota N, Hasegawa S, Kodama T, Okamoto Y, Kuwahara H, Kosaka N, Sono S, Ohno Y. (2008). Assessment of the human Cell Line Activation Test (h-CLAT) for Skin Sensitization; Results of the First Japanese Inter-laboratory Study. AATEX 13, s. 27–35.

Tillägg 1.1

DEFINITIONER

Tillägg 1.2

KVALIFIKATIONSÄMNEN

Innan testet som beskrivs i detta tillägg till testmetod B.71 används rutinmässigt, bör laboratoriet styrka sin tekniska kompetens genom att korrekt erhålla den förväntade h-CLAT-prediktionen för de tio ämnen som rekommenderas i tabell 1 och genom att erhålla CV75-, EC150- och EC200-värden som håller sig inom respektive referensintervall för minst åtta av de tio kvalifikationsämnena. Dessa kvalifikationsämnen har valts ut för att representera hela skalan av responser gällande risker för hudsensibilisering. Övriga urvalskriterier var att ämnena ska vara kommersiellt tillgängliga, att det ska finnas in vivo-referensdata av hög kvalitet och att det ska finnas in vitro-data av hög kvalitet genererade med h-CLAT-testet. Det finns dessutom publicerade referensdata att tillgå för h-CLAT-testet (3) (14).

1 In vivo-prediktioner gällande fara (och styrka) är baserade på LLNA-data (3) (14). In vivo-styrkan härleds med användning av de kriterier som föreslagits av ECETOC (24).

2 Baserat på historiskt observerade värden (13) (25).

3 Historiskt sett har negativa resultat varit i majoritet för denna markör och därför förväntas huvudsakligen ett negativt resultat. Intervallet som anges har definierats baserat på ett fåtal historiskt observerade positiva resultat. Om ett positivt resultat erhålls ska EC-värdet ligga inom det redovisade referensintervallet.

Tillägg 2

IN VITRO-TEST AVSEENDE HUDSENSIBILISERING: U-SENS™ (AKTIVERINGSTEST FÖR CELLINJEN U937)

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR

1. U-SENS™-testet kvantifierar förändringen i uttrycket av en cellytemarkör som är kopplad till aktiveringsprocessen för monocyter och dendritiska celler (det vill säga CD86) hos den humana cellinjen U937 (med ursprung i histiocytiskt lymfom) efter exponering för sensibiliserande ämnen (1). De uppmätta uttrycksnivåerna för cellytemarkören CD86 i cellinjen U937 används sedan för att understödja uppdelningen mellan hudsensibiliserande ämnen och icke-hudsensibiliserande ämnen.

2. U-SENS™-testet har utvärderats i en valideringsstudie (2) samordnad av L’Oreal med efterföljande oberoende kollegial granskning av EURL ECVAM:s rådgivande vetenskapliga kommitté (ESAC) (3). Med beaktande av alla tillgängliga bevis och inkomna åsikter från tillsynsmyndigheter och intressenter, rekommenderades U-SENS™-testet av EURL ECVAM (4) att användas som en del av en IATA för att understödja uppdelningen mellan hudsensibiliserande ämnen och icke-hudsensibiliserande ämnen för faroklassificering och -märkning. I sitt vägledande dokument om redovisning av strukturerade arbetssätt för dataintegrering och individuella informationskällor använda inom ramen för en IATA för hudsensibilisering, diskuterar OECD för närvarande ett antal fallstudier som beskriver olika teststrategier och prediktionsmodeller. Ett av de definierade arbetssätten är baserat på U-SENS™-testet (5). Exempel på användning av data från U-SENS™-test i kombination med annan information, däribland historiska data och befintliga giltiga data gällande människor (6), finns även redovisade på andra ställen i litteraturen (4) (5) (7).

3. U-SENS™-testet har visat sig vara överförbart till laboratorier som har erfarenhet av cellodlingstekniker och flödescytometrisk analys. Testets förväntade reproducerbarhet i fråga om prediktioner är i storleksordningen 90 % inom laboratorier respektive 84 % mellan laboratorier (8). De erhållna resultaten i valideringsstudien (8) och andra publicerade studier (1) visar sammantaget att jämfört med LLNA-resultat är noggrannheten när det gäller att skilja mellan hudsensibiliserande ämnen (det vill säga kategori 1 enligt GHS/CLP-förordningen) och icke-hudsensibiliserande ämnen 86 % (N = 166), med en sensitivitet på 91 % (118/129) och en specificitet på 65 % (24/37). Jämfört med resultat på människa är noggrannheten när det gäller att skilja mellan hudsensibiliserande ämnen (det vill säga kategori 1 enligt GHS/CLP-förordningen) och icke-hudsensibiliserande ämnen 77 % (N = 101) med en sensitivitet på 100 % (58/58) och en specificitet på 47 % (20/43). Det är mer sannolikt att falska negativa prediktioner med U-SENS™-testet, jämfört med LLNA-resultat, gäller kemikalier som uppvisar en låg till måttlig hudsensibiliserande styrka (det vill säga underkategori 1B enligt GHS/CLP-förordningen) än kemikalier som uppvisar en hög hudsensibiliserande styrka (det vill säga underkategori 1A enligt GHS/CLP-förordningen) (1) (8) (9). Sammantaget visar informationen att U-SENS™-testet på ett användbart sätt bidrar till identifieringen av risker för hudsensibilisering. De noggrannhetsvärden som anges här för U-SENS™-testet som ett fristående test är dock endast vägledande, eftersom testet bör beaktas i kombination med andra informationskällor inom ramen för en IATA och i enlighet med bestämmelserna i punkterna 7 och 8 i Allmän inledning. Vid utvärdering av tester utan djurförsök gällande hudsensibilisering bör man dessutom tänka på att såväl LLNA-testet som andra djurförsök eventuellt inte avspeglar situationen för människor fullt ut.

4. U-SENS™-testet har, baserat på de uppgifter som finns tillgängliga för närvarande, visat sig vara tillämpligt för testkemikalier (inklusive beståndsdelar i kosmetika, till exempel konserveringsmedel, ytaktiva ämnen, aktiva substanser och färgämnen) som omfattar en rad olika organiska funktionella grupper, fysikalisk-kemiska egenskaper och hudsensibiliseringsstyrkor (vilket har fastställts i in vivo-undersökningar), samt spektrumet av reaktionsmekanismer som är kända för att vara associerade med hudsensibilisering (det vill säga Michaeladdition, Schiff-basbildning, acylering, bimolekylär nukleofil substitution [SN2] eller nukleofil aromatisk substitution [SNAr]) (1) (8) (9) (10). U-SENS™-testet är tillämpligt för testkemikalier som är lösliga eller som bildar en stabil dispersion (det vill säga en kolloid eller en suspension i vilken testkemikalien inte sjunker till botten eller separeras från lösningsmedlet/vehikeln till olika faser) i ett lämpligt lösningsmedel/en lämplig vehikel (se punkt 13). Kemikalier i datamängden som rapporteras vara prehaptener (det vill säga ämnen som aktiveras genom oxidation) eller prohaptener (det vill säga ämnen som kräver enzymatisk aktivering, till exempel via P450-enzymer) har kunnat predikteras korrekt med U-SENS™-testet (1) (10). Membranförstörande ämnen kan leda till falska positiva resultat till följd av en icke-specifik ökning av CD86-uttrycket, vilket visas av att tre av sju falska positiva svar i förhållande till in vivo-referensklassificeringen var ytaktiva ämnen (1). Av den anledningen bör positiva resultat med ytaktiva ämnen betraktas med försiktighet, medan negativa resultat med ytaktiva ämnen fortfarande kan användas som stöd för identifieringen av testkemikalien som ett icke-sensibiliserande ämne. Fluorescerande testkemikalier kan bedömas med U-SENS™-testet (1), men det bör noteras att kraftigt fluorescerande testkemikalier som sänder ut ljus med samma våglängd som fluoresceinisotiocyanat (FITC) eller propidiumjodid (PI) kommer att störa den flödescytometriska detekteringen och därför inte kan bedömas korrekt med användning av FITC-konjugerade antikroppar (potential för falska negativa resultat) eller PI (viabiliteten är inte mätbar). I sådana fall kan andra fluorokrommärkta antikroppar respektive andra markörer för cytotoxicitet användas, så länge det kan visas att de ger liknande resultat som FITC-märkta antikroppar eller PI (se punkt 18), till exempel genom test av kvalifikationsämnena i tillägg 2.2. Mot bakgrund av det ovanstående bör positiva resultat med ytaktiva ämnen och negativa resultat med kraftigt fluorescerande testkemikalier tolkas utifrån de fastställda begränsningarna och tillsammans med andra informationskällor, inom ramen för en IATA. Om det finns bevis för att U-SENS™-testet inte är tillämpligt för andra specifika kategorier av testkemikalier, bör det inte användas för dessa specifika kategorier.

5. Som beskrivs ovan kan U-SENS™-testet användas för att understödja uppdelningen mellan hudsensibiliserande ämnen och icke-hudsensibiliserande ämnen. Eventuellt kan testet även bidra till bedömningen av sensibiliseringens styrka när det används i integrerade arbetssätt, exempelvis en IATA. Det krävs dock ytterligare arbete, företrädesvis baserat på data gällande människor, för att avgöra hur U-SENS™-resultat skulle kunna ligga till grund för en bedömning av sensibiliseringens styrka.

6. Definitioner av begrepp finns i tillägg 2.1.

TESTETS PRINCIP

7. U-SENS™-testet är ett in vitro-test som kvantifierar förändringar i uttrycket av CD86-cellytemarkör hos celler från den humana cellinjen U937 (med ursprung i histiocytiskt lymfom), efter 45 ± 3 timmars exponering för testkemikalien. CD86-cellytemarkören är en typisk markör för U937-aktivering. Det är allmänt känt att CD86 är en samstimulerande molekyl som kan efterlikna monocytisk aktivering, som spelar en avgörande roll vid priming av T-celler. Förändringarna i uttrycket av CD86-cellytemarkören mäts genom flödescytometri efter infärgning av cellerna, normalt med FITC-märkta antikroppar. Mätningar av cytotoxiciteten utförs också parallellt (till exempel med användning av PI) för att bedöma huruvida uppregleringar av uttrycket av CD86-cellytemarkören förekommer vid subcytotoxiska koncentrationer. Stimulationsindexet (SI) för CD86-cellytemarkören jämfört med lösningsmedels-/vehikelkontrollen beräknas och används i prediktionsmodellen (se punkt 19) för att understödja uppdelningen mellan hudsensibiliserande ämnen och icke-hudsensibiliserande ämnen.

DEMONSTRATION AV KOMPETENS

8. Innan testet som beskrivs i detta tillägg till testmetod B.71 används rutinmässigt, bör laboratoriet styrka sin tekniska kompetens med användning av de tio kvalifikationsämnen som anges i tillägg 2.2, i enlighet med god praxis för in vitro-metoder (11). Dessutom bör användare av testet föra en historisk databas över data som erhålls genom reaktivitetskontrollerna (se punkt 11) och genom de positiva kontrollerna och lösningsmedels-/vehikelkontrollerna (se punkterna 15–16) och använda dessa data för att styrka att testets reproducerbarhet bibehålls i laboratoriet över tid.

FÖRFARANDE

9. Det här testet är baserat på U-SENS™ DB-ALM-protokoll (DataBase service on ALternative Methods to animal experimentation) nr 183 (12). Standardförfaranden (SOP, Standard Operating Procedures) bör användas när U-SENS™-testet införs och används i laboratoriet. Ett automatiserat system för genomförande av U-SENS™-testet kan användas om det kan styrkas att det ger liknande resultat, till exempel genom test av kvalifikationsämnena i tillägg 2.2. Nedan följer en beskrivning av de viktigaste delarna i och förfarandena för U-SENS™-testet.

Förberedelse av celler

10. Den humana cellinjen U937 (med ursprung i histiocytiskt lymfom) (13) ska användas vid utförandet av U-SENS™-testet. Celler (av klon CRL1593.2) bör erhållas från en välmeriterad cellbank, exempelvis American Type Culture Collection.

11. U937-celler odlas, vid 37 °C i en fuktad atmosfär med 5 % CO2, i RPMI-1640-medium som har kompletterats med 10 % fetalt kalvserum (FCS), 2 mM L-glutamin, 100 enheter/ml penicillin och 100 μg/ml streptomycin (nedan kallat komplett medium). U937-celler ska regelbundet genomgå cellpassage, varannan till var tredje dag, med en densitet på 1,5 respektive 3 × 105 celler/ml. Celldensiteten bör inte överstiga 2 × 106 celler/ml och cellviabiliteten, uppmätt genom infärgning av döda celler med trypanblått, bör vara ≥ 90 % (gäller inte vid den första cellpassagen efter upptining). Innan de används för testning bör varje sats med celler, FCS eller antikroppar genomgå en kvalificering i form av en reaktivitetskontroll. Reaktivitetskontrollen av cellerna bör utföras med användning av den positiva kontrollen trinitrobensensulfonsyra (2,4,6-trinitrobensensulfonsyra: TNBS) (CAS-nr 2508-19-2, ≥ 99 % renhet) och den negativa kontrollen mjölksyra (CAS-nr 50-21-5, ≥ 85 % renhet), när det har gått åtminstone en vecka efter upptining. För reaktivitetskontrollen bör sex slutliga koncentrationer testas för var och en av de båda kontrollerna (TNBS: 1, 12,5, 25, 50, 75 och 100 μg/ml och mjölksyra: 1, 10, 20, 50, 100 och 200 μg/ml). TNBS löst i komplett medium bör ge en positiv och koncentrationsrelaterad respons för CD86 (till exempel när en positiv koncentration, CD86 SI ≥ 150, följs av en koncentration med ett högre CD86 SI-värde) och mjölksyra löst i komplett medium bör ge en negativ respons för CD86 (se punkt 21). Endast sådana satser med celler som har klarat reaktivitetskontrollen två gånger ska användas för testet. Celler kan förökas upp till sju veckor efter upptining. Antalet passager bör inte överstiga 21. Reaktivitetskontrollen bör utföras i enlighet med de förfaranden som beskrivs i punkterna 18–22.

12. För testet sås U937-celler ut med en densitet på antingen 3 × 105 celler/ml eller 6 × 105 celler/ml, varefter de förodlas i odlingsflaskor under två dygn respektive ett dygn. Andra förodlingsförhållanden än de som beskrivs ovan kan användas om en tillfredsställande vetenskaplig motivering tillhandahålls och om det kan styrkas att liknande resultat uppnås, till exempel genom test av kvalifikationsämnena i tillägg 2.2. På testdagen resuspenderas de skördade cellerna från odlingsflaskorna med nytt odlingsmedium, så att en koncentration på 5 × 105 celler/ml erhålls. Därefter fördelas cellerna i en flatbottnad 96-hålsplatta med 100 μl per brunn (vilket ger en slutlig celldensitet på 0,5 × 105 celler/brunn).

Beredning av testkemikalier och kontrollämnen

13. Lösligheten bedöms före testet. För detta ändamål löses testkemikalierna upp eller dispergeras i en stabil dispersion, med koncentrationen 50 mg/ml, i komplett medium som primärt lösningsmedelsalternativ eller dimetylsulfoxid (DMSO, ≥ 99 % renhet) som sekundärt lösningsmedels-/vehikelalternativ om testkemikalien inte är löslig i lösningsmedlet/vehikeln komplett medium. För själva testet löses testkemikalien till en slutlig koncentration på 0,4 mg/ml i komplett medium, om kemikalien är löslig i detta lösningsmedel/denna vehikel. Om kemikalien endast är löslig i DMSO, löses kemikalien till en koncentration på 50 mg/ml. Andra lösningsmedel/vehiklar än de som beskrivs ovan kan användas om en tillfredsställande vetenskaplig motivering tillhandahålls. Testkemikaliens stabilitet i det slutliga lösningsmedlet/den slutliga vehikeln ska tas i beaktande.

14. Testkemikalierna och kontrollämnena bereds på testdagen. Eftersom något dosfinnande test inte genomförs bör, för den första testomgången, sex slutliga koncentrationer testas (1, 10, 20, 50, 100 och 200 μg/ml), utspädda i motsvarande lösningsmedel/vehikel, antingen komplett medium eller 0,4 % DMSO i medium. För de efterföljande testomgångarna ska minst fyra arbetslösningar (det vill säga minst fyra koncentrationer), med start från en testkemikalielösning på 0,4 mg/ml i komplett medium eller 50 mg/ml i DMSO, beredas med användning av motsvarande lösningsmedel/vehikel. Arbetslösningarna används slutligen för behandlingen genom att en lika stor volym U937-cellsuspension (se punkt 11 ovan) som volymen arbetslösning tillsätts till plattan, vilket ger en ytterligare tvåfaldig spädning (12). Koncentrationerna (minst fyra koncentrationer) för eventuella ytterligare testomgångar väljs baserat på de enskilda resultaten från alla tidigare testomgångar (8). De användbara slutliga koncentrationerna är 1, 2, 3, 4, 5, 7,5, 10, 12,5, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 och 200 μg/ml. Den maximala slutliga koncentrationen är 200 μg/ml. Om ett CD86-positivt värde observeras vid 1 μg/ml ska man göra ett test vid 0,1 μg/ml för att hitta den koncentration av testkemikalien som inte ger upphov till en CD86-respons över gränsen för positivt resultat. För varje testomgång beräknas EC150-värdet (den koncentration vid vilken en kemikalie uppnår det CD86-positiva gränsvärdet 150 %, se punkt 19), om en CD86-positiv koncentrationsrespons observeras. Om testkemikalien ger upphov till en positiv CD86-respons som inte är koncentrationsrelaterad är det eventuellt inte relevant att beräkna EC150-värdet, enligt beskrivningen i U-SENS™ DB-ALM-protokoll nr 183 (12). För varje testomgång beräknas CV70-värdet (den koncentration vid vilken en kemikalie uppnår cytotoxicitetsgränsvärdet på 70 %, se punkt 19), om detta är möjligt (12). För att undersöka den koncentrationsrelaterade responsen vid ökat CD86-värde, bör valfria koncentrationer bland de användbara koncentrationerna väljas ut, jämnt spridda mellan EC150 (eller den högsta CD86-negativa icke-cytotoxiska koncentrationen) och CV70 (eller den högsta tillåtna koncentrationen, det vill säga 200 μg/ml). Minst fyra koncentrationer bör testas per testomgång, där åtminstone två koncentrationer är gemensamma med den föregående testomgången/de föregående testomgångarna, för jämförelse.

15. Lösningsmedels-/vehikelkontrollen som används i U-SENS™-testet utgörs av komplett medium (för testkemikalier som är upplösta eller dispergerade i en stabil dispersion i komplett medium) (se punkt 4) eller 0,4 % DMSO i komplett medium (för testkemikalier som är upplösta eller dispergerade i en stabil dispersion i DMSO).

16. Den positiva kontrollen som används i U-SENS™-testet utgörs av TNBS (se punkt 11), som har beretts i komplett medium. TNBS bör användas som positiv kontroll för mätning av CD86-uttryck i en enda slutlig koncentration i plattan (50 μg/ml) som ger > 70 % cellviabilitet. För att uppnå en koncentration på 50 μg/ml TNBS i plattan bereds en 1 M (det vill säga 293 mg/ml) stamlösning av TNBS i komplett medium, som sedan späds vidare 2930-faldigt med komplett medium till en arbetslösning på 100 μg/ml. Mjölksyra (CAS-nr 50-21-5) bör användas som negativ kontroll med koncentrationen 200 μg/ml löst i komplett medium (från en stamlösning på 0,4 mg/ml). I varje platta för varje testomgång bereds tre replikat med obehandlad kontroll (komplett medium), lösningsmedels-/vehikelkontroll, negativ kontroll och positiv kontroll (12). Andra lämpliga positiva kontroller kan användas om historiska data finns att tillgå för att härleda jämförbara acceptanskriterier. Acceptanskriterierna är desamma som de som beskrivs för testkemikalien (se punkt 12).

Applicering av testkemikalier och kontrollämnen

17. Lösningsmedels-/vehikelkontrollen eller arbetslösningarna som beskrivs i punkterna 14–16 blandas 1:1 (volymförhållande) med de cellsuspensioner som beretts i den flatbottnade 96-hålsplattan (se punkt 12). De behandlade plattorna inkuberas därefter i 45 ± 3 timmar vid 37 °C i en atmosfär med 5 % CO2. Innan inkuberingen förseglas plattorna med semipermeabla membran, för att förhindra avdunstning av flyktiga testkemikalier och korskontaminering mellan celler behandlade med testkemikalier (12).

Cellinfärgning

18. Efter 45 ± 3 timmars exponering överförs cellerna till en mikrotiterplatta med brunnar med V-formad botten och samlas upp genom centrifugering. Störd löslighet definieras som kristaller eller droppar som kan observeras under mikroskop 45 ± 3 timmar efter behandling (innan cellinfärgningen). Supernatanterna kasseras och de kvarvarande cellerna tvättas en gång med 100 μl iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS, Phosphate Buffered Saline) som innehåller 5 % fetalt kalvserum (infärgningsbuffert). Efter centrifugeringen resuspenderas cellerna med 100 μl infärgningsbuffert och färgas med 5 μl (till exempel 0,25 μg) FITC-märkta antikroppar av typ anti-CD86 eller IgG1 från mus (isotyp) vid 4 °C under 30 minuter, skyddat från ljus. De antikroppar som beskrivs i U-SENS™ DB-ALM-protokoll nr 183 (12) ska användas (för CD86: BD-PharMingen nr 555657, klon: Fun-1, eller Caltag/Invitrogen nr MHCD8601, klon: BU63; och för IgG1: BD-PharMingen nr 555748 eller Caltag/Invitrogen nr GM4992). Enligt testutvecklarnas erfarenhet är fluorescensintensiteten hos antikropparna vanligtvis likartad mellan olika satser. Antikroppar av andra kloner eller från andra leverantörer som har klarat reaktivitetskontrollen får användas för testet (se punkt 11). Användarna kan dock överväga att titrera antikropparna under de egna laboratorieförhållandena för att få fram den bästa användningskoncentrationen. Andra detekteringssystem, som fluorokrommärkta antikroppar av typ anti-CD86, kan användas om det kan visas att de ger liknande resultat som FITC-konjugerade antikroppar, till exempel genom av test av kvalifikationsämnena i tillägg 2.2. Efter två tvättar med 100 μl infärgningsbuffert och en tvätt med 100 μl iskall PBS resuspenderas cellerna i iskall PBS (till exempel 125 μl för prover som ska analyseras manuellt rör för rör eller 50 μl vid användning av en autosampler-platta) och PI-lösning tillsätts (med en slutlig koncentration på 3 μg/ml). Andra cytotoxicitetsmarkörer, som 7-aminoaktinomycin D (7-AAD) eller trypanblått, kan användas om det kan visas att den alternativa infärgningen ger liknande resultat som PI, till exempel genom test av kvalifikationsämnena i tillägg 2.2.

Analys genom flödescytometri

19. Uttrycksnivån för CD86 och cellviabiliteten analyseras med hjälp av flödescytometri. Cellerna visas i ett punktdiagram med logaritmisk skala utifrån storlek (FSC) och granularitet (SSC), i syfte att tydligt identifiera populationen inom en första avgränsning R1 och eliminera skräp från döda celler. Ett målantal på 10000 celler inom avgränsning R1 mäts för varje brunn. Celler från samma R1-avgränsning visas i ett FL3 eller FL4/SSC-punktdiagram. Viabla celler avskiljs genom en andra avgränsning R2, som väljer ut populationen av propidiumjodid-negativa celler (kanal FL3 eller FL4). Cellviabiliteten kan beräknas av cytometriundersökningens analysprogram med användning av nedanstående formel. Om cellviabiliteten är låg bör upp till 20000 celler, inklusive döda celler, mätas. Alternativt kan data samlas in under en minut från det att analysen påbörjas. Cellviabilitet Antal levande celler Totalt antal registrerade celler 100 Procentandelen FL1-positiva celler mäts sedan bland dessa viabla celler som avgränsats genom R2 (inom R1). Cellytornas uttryck av CD86 analyseras i ett FL1/SSC-punktdiagram som avgränsats till viabla celler (R2). För brunnarna med komplett medium/IgG1 sätts analysmarkören nära huvudpopulationen, så att kontrollerna för komplett medium har IgG1 inom målzonen 0,6 % till 0,9 %. Färginterferens definieras som en skiftning hos punktdiagrammet för FITC-märkt IgG1 (SI [geometriskt medelvärde] för IgG1 FL1 ≥ 150 %) Stimulationsindexet (SI) för CD86 för kontrollceller (obehandlade eller i 0,4 % DMSO) och kemikaliebehandlade celler beräknas enligt följande formel:. S.I. % CD86 behandlade celler % IgG1 behandlade celler % CD86 kontrollceller % IgG1 kontrollceller 100 % IgG1+ obehandlade kontrollceller: avser procentandelen FL1-positiva IgG1-celler som definierats med analysmarkören (godkänt intervall ≥ 0,6 % och < 1,5 %, se punkt 22) bland de viabla obehandlade cellerna. % IgG1+/CD86+ kontrollceller/behandlade celler: avser procentandelen FL1-positiva IgG1/CD86-celler uppmätta utan förflyttning av analysmarkören bland de viabla kontrollcellerna/behandlade cellerna.

DATA OCH RAPPORTERING

Utvärdering av data

20. Följande parametrar beräknas i U-SENS™-testet: CV70-värdet, det vill säga den koncentration som uppvisar 70 % överlevnad hos U937-cellerna (30 % cytotoxicitet), och EC150-värdet, det vill säga den koncentration vid vilken testkemikalierna ger upphov till ett CD86-stimulationsindex (SI) på 150 %. CV70-värdet beräknas genom log-linjär interpolering med användning av följande formel: CV70 = C1 + [(V1 – 70) / (V1 – V2) × (C2 – C1)] där V1 är minimivärdet för en cellviabilitet över 70 %, V2 är maximivärdet för en cellviabilitet under 70 %, C1 och C2 är koncentrationerna som ger upphov till cellviabilitetsvärdena V1 respektive V2. Andra metoder för att få fram CV70-värdet kan användas så länge det kan visas att detta inte har någon inverkan på resultaten (till exempel genom test av kvalifikationsämnena). EC150-värdet beräknas genom log-linjär interpolering med användning av följande formel: EC150 = C1 + [(150 – SI 1) / (SI 2 – SI 1) × (C2 – C1)] där C1 är den högsta koncentrationen i μg/ml med ett CD86 SI-värde < 150 % (SI 1), C2 är den lägsta koncentrationen i μg/ml med ett CD86 SI-värde ≥ 150 % (SI 2). EC150- och CV70-värdena beräknas enligt följande: För varje enskild testomgång: De enskilda EC150- och CV70-värdena används som verktyg för att undersöka den koncentrationsrelaterade responsen vid ökat CD86-värde (se punkt 14). Det övergripande CV70-värdet fastställs baserat på de genomsnittliga viabiliteterna (12). Det övergripande EC150-värdet fastställs för en testkemikalie som predikterats som POSITIV med U-SENS™-testet baserat på genomsnittligt SI för CD86 (se punkt 21) (12).

Prediktionsmodell

21. För mätningen av CD86-uttryck testas varje testkemikalie i minst fyra koncentrationer och i minst två oberoende testomgångar (som utförs på olika dagar) för att få fram en enda prediktion (NEGATIV eller POSITIV). Det enskilda resultatet för en U-SENS™-testomgång anses vara negativt (nedan kallat N) om SI-värdet för CD86 är lägre än 150 % vid alla icke-cytotoxiska koncentrationer (cellviabilitet ≥ 70 %) och om ingen interferens observeras (cytotoxicitet, löslighet: se punkt 18 eller färg: se punkt 19, oberoende av de icke-cytotoxiska koncentrationer vid vilka interferensen detekteras). I alla övriga fall: när SI-värdet för CD86 är högre än eller lika med 150 % och/eller interferens observeras, anses det enskilda resultatet för en U-SENS™-testomgång vara positivt (nedan kallat P). En U-SENS™-prediktion anses vara NEGATIV om åtminstone två oberoende testomgångar är negativa (N) (se figur 1). Om de första två testomgångarna båda är negativa (N) anses U-SENS™-prediktionen vara NEGATIV och någon tredje testomgång behöver inte utföras. En U-SENS™-prediktion anses vara POSITIV om åtminstone två oberoende testomgångar är positiva (P) (se figur 1). Om de första två testomgångarna båda är positiva (P) anses U-SENS™-prediktionen vara POSITIV och någon tredje testomgång behöver inte utföras. Eftersom något dosfinnande test inte utförs gäller ett undantag om SI-värdet för CD86 i den första testomgången är högre än eller lika med 150 % enbart vid den högsta icke-cytotoxiska koncentrationen. Testomgången anses då vara EJ AVGÖRANDE (NC, NOT CONCLUSIVE) och ytterligare koncentrationer (mellan den högsta icke-cytotoxiska koncentrationen och den lägsta cytotoxiska koncentrationen – se punkt 20) bör testas i ytterligare testomgångar. Om en testomgång identifieras som NC ska åtminstone två ytterligare testomgångar genomföras, samt en fjärde testomgång om testomgångarna 2 och 3 inte är samstämmiga (den ena är N och den andra är P) (se figur 1). Uppföljande testomgångar anses positiva även om endast en icke-cytotoxisk koncentration ger ett CD86-värde som är lika med eller högre än 150 %, eftersom koncentrationsvärdena har justerats för den specifika testkemikalien. Den slutliga prediktionen ska baseras på majoritetsresultatet för de tre eller fyra enskilda testomgångarna (det vill säga två av tre eller två av fyra) (se figur 1). Figur 1: Prediktionsmodell som används för U-SENS™-testet. En U-SENS™-prediktion bör beaktas inom ramen för en IATA och i enlighet med bestämmelserna i punkt 4 samt punkterna 7, 8 och 9 i Allmän inledning. N: Testomgång utan positivt CD86-resultat och utan observerad interferens. P: Testomgång med positivt CD86-resultat och/eller observerad interferens. NC: Ej avgörande. Den första testomgången räknas som Ej avgörande när CD86-resultatet endast är positivt vid den högsta icke-cytotoxiska koncentrationen. #: Ett NC-resultat (ej avgörande), vilket endast är aktuellt för den första testomgången, medför automatiskt att det krävs en tredje testomgång för att uppnå en majoritet positiva (P) eller negativa (N) resultat, det vill säga samma resultat för minst två av tre oberoende testomgångar. $: Rutorna visar de relevanta kombinationerna av resultat från de tre testomgångarna, baserat på resultaten från de första två testomgångarna i rutan ovanför. °: Rutorna visar de relevanta kombinationerna av resultat från de fyra testomgångarna, baserat på resultaten från de första tre testomgångarna i rutan ovanför.

Acceptanskriterier

22. Följande acceptanskriterier ska vara uppfyllda vid användning av U-SENS™-testet (12): I slutet av exponeringsperioden på 45 ± 3 timmar måste den genomsnittliga viabiliteten för de tre replikaten med obehandlade U937-celler vara > 90 % och ingen drift av CD86-uttrycket får observeras. Det grundläggande CD86-uttrycket för obehandlade U937-celler måste ligga inom intervallet ≥ 2 % och ≤ 25 %. När DMSO används som lösningsmedel bedöms giltigheten för DMSO-vehikelkontrollen genom beräkning av ett DMSO SI-värde som jämförs med motsvarande värde för obehandlade celler, och den genomsnittliga viabiliteten för de tre replikaten med celler måste vara > 90 %. DMSO-vehikelkontrollen är giltig om genomsnittet för de tre replikatens CD86 SI-värden är mindre än 250 % av genomsnittet för CD86 SI-värdena för de tre replikaten med obehandlade U937-celler. Testomgångarna anses giltiga om åtminstone två av tre IgG1-värden för obehandlade U937-celler hamnar inom intervallet ≥ 0,6 % och < 1,5 %. Den parallellt testade negativa kontrollen (mjölksyra) anses giltig om åtminstone två av de tre replikaten är negativa (CD86 SI < 150 %) och icke-cytotoxiska (cellviabilitet ≥ 70 %). Den positiva kontrollen (TNBS) anses giltig om åtminstone två av de tre replikaten är positiva (CD86 SI ≥ 150 %) och icke-cytotoxiska (cellviabilitet ≥ 70 %).

Testrapport

23. Testrapporten ska innehålla följande information: Testkemikalie Monokomponentämne: Kemisk identifiering, t.ex. med IUPAC- eller CAS-namn, CAS-nummer, Smiles- eller InChI-kod, strukturformel och/eller andra identifieringar. Fysikaliskt tillstånd, löslighet i komplett medium, löslighet i DMSO, molekylvikt och andra relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper, i den mån sådana uppgifter finns tillgängliga. Renhet, kemisk identitet för föroreningar i förekommande fall och när så är praktiskt möjligt. Behandling före testning, om detta är tillämpligt (t.ex. uppvärmning eller finfördelning). Testad koncentration/testade koncentrationer. Uppgifter om lagringsförhållanden och stabilitet i den mån sådana uppgifter finns tillgängliga. Motivering för valet av lösningsmedel/vehikel för varje testkemikalie. Multikomponentämne, UVCB och blandning: Karakteriseras så långt det är möjligt genom exempelvis kemisk identitet (se ovan), renhet, kvantitativ förekomst och relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper (se ovan) hos beståndsdelarna, i den mån sådana uppgifter finns tillgängliga. Fysikaliskt tillstånd, löslighet i komplett medium, löslighet i DMSO och andra relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper, i den mån sådana uppgifter finns tillgängliga. Molekylvikt eller uppskattad molekylvikt för blandningar/polymerer med kända sammansättningar eller annan information som är relevant för utförandet av undersökningen. Behandling före testning, om detta är tillämpligt (t.ex. uppvärmning eller finfördelning). Testad koncentration/testade koncentrationer. Uppgifter om lagringsförhållanden och stabilitet i den mån sådana uppgifter finns tillgängliga. Motivering för valet av lösningsmedel/vehikel för varje testkemikalie. Kontroller Positiv kontroll: Kemisk identifiering, t.ex. med IUPAC- eller CAS-namn, CAS-nummer, Smiles- eller InChI-kod, strukturformel och/eller andra identifieringar. Fysikaliskt tillstånd, löslighet i DMSO, molekylvikt och andra relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper, i den mån sådana uppgifter finns tillgängliga och när så är tillämpligt. Renhet, kemisk identitet för föroreningar i förekommande fall och när så är praktiskt möjligt. Behandling före testning, om detta är tillämpligt (t.ex. uppvärmning eller finfördelning). Testad koncentration/testade koncentrationer. Uppgifter om lagringsförhållanden och stabilitet i den mån sådana uppgifter finns tillgängliga. Hänvisning till tidigare resultat för positiv kontroll som visar på lämpliga acceptanskriterier för testomgångar, om detta är tillämpligt. Negativ kontroll och lösningsmedels-/vehikelkontroll: Kemisk identifiering, t.ex. med IUPAC- eller CAS-namn, CAS-nummer, Smiles- eller InChI-kod, strukturformel och/eller andra identifieringar. Renhet, kemisk identitet för föroreningar i förekommande fall och när så är praktiskt möjligt. Fysikaliskt tillstånd, molekylvikt och andra relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper om annat lösningsmedel/annan vehikel för kontroll än de som anges i testriktlinjen används, i den mån sådana uppgifter finns tillgängliga. Uppgifter om lagringsförhållanden och stabilitet i den mån sådana uppgifter finns tillgängliga. Motivering för valet av lösningsmedel/vehikel för varje testkemikalie. Testbetingelser Namn och adress för sponsor, testanläggning och försöksledare. Beskrivning av testet som använts. Använd cellinje samt dess lagringsförhållanden och källa (till exempel den anläggning varifrån cellerna erhölls). Använd flödescytometri (till exempel modell), inklusive använda instrumentinställningar, antikroppar och cytotoxicitetsmarkörer. Det förfarande som använts för att visa att laboratoriet är kvalificerat att utföra testet, genom test av kvalifikationsämnen, samt det förfarande som använts för att visa att testet kan reproduceras över tid, till exempel historiska kontrolldata och/eller historiska data för reaktivitetskontroller. Testets acceptanskriterier Erhållna värden för cellviabilitet och CD86 SI med lösningsmedels-/vehikelkontrollen jämfört med de godkända intervallen. Erhållna värden för cellviabilitet och SI med den positiva kontrollen jämfört med de godkända intervallen. Cellviabiliteten för alla testade koncentrationer av den testade kemikalien. Testförfarande Antal utförda testomgångar. Testkemikaliens koncentrationer, applicering och exponeringstid (vid avvikelser från rekommendationerna). Exponeringstid. Beskrivning av de utvärderings- och beslutskriterier som använts. Beskrivning av eventuella modifieringar av testförfarandet. Resultat Tabelluppställning av erhållna data, inklusive CV70 (om detta är tillämpligt), SI, cellviabilitetsvärden och EC150-värden (om detta är tillämpligt), för testkemikalien och för den positiva kontrollen i varje testomgång, samt en indikering av testkemikaliens klassificering enligt prediktionsmodellen. Beskrivning av andra relevanta observationer, i förekommande fall. Diskussion kring resultaten Diskussion kring de resultat som har erhållits med U-SENS™-testet. Beaktande av testets resultat inom ramen för en IATA, om annan relevant information finns att tillgå. Slutsatser

LITTERATUR

1 Piroird, C., Ovigne, J.M., Rousset, F., Martinozzi-Teissier, S., Gomes, C., Cotovio, J., Alépée, N. (2015). The Myeloid U937 Skin Sensitization Test (U-SENS) addresses the activation of dendritic cell event in the adverse outcome pathway for skin sensitization. Toxicol. In Vitro 29, s. 901–916.

2 EURL ECVAM (2017). The U-SENS™ test method Validation Study Report. Finns på http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam/eurl-ecvam-recommendations.

3 EC EURL ECVAM (2016). ESAC Opinion No 2016-03 on the L’Oréal-coordinated study on the transferability and reliability of the U-SENS™ test method for skin sensitisation testing. EUR 28178 EN; doi 10.2787/815737. Finns på [http://publications.jrc.ec.europa.eu/repository/handle/JRC103705].

4 EC EURL ECVAM (2017). EURL ECVAM Recommendation on the use of non-animal approaches for skin sensitisation testing. EUR 28553 EN; doi 10.2760/588955. Finns på https://ec.europa.eu/jrc/en/publication/eur-scientific-and-technical-research-reports/eurl-ecvam-recommendation-use-non-animal-approaches-skin-sensitisation-testing.

5 Steiling, W. (2016). Safety Evaluation of Cosmetic Ingredients Regarding their Skin Sensitization Potential. doi:10.3390/cosmetics3020014. Cosmetics 3, s. 14.

6 OECD (2016). Guidance Document on The Reporting of Defined Approaches and Individual Information Sources to be Used Within Integrated Approaches to Testing and Assessment (IATA) For Skin Sensitisation, Series on Testing & Assessment No 256, ENV/JM/MONO(2016)29. Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD), Paris. Finns på http://www.oecd.org/env/ehs/testing/series-testing-assessment-publications-number.htm.

7 Urbisch, D., Mehling, A., Guth, K., Ramirez, T., Honarvar, N., Kolle, S., Landsiedel, R., Jaworska, J., Kern, P.S., Gerberick, F., Natsch, A., Emter, R., Ashikaga, T., Miyazawa, M., Sakaguchi, H. (2015). Assessing skin sensitization hazard in mice and men using non-animal test methods. Regul. Toxicol. Pharmacol. 71, s. 337–351.

8 Alépée, N., Piroird, C., Aujoulat, M., Dreyfuss, S., Hoffmann, S., Hohenstein, A., Meloni, M., Nardelli, L., Gerbeix, C., Cotovio, J. (2015). Prospective multicentre study of the U-SENS test method for skin sensitization testing. Toxicol In Vitro 30, s. 373–382.

9 Reisinger, K., Hoffmann, S., Alépée, N., Ashikaga, T., Barroso, J., Elcombe, C., Gellatly, N., Galbiati, V., Gibbs, S., Groux, H., Hibatallah, J., Keller, D., Kern, P., Klaric, M., Kolle, S., Kuehnl, J., Lambrechts, N., Lindstedt, M., Millet, M., Martinozzi-Teissier, S., Natsch, A., Petersohn, D., Pike, I., Sakaguchi, H., Schepky, A., Tailhardat, M., Templier, M., van Vliet, E., Maxwell, G. (2014). Systematic evaluation of non-animal test methods for skin sensitisation safety assessment. Toxicol. In Vitro 29, s. 259–270.

10 Fabian, E., Vogel, D., Blatz, V., Ramirez, T., Kolle, S., Eltze, T., van Ravenzwaay, B., Oesch, F., Landsiedel, R. (2013). Xenobiotic metabolizin enzyme activities in cells used for testing skin sensitization in vitro. Arch. Toxicol. 87, s. 1683–1696.

11 OECD. (2018). Draft Guidance document: Good In Vitro Method Practices (GIVIMP) for the Development and Implementation of In Vitro Methods for Regulatory Use in Human Safety Assessment. Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD), Paris. Finns på http://www.oecd.org/env/ehs/testing/OECD Final Draft GIVIMP.pdf.

12 DB-ALM (2016). Protocol no 183: Myeloid U937 Skin Sensitization Test (U-SENS™), s. 33. Finns på http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/.

13 Sundström, C., Nilsson, K. (1976). Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). Int. J. Cancer 17, s. 565–577.

14 OECD (2005). Series on Testing and Assessment No. 34: Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD), Paris. Finns på http://www.oecd.org/env/ehs/testing/series-testing-assessment-publications-number.htm.

15 Förenta nationerna (FN) (2015). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS, det globalt harmoniserade systemet för klassificering och märkning av kemikalier). ST/SG/AC.10/30/Rev.6, sjätte reviderade utgåvan, New York och Genève: United Nations Publications. Finns på http://www.unece.org/fileadmin/DAM/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev06/English/ST-SG-AC10-30-Rev6e.pdf.

16 OECD (2012). Series on Testing and Assessment No 168: The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence. Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD), Paris. Finns på http://www.oecd.org/env/ehs/testing/series-testing-assessment-publications-number.htm.

17 ECETOC (2003). Technical Report No 87: Contact sensitization: Classification according to potency. European Centre for Ecotoxicology & Toxicology of Chemicals, Bryssel. Finns på https://ftp.cdc.gov/pub/Documents/OEL/06.%20Dotson/References/ECETOC_2003-TR87.pdf.

Tillägg 2.1

DEFINITIONER

Tillägg 2.2

KVALIFIKATIONSÄMNEN

Innan testet som beskrivs i detta tillägg till testmetod B.71 används rutinmässigt, bör laboratoriet styrka sin tekniska kompetens genom att korrekt erhålla den förväntade U-SENS™-prediktionen för de tio ämnen som rekommenderas i tabell 1 och genom att erhålla CV70- och EC150-värden som håller sig inom respektive referensintervall för minst åtta av de tio kvalifikationsämnena. Dessa kvalifikationsämnen har valts ut för att representera hela skalan av responser gällande risker för hudsensibilisering. Övriga urvalskriterier var att ämnena ska vara kommersiellt tillgängliga, att det ska finnas in vivo-referensdata av hög kvalitet och att det ska finnas in vitro-data av hög kvalitet genererade med U-SENS™-testet. Det finns dessutom publicerade referensdata att tillgå för U-SENS™-testet (1) (8).

1 In vivo-prediktioner gällande fara (och styrka) är baserade på LLNA-data (1) (8). In vivo-styrkan härleds med användning av de kriterier som föreslagits av ECETOC (17).

2 Baserat på historiskt observerade värden (1) (8).

3 Komplett medium: RPMI-1640-medium kompletterat med 10 % fetalt kalvserum, 2 mM L-glutamin, 100 enheter/ml penicillin och100 μg/ml streptomycin (8).

Tillägg 3

IN VITRO-TEST AVSEENDE HUDSENSIBILISERING: IL-8 LUC-TESTET

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR

1. Till skillnad från tester som analyserar uttrycket av cellytemarkörer, kvantifierar IL-8 Luc-testet förändringar i uttrycket av IL-8, som är en cytokin kopplad till aktiveringen av dendritiska celler. I den på THP-1 baserade IL-8-reporter-cellinjen (THP-G8, etablerad från den humana cellinjen THP-1 med ursprung i akut monocytisk leukemi) mäts IL-8-uttrycket efter exponering för sensibiliserande ämnen (1). Uttrycket av luciferas används sedan för att understödja uppdelningen mellan hudsensibiliserande ämnen och icke-hudsensibiliserande ämnen.

2. IL-8 Luc-testet har utvärderats i en valideringsstudie (2) som genomförts av Japanese Centre for the Validation of Alternatives Methods (JaCVAM), Ministry of Economy, Trade and Industry (METI) och Japanese Society for Alternatives to Animal Experiments (JSAAE) med efterföljande oberoende kollegial granskning (3) på uppdrag av JaCVAM och Ministry of Health, Labour and Welfare (MHLW) med stöd av International Cooperation on Alternative Test Methods (ICATM). Med beaktande av alla tillgängliga bevis och inkomna åsikter från tillsynsmyndigheter och intressenter, anses IL-8 Luc-testet vara en användbar del av en IATA för att skilja mellan hudsensibiliserande ämnen och icke-hudsensibiliserande ämnen för faroklassificering och -märkning. Exempel på användning av data från IL-8 Luc-test i kombination med annan information finns redovisade i litteraturen (4) (5) (6).

3. IL-8 Luc-testet har visat sig vara överförbart till laboratorier som har erfarenhet av cellodling och luciferasmätning. Inom och mellan laboratorier var reproducerbarheten 87,7 % respektive 87,5 % (2). Data som erhållits från valideringsstudien (2) och andra publicerade arbeten (1) (6) visar att jämfört med LLNA-tester bedömde IL-8 Luc-testet 118 av 143 kemikalier som positiva eller negativa och 25 kemikalier som oklara, och noggrannheten hos IL-8 Luc-testet i fråga om att skilja mellan hudsensibiliserande ämnen (kategori 1 enligt GHS/CLP-förordningen) och icke-hudsensibiliserande ämnen (ingen kategori enligt GHS/CLP-förordningen) uppgår till 86 % (101/118) med en sensitivitet på 96 % (92/96) och en specificitet på 41 % (9/22). Borträknat de ämnen som ligger utanför det tillämpningsområde som beskrivs nedan (punkt 5), bedömde IL-8 Luc-testet 113 av 136 kemikalier som positiva eller negativa och 23 kemikalier som oklara, och noggrannheten hos IL-8 Luc-testet uppgår då till 89 % (101/113) med en sensitivitet på 96 % (92/96) och en specificitet på 53 % (9/17). Vid användning av data från människa enligt Urbisch m.fl. (7) bedömde IL-8 Luc-testet 76 av 90 kemikalier som positiva eller negativa och 14 kemikalier som oklara, och noggrannheten uppgår till 80 % (61/76) med en sensitivitet på 93 % (54/58) och en specificitet på 39 % (7/18) Borträknat de ämnen som ligger utanför tillämpningsområdet, bedömde IL-8 Luc-testet 71 av 84 kemikalier som positiva eller negativa och 13 kemikalier som oklara, och noggrannheten uppgår till 86 % (61/71) med en sensitivitet på 93 % (54/58) och en specificitet på 54 % (7/13). Det är mer sannolikt att falska negativa prediktioner med IL-8 Luc-testet gäller kemikalier som uppvisar en låg/måttlig hudsensibiliserande styrka (underkategori 1B enligt GHS/CLP-förordningen) än kemikalier som uppvisar en hög hudsensibiliserande styrka (underkategori 1A enligt GHS/CLP-förordningen) (6). Sammantaget visar informationen att IL-8 Luc-testet har en uppgift att fylla i identifieringen av risker för hudsensibilisering. Noggrannheten som anges för IL-8 Luc-testet som ett fristående test är endast vägledande, eftersom testet bör beaktas i kombination med andra informationskällor inom ramen för en IATA och i enlighet med bestämmelserna i punkterna 7 och 8 i Allmän inledning. Vid utvärdering av tester utan djurförsök gällande hudsensibilisering bör man dessutom komma ihåg att såväl LLNA-testet som andra djurförsök eventuellt inte avspeglar situationen för människor fullt ut.

4. IL-8 Luc-testet har, baserat på de uppgifter som finns tillgängliga för närvarande, visat sig vara tillämpligt för testkemikalier som omfattar en rad olika organiska funktionella grupper, reaktionsmekanismer, hudsensibiliseringsstyrkor (vilket har fastställts i in vivo-undersökningar) och fysikalisk-kemiska egenskaper (2) (6).

5. Även om IL-8 Luc-testet använder X-VIVO™ 15 som lösningsmedel har det korrekt kunnat bedöma kemikalier med ett log Kow-värde > 3,5 och kemikalier med en löslighet i vatten på runt 100 μg/ml, enligt beräkning med EPI Suite™, och testets förmåga att detektera sensibiliserande ämnen med låg löslighet i vatten är bättre än den för IL-8 Luc-test där dimetylsulfoxid (DMSO) används som lösningsmedel (2). Testkemikalier som inte löses upp vid 20 mg/ml kan dock ge falska negativa resultat, till följd av deras oförmåga att lösas upp i X-VIVO™ 15. Av detta skäl bör negativa resultat för dessa kemikalier inte tas i beaktande. En hög andel falska negativa resultat upptäcktes för anhydrider i valideringsstudien. Dessutom kan, till följd av den begränsade metaboliska kapaciteten hos cellinjen (8) och testets betingelser, prohaptener (ämnen som kräver metabolisk aktivering) och prehaptener (ämnen som aktiveras genom oxidering i luft) ge negativa resultat i testet. Även om negativa resultat för misstänkta prehaptener/prohaptener ska tolkas med försiktighet, lyckades dock IL-8 Luc-testet korrekt bedöma 11 av 11 prehaptener, 6 av 6 prohaptener och 6 av 8 pre/pro-haptener i IL-8 Luc-testets datamängd (2). Baserat på en nyligen genomförd omfattande genomgång av tre tester utan djurförsök (DPRA, KeratinoSens™ och h-CLAT) med avseende på detektering av pre- och prohaptener (9), och med utgångspunkt i det faktum att THP-G8-cellerna som används i IL-8 Luc-testet tillhör en cellinje som härrör från THP-1 som används i h-CLAT-testet, kan IL-8 Luc-testet även bidra till att öka sensitiviteten hos tester utan djurförsök vad gäller att detektera pre- och prohaptener, i kombination med andra tester. De ytaktiva ämnen som har testats hittills gav (falska) positiva resultat, oberoende av typ (till exempel katjoniska, anjoniska eller icke-joniska). Slutligen kan kemikalier som interfererar med luciferas störa ämnets aktivitet/mätning, vilket kan orsaka skenbar inhibition eller ökad luminiscens (10). Till exempel har fytoöstrogenkoncentrationer som är högre än 1 μM rapporterats störa luminiscenssignaler i andra luciferasbaserade reportergentester till följd av överaktivering av luciferasreportergenen. Därför krävs en noggrann undersökning av luciferasuttryck som erhålls vid höga koncentrationer av fytoöstrogener eller föreningar som misstänks producera en fytoöstrogenliknande aktivering av luciferasreportergenen (11). Till följd av det ovanstående ligger ytaktiva ämnen, anhydrider och kemikalier som interfererar med luciferas utanför tillämplighetsområdet för detta test. Om det finns bevis för att IL-8 Luc-testet inte är tillämpligt för andra specifika kategorier av testkemikalier, bör det inte användas för dessa specifika kategorier.

6. Som beskrivs ovan kan IL-8 Luc-testet användas för att understödja uppdelningen mellan hudsensibiliserande ämnen och icke-hudsensibiliserande ämnen. Ytterligare arbete, företrädesvis baserat på data gällande människor, krävs för att avgöra huruvida IL-8 Luc-resultat skulle kunna bidra till bedömningar av sensibiliseringens styrka, när de beaktas i kombination med andra informationskällor.

7. Definitioner av begrepp finns i tillägg 3.1.

TESTETS PRINCIP

8. För IL-8 Luc-testet används en human cellinje med ursprung i monocytisk leukemi, THP-1, som har erhållits från American Type Culture Collection (Manassas, Virginia, Förenta staterna). Med användning av denna cellinje har avdelningen för dermatologi vid Tohoku University School of Medicine tagit fram en THP-1-deriverad IL-8-reporter-cellinje, THP-G8, som innehåller luciferasgenerna SLO (Stable Luciferase Orange) och SLR (Stable Luciferase Red) som styrs av IL-8- respektive GAPDH-promotorer (glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas) (1). Detta möjliggör kvantitativ mätning av luciferasgenens induktion genom detektering av luminiscensen från väletablerade ljusproducerande luciferassubstrat, som en indikator på IL-8- och GAPDH-promotorernas aktivitet i celler efter exponering för sensibiliserande kemikalier.

9. Testsystemet med dubbla färger baseras på ett luciferasenzym som sänder ut orangefärgat ljus (SLO, λmax = 580 nm) (12) för IL-8-promotorns genuttryck och ett luciferasenzym som sänder ut rött ljus (SLR, λmax = 630 nm) (13) för GAPDH-promotorns genuttryck (promotorn för intern kontroll). De båda luciferasenzymerna sänder ut ljus med olika färger när de reagerar med D-luciferin (firefly) och deras luminiscens mäts parallellt i en enstegsreaktion genom att ljuset från testblandningen delas upp med ett optiskt filter (14) (se tillägg 3.2).

10. THP-G8-celler behandlas under 16 timmar med testkemikalien, varefter SLO-luciferasaktiviteten (SLO-LA), som återspeglar IL-8-promotorns aktivitet, och SLR-luciferasaktiviteten (SLR-LA), som återspeglar GAPDH-promotorns aktivitet, mäts. För att göra förkortningarna enkla att förstå kallas SLO-LA och SLR-LA för IL8LA respektive GAPLA nedan. I tabell 1 finns en beskrivning av de termer som är associerade med luciferasaktiviteten i IL-8 Luc-testet. De uppmätta värdena används för att beräkna normaliserad IL8LA (nIL8LA), som är förhållandet mellan IL8LA och GAPLA, induktionen av nIL8LA (Ind-IL8LA), som är förhållandet mellan de aritmetiska medelvärdena för fyrfaldigt uppmätta nIL8LA-värden för THP-G8-celler behandlade med en testkemikalie och nIL8LA-värdena för obehandlade THP-G8-celler, samt inhiberingen av GAPLA (Inh-GAPLA), som är förhållandet mellan de aritmetiska medelvärdena för fyrfaldigt uppmätta GAPLA-värden för THP-G8-celler behandlade med en testkemikalie och GAPLA-värdena för obehandlade THP-G8-celler, som används som en indikator på cytotoxicitet. Tabell 1 Beskrivning av termer som är associerade med luciferasaktiviteten i IL-8 Luc-testet Förkortning Definition GAPLA SLR-luciferasaktivitet som återspeglar GAPDH-promotorns aktivitet IL8LA SLO-luciferasaktivitet som återspeglar IL-8-promotorns aktivitet nIL8LA IL8LA/GAPLA Ind-IL8LA nIL8LA för THP-G8-celler behandlade med kemikalier/nIL8LA för obehandlade celler Inh-GAPLA GAPLA för THP-G8-celler behandlade med kemikalier/GAPLA för obehandlade celler CV05 Den lägsta koncentration av kemikalien vid vilken Inh-GAPLA blir < 0,05

11. Prestandastandarder (PS) (15) finns tillgängliga för att underlätta valideringen av modifierade in vitro-tester avseende IL-8-luciferas som liknar IL-8 Luc-testet, och för att möjliggöra snabba ändringar av OECD:s testriktlinje 442E för att inbegripa dessa. Ömsesidigt erkännande av data (MAD) enligt OECD-avtalet garanteras endast för tester som validerats enligt prestandastandarderna och om de har granskats och inbegripits i testriktlinje 442E av OECD (16).

DEMONSTRATION AV KOMPETENS

12. Innan testet som beskrivs i detta tillägg till testmetod B.71 används rutinmässigt, bör laboratoriet styrka sin tekniska kompetens med användning av de tio kvalifikationsämnen som anges i tillägg 3.3, i enlighet med god praxis för in vitro-metoder (17). Dessutom bör användare av testet föra en historisk databas över data som erhålls genom reaktivitetskontrollerna (se punkt 15) och genom de positiva kontrollerna och lösningsmedels-/vehikelkontrollerna (se punkterna 21–24) och använda dessa data för att styrka att testets reproducerbarhet bibehålls i laboratoriet över tid.

FÖRFARANDE

13. Ett standardförfarande (SOP) för IL-8 Luc-testet finns att tillgå och bör användas när testet utförs (18). Laboratorier som vill utföra testet kan erhålla den rekombinanta THP-G8-cellinjen från GPC Lab. Co. Ltd., Tottori, Japan, efter att ha undertecknat ett avtal om materialöverföring (Material Transfer Agreement, MTA) i enlighet med OECD-mallens villkor. I de följande punkterna ges en beskrivning av de viktigaste delarna i och förfarandena för testet.

Förberedelse av celler

14. THP-G8-cellinjen från GPC Lab. Co. Ltd., Tottori, Japan, ska användas vid utförandet av IL-8 Luc-testet (se punkterna 8 och 13). När cellerna har tagits emot förökas de (två till fyra passager) och lagras frysta som en enhetlig stam. Celler från denna stam kan förökas genom maximalt tolv passager eller under maximalt sex veckor. Odlingsmediet som ska användas för förökningen är RPMI-1640-medium innehållande 10 % fetalt bovint serum (FBS), lösning med antibiotika/antimykotika (100 enheter/ml penicillin G, 100 μg/ml streptomycin och 0,25 μg/ml amfotericin B i 0,85-procentig saltlösning) (till exempel GIBCO katalognr 15240-062), 0,15 μg/ml Puromycin (till exempel CAS-nr 58-58-2) och 300 μg/ml G418 (till exempel CAS-nr 108321-42-2).

15. Innan cellerna används för testning bör de genomgå en kvalificering i form av en reaktivitetskontroll. Denna kontroll bör utföras 1–2 veckor eller 2–4 passager efter upptining med användning av den positiva kontrollen 4-nitrobensylbromid (4-NBB) (CAS-nr 100-11-8, ≥ 99 % renhet) och den negativa kontrollen mjölksyra (CAS-nr 50-21-5, ≥ 85 % renhet). 4-NBB ska ge en positiv respons för Ind-IL8LA (≥ 1,4) medan mjölksyra ska ge en negativ respons för Ind-IL8LA (< 1,4). Endast celler som har klarat reaktivitetskontrollen ska användas för testet. Kontrollen bör utföras i enlighet med de förfaranden som beskrivs i punkterna 22–24.

16. För testet sås THP-G8-celler ut med en densitet på 2 till 5 × 105 celler/ml, varefter de förodlas i odlingsflaskor under 48 till 96 timmar. På testdagen tvättas skördade celler från odlingsflaskan med RPMI-1640 innehållande 10 % FBS men utan innehåll av antibiotika och resuspenderas sedan i RPMI-1640 innehållande 10 % FBS men utan innehåll av antibiotika till densiteten 1 × 106 celler/ml. Därefter fördelas cellerna i en flatbottnad svart 96-hålsplatta (till exempel Costar katalognr 3603) med 50 μl per brunn (5 × 104 celler/brunn).

Beredning av testkemikalie och kontrollämnen

17. Testkemikalien och kontrollämnena bereds på testdagen. För IL-8 Luc-testet löses testkemikalien upp i X-VIVO™ 15, som är ett kommersiellt tillgängligt serumfritt medium (Lonza, 04-418Q), till en slutlig koncentration på 20 mg/ml. X-VIVO™ 15 tillsätts till 20 mg av testkemikalien (oavsett kemikaliens löslighet) i ett mikrocentrifugrör till en total volym på 1 ml, varefter röret roteras kraftigt och skakas i en rotor med en maximal hastighet på 8 varv per minut under 30 minuter vid en rumstemperatur på ungefär 20 °C. Om fasta kemikalier fortfarande är olösta ska röret dessutom ultraljudsbehandlas till dess att kemikalien har lösts upp helt och hållet eller är dispergerad i en stabil dispersion. För testkemikalier som är lösliga i X-VIVO™ 15 späds lösningen med en faktor 5 med X-VIVO™ 15 och används som en X-VIVO™ 15-stamlösning av testkemikalien (4 mg/ml). För testkemikalier som inte är lösliga i X-VIVO™ 15 roteras blandningen igen under minst 30 minuter och centrifugeras sedan vid 15000 varv per minut (≈ 20000 g) under 5 minuter; den resulterande supernatanten används som en X-VIVO™ 15-stamlösning av testkemikalien. För användning av andra lösningsmedel, som DMSO, vatten eller odlingsmedium, ska en vetenskaplig motivering tillhandahållas. Det detaljerade förfarandet för att lösa upp kemikalier beskrivs i tillägg 3.5. X-VIVO™ 15-lösningarna som beskrivs i punkterna 18–23 blandas 1:1 (volymförhållande) med de cellsuspensioner som beretts i en flatbottnad svart 96-hålsplatta (se punkt 16).

18. Den första testomgången syftar till att fastställa den cytotoxiska koncentrationen och att undersöka hudsensibiliseringspotentialen hos kemikalier. Med användning av X-VIVO™ 15 görs serieutspädningar av X-VIVO™ 15-stamlösningarna av testkemikalierna med en utspädningsfaktor 2 (se tillägg 3.5), och för detta används en 96-hålsplatta (till exempel Costar katalognr EW-01729-03). Därefter tillsätts 50 μl utspädd lösning per brunn till 50 μl cellsuspension i en flatbottnad svart 96-hålsplatta. För testkemikalier som är lösliga i X-VIVO™ 15 sträcker sig därför de slutliga koncentrationerna av testkemikalierna från 0,002 till 2 mg/ml (se tillägg 3.5). För testkemikalier som inte är lösliga i X-VIVO™ 15 vid 20 mg/ml fastställs endast utspädningsfaktorer som sträcker sig från 2 till 210, även om de faktiska slutliga koncentrationerna av testkemikalierna förblir osäkra och är beroende av den mättade koncentrationen av testkemikalierna i X-VIVO™ 15-stamlösningen.

19. För de efterföljande testomgångarna (det vill säga de andra, tredje och fjärde replikaten) bereds X-VIVO™ 15-stamlösningen vid en koncentration som är fyra gånger högre än koncentrationen CV05 (cellviabilitet 05, den lägsta koncentration vid vilken Inh-GAPLA blir < 0,05) i det första experimentet. Om Inh-GAPLA inte sjunker under 0,05 vid den högsta koncentrationen i den första testomgången, bereds X-VIVO™ 15-stamlösningen vid den första testomgångens högsta koncentration. Koncentrationen CV05 beräknas genom att koncentrationen hos stamlösningen i den första testomgången divideras med utspädningsfaktorn för CV05 (X) (utspädningsfaktorn för CV05 [X] är den utspädningsfaktor som krävs för att späda stamlösningen till CV05) (se tillägg 3.5). För testkemikalier som inte är lösliga i X-VIVO™ 15 vid 20 mg/ml fastställs CV05 utifrån koncentrationen hos stamlösningen × 1/X. För testomgångarna två till fyra bereds en andra stamlösning med koncentrationen 4 × CV05 (se tillägg 3.5).

20. Serieutspädningarna av denna andra X-VIVO™ 15-stamlösning görs med en utspädningsfaktor på 1,5 med användning av en 96-hålsplatta. Därefter tillsätts 50 μl utspädd lösning per brunn till 50 μl cellsuspension i brunnarna i en flatbottnad svart 96-hålsplatta. Varje koncentration av varje testkemikalie ska testas i fyra brunnar. Proverna blandas sedan med en plattskakare och inkuberas under 16 timmar vid 37 °C i en atmosfär med 5 % CO2, varefter luciferasaktiviteten mäts enligt beskrivningen nedan.

21. Lösningsmedelskontrollen är en blandning av 50 μl/brunn med X-VIVO™ 15 och 50 μl/brunn med cellsuspension i RPMI-1640 innehållande 10 % FBS.

22. Den rekommenderade positiva kontrollen är 4-NBB. 20 mg 4-NBB bereds i ett mikrocentrifugrör på 1,5 ml, till vilket X-VIVO™ 15 tillsätts till en total volym på 1 ml. Röret roteras kraftigt och skakas i en rotor med en maximal hastighet på 8 varv per minut under minst 30 minuter. Efter centrifugering vid 20000 g under fem minuter späds supernatanten med en faktor 4 med X-VIVO™ 15, varpå 500 μl av den utspädda supernatanten överförs till en brunn i en 96-hålsplatta. Den utspädda supernatanten späds ytterligare med X-VIVO™ 15 med faktorerna 2 och 4, varefter 50 μl av lösningen tillsätts till 50 μl THP-G8-cellsuspension i brunnarna på en flatbottnad svart 96-hålsplatta (se tillägg 3.6). Varje koncentration av den positiva kontrollen ska testas i fyra brunnar. Plattan skakas i en plattskakare och inkuberas i en CO2-inkubator under 16 timmar (37 °C, 5 % CO2), varefter luciferasaktiviteten mäts enligt beskrivningen i punkt 29.

23. Den rekommenderade negativa kontrollen är mjölksyra. 20 mg mjölksyra bereds i ett mikrocentrifugrör på 1,5 ml, till vilket X-VIVO™ 15 tillsätts till en total volym på 1 ml (20 mg/ml). Mjölksyralösningen på 20 mg/ml späds sedan med en faktor 5 med X-VIVO™ 15 (till 4 mg/ml), varpå 500 μl av denna mjölksyralösning på 4 mg/ml överförs till en brunn i en 96-hålsplatta. Denna lösning späds med en faktor 2 med X-VIVO™ 15 och därefter igen med en faktor 2, för att ge lösningar på 2 mg/ml och 1 mg/ml. 50 μl av dessa tre lösningar och vehikelkontrollen (X-VIVO™ 15) tillsätts till 50 μl THP-G8-cellsuspension i brunnarna på en flatbottnad svart 96-hålsplatta. Varje koncentration av den negativa kontrollen testas i fyra brunnar. Plattan skakas i en plattskakare och inkuberas i en CO2-inkubator under 16 timmar (37 °C, 5 % CO2), varefter luciferasaktiviteten mäts enligt beskrivningen i punkt 29.

24. Andra lämpliga positiva eller negativa kontroller kan användas om historiska data finns att tillgå för att härleda jämförbara acceptanskriterier.

25. Se till att flyktiga testkemikalier inte avdunstar och att det inte sker någon korskontaminering mellan testkemikalier i olika brunnar, till exempel genom att plattan förseglas innan testkemikalierna inkuberas.

26. Testkemikalierna och lösningsmedelskontrollen kräver två till fyra testomgångar för att få fram en positiv eller negativ prediktion (se tabell 2). Alla testomgångar ska utföras på olika dagar med färska X-VIVO™ 15-stamlösningar av testkemikalierna och oavhängigt skördade celler. Cellerna får dock komma från samma passage.

Mätning av luciferasaktiviteten

27. Luminiscensen mäts med användning av en luminometer för 96-hålsmikrotiterplattor som är försedd med optiska filter, till exempel Phelios (ATTO, Tokyo, Japan), Tristan 941 (Berthold, Bad Wildbad, Tyskland) eller ARVO-serien (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, Förenta staterna). Luminometern måste kalibreras inför varje test för att säkerställa reproducerbarheten (19). Rekombinanta luciferaser som avger orange- och rödfärgat ljus finns att tillgå för denna kalibrering.

28. 100 μl förvärmt Tripluc®-reagens för luciferastest (Tripluc) överförs till varje brunn i plattan som innehåller cellsuspension, oavsett om den är behandlad med kemikalien eller inte. Plattan skakas under tio minuter vid en rumstemperatur på ungefär 20 °C. Därefter placeras plattan i luminometern för mätning av luciferasaktiviteten. Bioluminiscensen mäts utan (F0) respektive med (F1) det optiska filtret, under tre sekunder vardera. Om alternativa inställningar eller metoder används, till exempel till följd av den använda luminometermodellen, ska detta motiveras.

29. Parametrar för varje koncentration beräknas utifrån de uppmätta värdena, till exempel IL8LA, GAPLA, nIL8LA, Ind-IL8LA, Inh-GAPLA, genomsnittlig ±SD (standardavvikelse) för IL8LA, genomsnittlig ±SD för GAPLA, genomsnittlig ±SD för nIL8LA, genomsnittlig ±SD för Ind-IL8LA, genomsnittlig ±SD för Inh-GAPLA och det 95-procentiga konfidensintervallet för Ind-IL8LA. Definitioner av parametrarna som används i denna punkt finns i tilläggen 3.1 och 3.4.

30. Innan mätningen startar görs vanligtvis, för reportertester med flera olika färger, en färgseparering med hjälp av detektorer (luminometer och plattavläsare) som har försetts med optiska filter, till exempel filter som blockerar korta eller långa våglängder (långpass- eller kortpassfilter) eller bandpassfilter. Transmissionskoefficienterna för filtren för varje bioluminiscens-signalfärg bör kalibreras innan testet utförs, enligt tillägg 3.2.

DATA OCH RAPPORTERING

Utvärdering av data

31. Kriterierna för en positiv/negativ bedömning är, för varje testomgång, enligt följande: En prediktion i ett IL-8 Luc-test bedöms som positiv om en testkemikalie har ett Ind-IL8LA-värde ≥ 1,4 och den nedre gränsen för det 95-procentiga konfidensintervallet för Ind-IL8LA är ≥ 1,0. En prediktion i ett IL-8 Luc-test bedöms som negativ om en testkemikalie har ett Ind-IL8LA-värde < 1,4 och/eller den nedre gränsen för det 95-procentiga konfidensintervallet för Ind-IL8LA är < 1,0.

Prediktionsmodell

32. Testkemikalier som uppvisar två positiva resultat bland testomgångarna 1, 2, 3 och 4 identifieras som positiva, medan de som uppvisar tre negativa resultat bland testomgångarna 1, 2, 3 och 4 identifieras som förmodat negativa (se tabell 2). Bland de förmodat negativa kemikalierna bedöms kemikalier som löses upp vid koncentrationen 20 mg/ml i X-VIVO™ 15 som negativa, medan kemikalier som inte löses upp vid koncentrationen 20 mg/ml i X-VIVO™ 15 inte ska tas i beaktande (se figur 1). Tabell 2 Kriterier för att identifiera positivt resultat och förmodat negativt resultat Testomgång 1 Testomgång 2 Testomgång 3 Testomgång 4 Slutlig prediktion Positivt Positivt — — Positivt Negativt Positivt — Positivt Negativt Positivt Positivt Negativt Förmodat negativt Negativt Positivt Positivt — Positivt Negativt Positivt Positivt Negativt Förmodat negativt Negativt Positivt Positivt Positivt Negativt Förmodat negativt Negativt — Förmodat negativt

Figur 1 Prediktionsmodell för slutlig bedömning

Acceptanskriterier

33. Följande acceptanskriterier ska vara uppfyllda vid användning av IL-8 Luc-testet: Ind-IL8LA ska vara högre än 5,0 för åtminstone en av koncentrationerna av den positiva kontrollen, 4-NBB, i varje testomgång. Ind-IL8LA ska vara lägre än 1,4 för varje koncentration av den negativa kontrollen, mjölksyra, i varje testomgång. Data från plattor för vilka GAPLA-värdet för kontrollbrunnar med celler och Tripluc men utan testkemikalier är mindre än 5 gånger värdet för brunnar som endast innehåller testmedium (50 μl/hål med RPMI-1640 innehållande 10 % FBS och 50 μl/brunn med X-VIVO™ 15) ska kasseras. Data från plattor för vilka Inh-GAPLA-värdet för alla koncentrationer av test- eller kontrollkemikalierna är lägre än 0,05 ska kasseras. När så är fallet ska det första testet upprepas, så att den högsta slutliga koncentrationen för det upprepade testet är den lägsta slutliga koncentrationen för det föregående testet.

Testrapport

34. Testrapporten ska innehålla följande information: Testkemikalier Monokomponentämne: Kemisk identifiering, t.ex. med IUPAC- eller CAS-namn, CAS-nummer, Smiles- eller InChI-kod, strukturformel och/eller andra identifieringar. Fysikaliskt tillstånd, vattenlöslighet, molekylvikt och andra relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper, i den mån sådana uppgifter finns tillgängliga. Renhet, kemisk identitet för föroreningar i förekommande fall och när så är praktiskt möjligt. Behandling före testning, om detta är tillämpligt (t.ex. uppvärmning eller finfördelning). Löslighet i X-VIVO™ 15. För kemikalier som är olösliga i X-VIVO™ 15, huruvida fällning eller flotation observeras efter centrifugering. Testad koncentration/testade koncentrationer. Uppgifter om lagringsförhållanden och stabilitet i den mån sådana uppgifter finns tillgängliga. Motivering för valet av lösningsmedel/vehikel för varje testkemikalie om X-VIVO™ 15 inte har använts. Multikomponentämne, UVCB och blandning: Karakteriseras så långt det är möjligt genom exempelvis kemisk identitet (se ovan), renhet, kvantitativ förekomst och relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper (se ovan) hos beståndsdelarna, i den mån sådana uppgifter finns tillgängliga. Fysikaliskt tillstånd, vattenlöslighet och andra relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper, i den mån sådana uppgifter finns tillgängliga. Molekylvikt eller uppskattad molekylvikt för blandningar/polymerer med kända sammansättningar eller annan information som är relevant för utförandet av undersökningen. Behandling före testning, om detta är tillämpligt (t.ex. uppvärmning eller finfördelning). Löslighet i X-VIVO™ 15. För kemikalier som är olösliga i X-VIVO™ 15, huruvida fällning eller flotation observeras efter centrifugering. Testad koncentration/testade koncentrationer. Uppgifter om lagringsförhållanden och stabilitet i den mån sådana uppgifter finns tillgängliga. Motivering för valet av lösningsmedel/vehikel för varje testkemikalie om X-VIVO™ 15 inte har använts. Kontroller Positiv kontroll: Kemisk identifiering, t.ex. med IUPAC- eller CAS-namn, CAS-nummer, Smiles- eller InChI-kod, strukturformel och/eller andra identifieringar. Fysikaliskt tillstånd, vattenlöslighet, molekylvikt och andra relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper, i den mån sådana uppgifter finns tillgängliga och när så är tillämpligt. Renhet, kemisk identitet för föroreningar i förekommande fall och när så är praktiskt möjligt. Behandling före testning, om detta är tillämpligt (t.ex. uppvärmning eller finfördelning). Testad koncentration/testade koncentrationer. Uppgifter om lagringsförhållanden och stabilitet i den mån sådana uppgifter finns tillgängliga. Hänvisning till tidigare resultat för positiv kontroll som visar på lämpliga acceptanskriterier, om detta är tillämpligt. Negativ kontroll: Kemisk identifiering, t.ex. med IUPAC- eller CAS-namn, CAS-nummer och/eller andra identifieringar. Renhet, kemisk identitet för föroreningar i förekommande fall och när så är praktiskt möjligt. Fysikaliskt tillstånd, molekylvikt och andra relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper om andra negativa kontroller än de som anges i testriktlinjen används och i den mån sådana uppgifter finns tillgängliga. Uppgifter om lagringsförhållanden och stabilitet i den mån sådana uppgifter finns tillgängliga. Motivering för valet av lösningsmedel för varje testkemikalie. Testbetingelser Namn och adress för sponsor, testanläggning och försöksledare. Beskrivning av testet som använts. Använd cellinje samt dess lagringsförhållanden och källa (till exempel den anläggning varifrån cellinjen erhölls). Partinummer och ursprung för FBS, namn på leverantör, partinummer för flatbottnad svart 96-hålsplatta och partinummer för Tripluc-reagens. Passageantal och celldensitet som används för testet. Cellräkningsmetod som använts för utsådden före testet, samt vidtagna åtgärder för att säkerställa en homogen fördelning av celler. Använd luminometer (till exempel modell), inklusive instrumentinställningar och använt luciferassubstrat, samt ett uppvisande av korrekta luminiscensmätningar baserat på det kontrolltest som beskrivs i tillägg 3.2. Det förfarande som använts för att visa att laboratoriet är kvalificerat att utföra testet (till exempel genom test av kvalifikationsämnen) eller för att visa att testet kan reproduceras över tid. Testförfarande Antal replikat och genomförda testomgångar. Testkemikaliens koncentrationer, appliceringsförfarande och exponeringstid (vid avvikelse från rekommendationerna). Beskrivning av de utvärderings- och beslutskriterier som använts. Beskrivning av de använda acceptanskriterierna för undersökningen. Beskrivning av eventuella modifieringar av testförfarandet. Resultat Mätresultat för IL8LA och GAPLA. Beräkningar av nIL8LA, Ind-IL8LA och Inh-GAPLA. Det 95-procentiga konfidensintervallet för Ind-IL8LA. Ett diagram som visar dos-effektkurvorna för induktionen av luciferasaktivitet samt viabilitet. Beskrivning av andra relevanta observationer, i förekommande fall. Diskussion kring resultaten Diskussion kring de resultat som har erhållits med IL-8 Luc-testet. Beaktande av testets resultat inom ramen för en IATA, om annan relevant information finns att tillgå. Slutsats

LITTERATUR

1 Takahashi T, Kimura Y, Saito R, Nakajima Y, Ohmiya Y, Yamasaki K and Aiba S. (2011). An in vitro test to screen skin sensitizers using a stable THP-1-derived IL-8 reporter cell line, THP-G8. Toxicol Sci 124:359-69.

2 OECD (2017). Validation report for the international validation study on the IL-8 Luc assay as a test evaluating the skin sensitizing potential of chemicals conducted by the IL-8 Luc Assay. Series on Testing and Assessment No 267, ENV/JM/MONO(2017)19. Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD), Paris. Finns på http://www.oecd.org/env/ehs/testing/series-testing-assessment-publications-number.htm.

3 OECD (2017). Report of the Peer Review Panel for the IL-8 Luciferase (IL-8 Luc) Assay for in vitro skin sensitisation. Series on Testing and Assessment No 258, ENV/JM/MONO(2017)20. Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD), Paris. Finns på http://www.oecd.org/env/ehs/testing/series-testing-assessment-publications-number.htm.

4 OECD (2016) Guidance Document On The Reporting Of Defined Approaches And Individual Information Sources To Be Used Within Integrated Approaches To Testing And Assessment (IATA) For Skin Sensitisation, Series on Testing & Assessment No 256, ENV/JM/MONO(2016)29. Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD), Paris. Finns på http://www.oecd.org/env/ehs/testing/series-testing-assessment-publications-number.htm.

5 van der Veen JW, Rorije E, Emter R, Natsch A, van Loveren H and Ezendam J. (2014). Evaluating the performance of integrated approaches for hazard identification of skin sensitizing chemicals. Regul Toxicol Pharmacol 69:371-9.

6 Kimura Y, Fujimura C, Ito Y, Takahashi T, Nakajima Y, Ohmiya Y and Aiba S. (2015). Optimization of the IL-8 Luc assay as an in vitro test for skin sensitization. Toxicol In Vitro 29:1816-30.

7 Urbisch D, Mehling A, Guth K, Ramirez T, Honarvar N, Kolle S, Landsiedel R, Jaworska J, Kern PS, Gerberick F m.fl. (2015). Assessing skin sensitization hazard in mice and men using non-animal test methods. Regul Toxicol Pharmacol 71:337-51.

8 Ashikaga T, Sakaguchi H, Sono S, Kosaka N, Ishikawa M, Nukada Y, Miyazawa M, Ito Y, Nishiyama N and Itagaki H. (2010). A comparative evaluation of in vitro skin sensitisation tests: the human cell-line activation test (h-CLAT) versus the local lymph node assay (LLNA). Alternatives to laboratory animals: ATLA 38:275-84.

9 Patlewicz G, Casati S, Basketter DA, Asturiol D, Roberts DW, Lepoittevin J-P, Worth A and Aschberger K (2016). Can currently available non-animal methods detect pre and pro haptens relevant for skin sensitisation? Regul Toxicol Pharmacol, 82:147-155.

10 Thorne N, Inglese J and Auld DS. (2010). Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem Biol 17:646-57.

11 OECD (2016). Test No 455: Performance-Based Test Guideline for Stably Transfected Transactivation In Vitro Assays to Detect Estrogen Receptor Agonists and Antagonists, OECD Publishing, Paris. http://dx.doi.org/10.1787/9789264265295-en.

12 Viviani V, Uchida A, Suenaga N, Ryufuku M and Ohmiya Y. (2001). Thr226 is a key residue for bioluminescence spectra determination in beetle luciferases. Biochem Biophys Res Commun 280:1286-91.

13 Viviani VR, Bechara EJ and Ohmiya Y. (1999). Cloning, sequence analysis, and expression of active Phrixothrix railroad-worms luciferases: relationship between bioluminescence spectra and primary structures. Biochemistry 38:8271-9.

14 Nakajima Y, Kimura T, Sugata K, Enomoto T, Asakawa A, Kubota H, Ikeda M and Ohmiya Y. (2005). Multicolor luciferase assay system: one-step monitoring of multiple gene expressions with a single substrate. Biotechniques 38:891-4.

15 OECD (2017). Ska publiceras – Performance Standards for the assessment of proposed similar or modified in vitro skin sensitisation IL-8 luc test methods. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment. OECD, Paris, Frankrike.

16 OECD (2005). Guidance Document the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. OECD Environment, Health and Safety publications, OECD Series on Testing and Assessment No 34. OECD, Paris, Frankrike.

17 OECD (2018). Draft Guidance document: Good In Vitro Method Practices (GIVIMP) for the Development and Implementation of In Vitro Methods for Regulatory Use in Human Safety Assessment. Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD), Paris. Finns på http://www.oecd.org/env/ehs/testing/OECD Final Draft GIVIMP.pdf.

18 JaCVAM (2016). IL-8 Luc assay protocol. Finns på http://www.jacvam.jp/en_effort/effort02.html.

19 Niwa K, Ichino Y, Kumata S, Nakajima Y, Hiraishi Y, Kato D, Viviani VR and Ohmiya Y. (2010). Quantum yields and kinetics of the firefly bioluminescence reaction of beetle luciferases. Photochem Photobiol 86:1046-9.

20 OECD (2012). The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins, Part 1: Scientific Evidence. OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 168. OECD, Paris, Frankrike.

21 Förenta nationerna (2015). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS, det globalt harmoniserade systemet för klassificering och märkning av kemikalier). Sjätte reviderade utgåvan. New York och Genève: United Nations Publications. ISBN: 978-92-1-117006-1. Finns på http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html.

Tillägg 3.1

DEFINITIONER

Tillägg 3.2

PRINCIP FÖR MÄTNING AV LUCIFERASAKTIVITET OCH FASTSTÄLLANDE AV TRANSMISSIONSKOEFFICIENTER FÖR OPTISKA FILTER FÖR SLO OCH SLR

Multireporter-testsystemet Tripluc (MultiReporter Assay System – Tripluc) kan användas med en luminometer för mikrotiterplattor som har ett flerfärgsdetektorsystem som går att förse med ett optiskt filter (till exempel Phelios AB-2350 [ATTO], ARVO [PerkinElmer] eller Tristar LB941 [Berthold]). Det optiska filter som används vid mätningen är ett lång- eller kortpassfilter på 600–620 nm eller ett bandpassfilter på 600–700 nm.

Mätning av luciferas med två färger med hjälp av ett optiskt filter

Nedan beskrivs ett exempel med användning av Phelios AB-2350 (ATTO). Denna luminometer är försedd med ett långpassfilter på 600 nm (R60 HOYA Co., 600 nm LP, filter 1) för att dela upp luminiscensen mellan SLO (λmax = 580 nm) och SLR (λmax = 630 nm).

För att fastställa transmissionskoefficienterna för långpassfiltret på 600 nm behöver man, med användning av renade SLO- och SLR-luciferasenzymer, i) mäta SLO- och SLR-bioluminiscensens intensitet utan filter (F0), ii) mäta SLO- och SLR-bioluminiscensens intensitet efter att ljuset har passerat genom långpassfiltret på 600 nm (filter 1) och iii) beräkna transmissionskoefficienterna för långpassfiltret på 600 nm för SLO och SLR, enligt instruktionerna nedan.

Transmission coefficients | Abbreviation | Definition

SLO | Filter 1 Transmission coefficients | =κOR60 | The filter’s transmission coefficient for the SLO

SLR | Filter 1 Transmission coefficients | κRR60 | The filter’s transmission coefficient for the SLR

När intensiteten för SLO och SLR i provet definieras som O respektive R beskrivs i) intensiteten hos ljuset utan filter (helt optiskt), F0, och ii) intensiteten hos ljuset som passerar genom långpassfiltret på 600 nm (filter 1), F1, enligt nedan.

F0 = O + R

F1 = κOR60 × O + κRR60 × R

Dessa formler kan även formuleras om på följande sätt:

Med användning av de beräknade transmissionsfaktorerna (κOR60 och κRR60) och de uppmätta värdena F0 och F1 går det sedan att beräkna O- och R-värdena enligt följande:

Material och metoder för att fastställa transmissionsfaktorer

1) Reagenser Enkla renade luciferasenzymer: Frystorkat renat SLO-enzym Frystorkat renat SLR-enzym (som för valideringsarbetet erhölls från GPC Lab. Co. Ltd., Tottori, Japan, med användning av THP-G8-cellinjen) Testreagens: Tripluc®-reagens för luciferastest (till exempel från TOYOBO, katalognr MRA-301) Medium: för luciferastest (30 ml, förvarat vid 2–8 °C)

Reagens | Konc. | Slutlig konc. i medium | Mängd som behövs

RPMI-1640 | — | — | 27 ml

FBS | — | 10 % | 3 ml

2) Beredning av enzymlösning: Lös upp frystorkat renat luciferasenzym i ett provrör genom att tillsätta 200 μl 10–100 mM Tris-HCl eller Hepes-HCl (pH 7,5–8,0) som har kompletterats med 10 % (vikt/volym) glycerol, dela upp enzymlösningen i alikvoter om 10 μl i engångsprovrör på 1,5 ml och förvara dem i frys vid –80 °C. Den frysta enzymlösningen kan användas i upp till sex månader. Vid användning tillsätts 1 ml medium för luciferastest (RPMI-1640 med 10 % FBS) till varje provrör som innehåller enzymlösning (utspädd enzymlösning), varpå provrören förvaras på is för att förhindra deaktivering.

3) Mätning av bioluminiscens Tina upp Tripluc®-reagens för luciferastest (Tripluc) och förvara reagensen i rumstemperatur, antingen i ett vattenbad eller på en plats där den omgivande luften har rumstemperatur. Sätt på luminometern 30 minuter innan mätningen ska börja, så att fotomultiplikatorn får tid att stabiliseras. Överför 100 μl av den utspädda enzymlösningen till en svart 96-hålsplatta (flatbottnad) (SLO-referensprov till #B1, #B2 och #B3, och SLR-referensprov till #D1, #D2 och #D3). Överför därefter 100 μl förvärmd Tripluc till var och en av brunnarna i plattan som innehåller utspädd enzymlösning, med hjälp av en pipett. Skaka plattan under 10 minuter vid rumstemperatur (ungefär 25 °C) med hjälp av en plattskakare. Avlägsna eventuella bubblor från lösningarna i brunnarna. Placera plattan i luminometern för att mäta luciferasaktiviteten. Bioluminiscensen mäts utan (F0) respektive med (F1) det optiska filtret, under tre sekunder vardera. Transmissionskoefficienten för det optiska filtret beräknas enligt följande: Transmissionskoefficient (SLO [κOR60]) = (#B1 vid F1 + #B2 vid F1 + #B3 vid F1) / (#B1 vid F0 + #B2 vid F0 + #B3 vid F0) Transmissionskoefficient (SLR [κOR60]) = (#D1 vid F1 + #D2 vid F1 + #D3 vid F1) / (#D1 vid F0 + #D2 vid F0 + #D3 vid F0) De beräknade transmissionsfaktorerna används för alla mätningar som utförs med användning av samma luminometer.

Kvalitetskontroll för utrustning

De förfaranden som beskrivs i IL-8 Luc-protokollet bör användas (18).

Tillägg 3.3

KVALIFIKATIONSÄMNEN

Innan testet som beskrivs i detta tillägg till testmetod B.71 används rutinmässigt, bör laboratoriet styrka sin tekniska kompetens genom att erhålla den förväntade IL-8 Luc-prediktionen för de nio ämnen som rekommenderas i tabell 1 och genom att erhålla värden som håller sig inom respektive referensintervall för minst åtta av de nio kvalifikationsämnena (som är utvalda för att representera hela skalan av responser gällande risker för hudsensibilisering). Övriga urvalskriterier var att ämnena ska vara kommersiellt tillgängliga, att det ska finnas in vivo-referensdata av hög kvalitet och att det ska finnas in vitro-data av hög kvalitet genererade med IL-8 Luc-testet. Det finns dessutom publicerade referensdata att tillgå för IL-8 Luc-testet (1) (6).

CV05 | IL-8 Luc MIT

1 In vivo-styrkan härleds med användning av de kriterier som föreslagits av ECETOC (19).

2 Baserat på historiskt observerade värden (1) (6).

3 CV05 och IL-8 Luc MIT har beräknats med användning av den vattenlöslighet som anges av EPI Suite™.

4 CV05: den lägsta koncentration vid vilken kemikalier uppvisar ett Inh-GAPLA-värde som är lägre än 0,05.

5 MIT: den lägsta koncentration vid vilken en kemikalie uppfyller kriteriet för positivt resultat.

Tillägg 3.4

INDEX OCH BEDÖMNINGSKRITERIER

nIL8LA (nSLO-LA)

Den j:te repetitionen (j = 1–4) för den i:te koncentrationen (i = 0–11) mäts för IL8LA (SLO-LA) respektive GAPLA (SLR-LA). Normaliserad IL8LA, som kallas för nIL8LA (nSLO-LA), definieras enligt följande:

nIL8LAij = IL8LAij/GAPLAij

Det här är den grundläggande måttenheten i detta test.

Ind-IL8LA (FInSLO-LA)

Ind-IL8LA, som är den X-faldiga ökningen av det genomsnittliga nIL8LA-värdet (nSLO-LA) för de upprepade mätningarna av den i:te koncentrationen i förhållande till motsvarande värde för nollkoncentrationen, är det primära mätvärdet i detta test. Detta förhållande skrivs med följande formel:

Ind IL8LA i 1 4 jnIL8LA ij 1 4 jnIL8LA 0j

Huvudlaboratoriet (laboratoriet som styrde valideringsarbetet) har föreslagit att ett värde på 1,4 ska motsvara ett positivt resultat för den testade kemikalien. Detta värde är baserat på det huvudlaboratoriets undersökning av historiska data. Datahanteringsgruppen har sedan använt detta värde under alla faser av valideringsstudien. Det primära resultatet, Ind-IL8LA, är förhållandet mellan två aritmetiska genomsnitt, vilket visas i formeln.

95-procentigt konfidensintervall (95 % CI)

Det 95-procentiga konfidensintervallet (95 % CI) för det nyss nämnda förhållandet kan uppskattas för att visa exaktheten i det primära resultatmåttet. Den nedre gränsen för 95 % CI ≥ 1 anger att nIL8LA-värdet med den i:te koncentrationen är betydligt högre än motsvarande värde med lösningsmedelskontroll. Det finns flera olika sätt att fastställa det 95-procentiga konfidensintervallet. Vi har använt oss av metoden som kallas Fiellers teorem i den här studien. Detta teorem för det 95-procentiga konfidensintervallet använder sig av följande formel:

B B 2 4AC 2A, B B 2 4AC 2A,

där .

A x 2 0 t 2 0.975(ν) sd 2 0 n 0

B 2 x y

C y 2 i t 2 0.975(ν) sd 2 yi n yi, and n 0 4

x 0 1 n 0 jnIL8LA 0j

sd 2 0 1 n 0 1 j nIL8LA 0j x 0 2

n yi 4

y i 1 n yi j nIL8LA ij

sd 2 yi 1 n yj 1 j nIL8LA ij y i 2

är den 97,5:e percentilen för den centrala t-fördelningen med frihetsgraden ν, där

ν sd 2 0 n 0 sd 2 yi n yi sd 2 0 n 0 2 n 0 1 sd 2 yi n yi n yi 1.

Inh-GAPLA (II-SLR-LA)

Inh-GAPLA är förhållandet mellan det genomsnittliga GAPLA-värdet (SLR-LA) för de upprepade mätningarna av den i:te koncentrationen jämfört med motsvarande värde för lösningsmedelskontrollen, vilket skrivs på följande sätt:

Inh GAPLA i 1 4 jGAPLA ij 1 4 jGAPLA 0j.

Eftersom GAPLA-värdet är nämnare vid uträkningen av nIL8LA, orsakar ett extremt litet värde en stor variation i nIL8LA-värdet. Av den anledningen kan Ind-IL8LA-värden med ett extremt litet värde för Inh-GAPLA (mindre än 0,05) anses ha en dålig precision.

Tillägg 3.5

SCHEMATISK BESKRIVNING AV DE METODER SOM ANVÄNDS FÖR ATT LÖSA UPP KEMIKALIER FÖR IL-8 LUC-TESTET

a För kemikalier som är lösliga i X-VIVOTM 15 vid koncentrationen 20 mg/ml

b För kemikalier som är olösliga i X-VIVOTM 15 vid koncentrationen 20 mg/ml

Tillägg 3.6

SCHEMATISK BESKRIVNING AV DEN METOD SOM ANVÄNDS FÖR ATT LÖSA UPP 4-NBB FÖR IL-8 LUC-TESTETS POSITIVA KONTROLL

Tillägg 1

DEFINITIONER

Kemikalie: ett ämne eller en blandning.

ELISA: enzymkopplad immunadsorberande analys (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).

Fekunditet: antal ägg.

Fertilitet: antal livskraftiga ägg/fekunditet.

Fork length (FL): längd från nosspetsen till stjärtfenans delning, används för fiskarter där det är svårt att säga var ryggraden slutar (www.fishbase.org).

Kläckbarhet: antal yngel/antal embryon placerade i en inkubator.

IACUC: Institutional Animal Care and Use Committee.

Standardlängd (SL): längd från nosspetsen till bakre änden av den sista ryggkotan eller till bakre änden av den mellersta delen av hypuralplattan. Enkelt uttryckt utesluter detta mått stjärtfenans längd. (www.fishbase.org)

Total längd (TL): längd från nosspetsen till slutet av stjärtfenans längre flik, vanligen mätt med flikarna sammanförda längs mittlinjen. Detta är ett linjärt mått, som inte följer kroppskurvan. (www.fishbase.org)

ECx (koncentration som orsakar x % effekt): den koncentration som orsakar en x-procentig effekt på testorganismerna inom en given exponeringsperiod jämfört med en kontrollgrupp. Till exempel är EC50 en koncentration som beräknas ha en effekt gällande en av testets endpoints för 50 % av en exponerad population under en fastställd exponeringsperiod.

Genomflödestest: ett test med ett kontinuerligt flöde av testlösningar genom testsystemet under exponeringens hela varaktighet.

HPG-axel: hypotalamus-hypofys-gonad-axeln.

IUPAC: Internationella kemiunionen (International Union of Pure and Applied Chemistry).

Fisktäthet: våtvikten fisk per vattenvolym.

Lägsta koncentration med observerad effekt (LOEC): den lägsta testade koncentration av en testkemikalie vid vilken man kan fastställa att testkemikalien har en statistiskt signifikant effekt (vid p < 0,05) jämfört med kontrollgruppen. Alla testkoncentrationer som är högre än LOEC bör även ha skadliga effekter som är lika stora som eller större än de effekter som observeras vid LOEC. Om dessa båda villkor inte är uppfyllda bör en fullständig förklaring ges till hur man har valt LOEC (och därmed NOEC). Närmare vägledning ges i tillägg 5 och 6.

Genomsnittlig dödlig koncentration (LC50): den koncentration av en testkemikalie som uppskattas vara dödlig för 50 % av testorganismerna under testperioden.

Nolleffektkoncentration (NOEC): den testkoncentration omedelbart under LOEC som inom en fastställd exponeringsperiod inte framkallar någon statistiskt signifikant effekt (p < 0,05) jämfört med kontrollgruppen.

Smiles: Simplified Molecular Input Line Entry Specification.

Antalstäthet: antalet fiskar per vattenvolym.

Testkemikalie: alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.

UVCB-ämnen: ämnen med okänd eller varierande sammansättning, komplexa reaktionsprodukter eller biologiska material.

VTG: vitellogenin är ett fosfolipoglykoprotein, en prekursor till ägguleprotein som normalt förekommer hos sexuellt aktiva honor inom alla äggläggande arter.

WPF (Weeks post fertilisation): veckor efter befruktning.

Tillägg 2

NÅGRA KEMISKA EGENSKAPER FÖR ETT GODTAGBART SPÄDVATTEN

Ämne | Gränsvärde för koncentration

Partiklar | 5 mg/l

Totalt organiskt kol | 2 mg/l

Icke-joniserad ammoniak | 1 μg/l

Restklor | 10 μg/l

Total mängd bekämpningsmedel som innehåller organiska fosforföreningar | 50 ng/l

Total mängd bekämpningsmedel som innehåller klororganiska föreningar plus polyklorerade bifenyler | 50 ng/l

Totalt organiskt klor | 25 ng/l

Aluminium | 1 μg/l

Arsenik | 1 μg/l

Krom | 1 μg/l

Kobolt | 1 μg/l

Koppar | 1 μg/l

Järn | 1 μg/l

Bly | 1 μg/l

Nickel | 1 μg/l

Zink | 1 μg/l

Kadmium | 100 ng/l

Kvicksilver | 100 ng/l

Silver | 100 ng/l

Tillägg 3

TESTBETINGELSER FÖR MEOGRT-TESTET

1. Rekommenderad art | Japansk risfisk (Oryzias latipes).

2. Testtyp | Kontinuerligt genomflöde.

3. Vattentemperatur | Den nominella testtemperaturen är 25 °C. Medeltemperaturen under testet i varje enskilt akvarium ska vara 24–26 °C.

4. Belysningstyp | Fluorescerande lampor (brett spektrum och ~150 lumen/m2) (~150 lux).

5. Fotoperiod | 16 timmars ljus, 8 timmars mörker.

6. Fisktäthet | F0: 2 vuxna fiskar/replikat; F1: inleds med maximalt 20 ägg (embryon)/replikat, minskas till 12 embryon/replikat vid kläckning och sedan till 2 vuxna fiskar (XX-XY-avelspar) vid 9–10 wpf för reproduktionsfasen.

7. Minsta användbara volym för testkammare | 1,8 l (till exempel en testkammare med storleken: 18 × 9 × 15 cm).

8. Volymutbyten av testlösningar | Minst 5 volymförnyelser/dygn till upp till 16 volymförnyelser/dygn (eller ett flöde på 20 ml/min).

9. Testorganismernas ålder vid testets start | F0: > 12 wpf, men det rekommenderas att åldern inte överstiger 16 wpf.

10. Antal organismer per replikat | F0: 2 fiskar (par av hane och hona); F1: maximalt 20 fiskar (ägg)/replikat (producerade från F0- och F1-avelspar).

11. Antal behandlingar | 5 testkemikaliebehandlingar plus lämplig kontrollgrupp (eller lämpliga kontrollgrupper).

12. Antal replikat per behandling | Minst 6 replikat per behandling för testkemikaliegrupper och minst 12 replikat för kontrollgruppen, liksom för kontrollgruppen med lösningsmedel om sådan används (antalet replikat fördubblas under reproduktionsfasen för F1).

13. Antal organismer per test | Minst 84 fiskar i F0 och 504 fiskar i F1. (Om kontrollgrupp med lösningsmedel används, 108 fiskar i F0 och 648 fiskar i F1.) Den räknade enheten är individer efter stadiet som gulesäcksyngel.

14. Utfodringsprogram | Fiskarna matas med saltkräfta, Artemia spp., (24 timmar gamla naupliuslarver) med fri tillgång (ad libitum), kompletterat med ett kommersiellt tillgängligt flingfoder vid behov. (Ett exempel på ett utfodringsschema för att säkerställa tillfredsställande tillväxt och utveckling, som stöd för en tillförlitlig reproduktion, finns i tillägg 5.)

15. Luftning | Ingen, såvida inte det upplösta syret närmar sig < 60 % av luftmättnadsvärdet.

16. Spädvatten | Rent ytvatten, brunnsvatten eller rekonstituerat vatten eller avklorerat kranvatten.

17. Exponeringsperiod | Huvudsakligen 19 veckor (från F0 till kläckning av F2).

18. Biologiska endpoints (primära) | Kläckbarhet (F1 och F2), överlevnad (F1, från kläckning till 4 wpf [slutet av yngelstadiet/början av juvenilstadiet], från 4 till 9 [eller 10] wpf [från början av juvenilstadiet till subadultstadiet] och från 9 till 15 wpf [från subadultstadiet till avlivning som vuxen fisk]), tillväxt (F1, längd och vikt vid 9 och 15 wpf), sekundära könskaraktärer (F1, papillära utväxter på analfenan vid 9 och 15 wpf), vitellogenin (F1, vtg-mRNA eller VTG-protein vid 15 wpf), fenotypiskt kön (F1, via histologisk undersökning av gonaderna vid 15 wpf), reproduktion (F0 och F1, fekunditet och fertilitet under 21 dygn), tid till lek (F1) och histopatologi (F1, gonader, lever och njurar vid 15 wpf).

19. Giltighetskriterier för testet | Upplöst syre ≥ 60 % av luftmättnadsvärdet, medelvattentemperatur på 24–26 °C under hela testet, framgångsrik reproduktion hos ≥ 65 % av honorna i kontrollgruppen (kontrollgrupperna), genomsnittlig daglig fekunditet på ≥ 20 ägg i kontrollgruppen (kontrollgrupperna), kläckbarhet på ≥ 80 % (i genomsnitt) i kontrollgrupperna (för såväl F1 som F2), överlevnad efter kläckning till 3 wpf på ≥ 80 % (i genomsnitt) och från 3 wpf till avslutandet av generationen på ≥ 90 % (i genomsnitt) i kontrollgrupperna (för F1), koncentrationerna av testkemikalien i lösningarna ska på ett tillfredsställande sätt hållas inom ± 20 % av de genomsnittliga uppmätta värdena.

Tillägg 4

VÄGLEDNING OM TYPISKA KONTROLLVÄRDEN

Det bör noteras att dessa kontrollvärden är baserade på ett begränsat antal valideringsstudier och att de kan komma att ändras när erfarenheten ökar.

Tillväxt

Vikt och längd mäts för alla fiskar som ingår i provtagningen vid 9 (eller 10) wpf och vid 15 wpf. När detta testprotokoll följs är den förväntade våtvikten vid 9 wpf 85–145 mg för hanar och 95–150 mg för honor. Den förväntade vikten vid 15 wpf är 250–330 mg för hanar och 280–350 mg för honor. Även om det kan finnas betydande avvikelser från dessa intervall för enskilda fiskar, tyder genomsnittliga vikter inom kontrollgruppen som ligger avsevärt utanför dessa intervall, i synnerhet om de ligger lägre, på problem med utfodringen, temperaturregleringen, vattenkvaliteten, sjukdomar eller någon kombination av dessa faktorer.

Kläckning

Andelen framgångsrikt kläckta ägg i kontrollgrupperna ligger normalt runt 90 %, men värden så pass låga som 80 % är inte ovanliga. Om andelen framgångsrikt kläckta ägg ligger under 75 % kan det tyda på otillräcklig rörelse av äggen som utvecklas eller otillräcklig omsorg vid hanteringen av äggen, till exempel att döda ägg inte avlägsnas i tid vilket leder till svampangrepp.

Överlevnad

Överlevnadstalen från kläckning och fram till 3 wpf och efter 3 wpf är normalt 90 % eller högre för kontrollgrupperna, men överlevnadstal under de tidiga levnadsstadierna som är så pass låga som 80 % för kontrollgrupperna är inte alarmerande. Överlevnadstal för kontrollgrupperna som ligger under 80 % ger dock anledning till oro och kan tyda på otillräcklig rengöring av akvarierna, vilket leder till förlust av fiskyngel genom sjukdomar eller genom kvävning till följd av låga nivåer av upplöst syre. Dödsfall kan även ske genom att fiskar skadas under rengöringen av akvariet eller genom att yngel försvinner ut genom akvariets utlopp.

Vitellogenin-genen

Även om de absoluta nivåerna av vitellogenin-genen (vtg), uttryckt som kopior/ng totalt mRNA, kan variera kraftigt mellan olika laboratorier till följd av de metoder eller den utrustning som används, ska vtg-förhållandet vara ungefär 200 gånger högre bland honorna i kontrollgruppen än bland hanarna i kontrollgruppen. Det är inte ovanligt att detta förhållande är så högt som 1000 till 2000, men om det är lägre än 200 finns det anledning till oro och det kan tyda på problem med kontaminering av prov eller med den metod och/eller de reagenser som används.

Sekundära könskaraktärer

För hanar är det normala intervallet av sekundära könskaraktärer, definierat som det totala antalet segment i fenstrålarna på analfenan med papillära utväxter, 40–80 segment vid 9–10 wpf. Vid 15 wpf bör intervallet för hanar i kontrollgruppen vara ungefär 80–120 och för honor i kontrollgruppen ska antalet vara 0. Av outredda skäl har vissa hanar i sällsynta fall inga papillära utväxter vid 9 wpf, men eftersom alla hanar i kontrollgrupperna utvecklar papillära utväxter senast vid 15 wpf beror detta sannolikt på en försenad utveckling. Om det förekommer papillära utväxter bland honorna i kontrollgruppen tyder detta på att det finns XX-hanar i populationen.

XX-hanar

Den normala bakomliggande incidensen av XX-hanar i odlingar verkar ligga runt 4 % eller lägre vid 25 °C och incidensen ökar med stigande temperatur. Åtgärder bör vidtas för att minimera andelen XX-hanar i populationen. Eftersom incidensen av XX-hanar verkar ha en genetisk komponent och därigenom är ärftlig, är övervakning av stammen och säkerställande att XX-hanar inte används för att föröka stammen ett effektivt sätt att minska incidensen av XX-hanar i populationen.

Fiskarnas lek

Fiskarnas lek i kontrollreplikaten bör övervakas dagligen innan fekunditetsbedömningen genomförs. Kontrollparen kan bedömas kvalitativt, med visuella metoder, för att styrka förekomsten av lekbeteende. Vid 12–14 wpf bör de flesta kontrollpar leka. Ett lågt antal lekande par vid denna tidpunkt tyder på potentiella problem med fiskarnas hälsa, mognad eller välbefinnande.

Fekunditet

Friska och väl utfodrade risfiskar på 12–14 wpf leker normalt dagligen och producerar mellan 15 och 50 ägg per dygn. Äggproduktionen för 16 av de rekommenderade 24 kontrollavelsparen (> 65 %) bör ligga på över 20 ägg per par och dygn och siffran kan nå så högt som 40 ägg per dygn. Ett lägre antal än 20 kan vara ett tecken på att de lekande paren är omogna, undernärda eller sjuka.

Fertilitet

Procentandelen befruktade (fertila) ägg för lekande kontrollpar ligger normalt runt 90 %, och det är inte ovanligt med värden från 95 % och uppåt. Fertilitetstal för ägg i kontrollgruppen som är lägre än 80 % ger anledning till oro och kan antingen vara ett tecken på sjuka individer eller på brister i fiskodlingens förhållanden.

Tillägg 5

EXEMPEL PÅ ETT UTFODRINGSSCHEMA

Ett exempel på ett utfodringsschema för att säkerställa tillfredsställande tillväxt och utveckling, som stöd för en tillförlitlig reproduktion, finns i tabell 1. Avvikelser från detta utfodringsschema kan vara godtagbara, men det rekommenderas att de i så fall testas och att det säkerställs att en godtagbar tillväxt och reproduktion kan observeras. För att det föreslagna utfodringsschemat ska kunna följas, måste torrvikten saltkräfta per volym med suspension av saltkräfta fastställas innan testet startar. Man kan göra detta genom att väga en definierad volym med suspension av saltkräfta som har fått torka under 24 timmar vid 60 °C i på förhand vägda skålar. För att ta hänsyn till salternas vikt i suspensionen ska en lika stor volym med samma saltlösning som används i suspensionen också torkas, vägas och därefter subtraheras från vikten av den torkade suspensionen av havskräfta. Alternativt kan saltkräftorna filtreras och sköljas med destillerat vatten före torkningen, vilket eliminerar behovet av att mäta vikten på motsvarande mängd salt. Informationen som erhålls används för att omvandla uppgifterna i tabellen från torrvikt havskräfta till den volym med suspension av havskräfta som ska utfodras per fisk. Det rekommenderas även att alikvoter av suspensionen av havskräfta vägs varje vecka för att verifiera att korrekt torrvikt havskräfta utfodras.

Tid (efter kläckning) | Havskräfta (mg torrvikt/fisk/dygn)

Dag 1 | 0,5

Dag 2 | 0,5

Dag 3 | 0,6

Dag 4 | 0,7

Dag 5 | 0,8

Dag 6 | 1,0

Dag 7 | 1,3

Dag 8 | 1,7

Dag 9 | 2,2

Dag 10 | 2,8

Dag 11 | 3,5

Dag 12 | 4,2

Dag 13 | 4,5

Dag 14 | 4,8

Dag 15 | 5,2

Dag 16–21 | 5,6

Vecka 4 | 7,7

Vecka 5 | 9,0

Vecka 6 | 11,0

Vecka 7 | 13,5

Vecka 8 till avlivning | 22,5

Tillägg 6

EXEMPEL PÅ EN INKUBATIONSKAMMARE FÖR ÄGG

Exempel A

Den här inkubatorn består av ett avdelat centrifugrör i glas, som ansluts via en hylsa i rostfritt stål och hålls på plats av centrifugrörets skruvlock. Ett litet rör av glas eller rostfritt stål tränger igenom locket och slutar nära den rundade bottnen, varigenom det försiktigt bubblar ut luft som får äggen att lyfta och minskar överföringen av saprofytiska svampinfektioner mellan äggen, samtidigt som utbytet av kemikalier mellan inkubatorn och akvariet den befinner sig i underlättas.

Exempel B

Den här inkubatorn består av en glascylinder (med 5 cm diameter och 10 cm höjd) och ett nät i rostfritt stål (0,25 φ och meshstorlek 32) som är fäst mot cylinderns botten med en PTFE-ring. Inkubatorerna hänger från lyftstången ned i akvarier och skakas vertikalt (med en amplitud på cirka 5 cm) i en lämplig cykel (ungefär en gång var fjärde sekund) för risfiskägg.

Tillägg 7

DIAGRAM ÖVER INSAMLING TILL EN GEMENSAM POOL OCH FÖRDELNING TILL REPLIKAT UNDER HELA MEOGRT-TESTET

Figur 1 Insamling till en gemensam pool och fördelning till replikat under hela MEOGRT-testet. Figuren representerar en behandlingsgrupp eller en halv kontrollgrupp. På grund av insamlingen till en gemensam pool är replikatidentiteten inte densamma under hela testet. Observera att begreppet ägg syftar på livskraftiga, befruktade ägg (motsvarande embryon).

Behandlingar och replikation

För testmetoden rekommenderas fem testkemikaliebehandlingar med användning av kemikalier av teknisk kvalitet och en negativ kontroll. Antalet replikat per behandling förblir inte konstant under hela MEOGRT-testet och antalet replikat i kontrollbehandlingen är dubbelt så stort som för någon enskild testkemikaliebehandling. För F0 har varje testkemikaliebehandling sex replikat medan den negativa kontrollbehandlingen har tolv replikat. Det avråds starkt från användning av lösningsmedel, och om ett sådant ändå används ska en motivering såväl för användningen av lösningsmedlet som för valet av lösningsmedel tas med i MEOGRT-testrapporten. Om ett lösningsmedel används krävs dessutom två typer av kontrollgrupper: a) en lösningsmedelskontroll och b) en negativ kontroll. Var och en av dessa båda kontrollgrupper ska vid varje tidpunkt i MEOGRT-tidslinjen bestå av en komplett uppsättning replikat. Under testorganismernas hela utvecklingsfas i F1-generationen (och i F2-generationen fram till kläckning) förblir denna replikatstruktur intakt. I det vuxna stadiet, när F1-avelspar bildas, ska dock antalet replikat med reproducerande par helst fördubblas per behandling; det ska således finnas upp till 12 replikatpar för varje testkemikaliebehandling och 24 replikatpar för kontrollgruppen (och ytterligare 24 replikatpar för kontrollgruppen med lösningsmedel, om sådan används). Kläckningen av embryona som har producerats av F1-paren undersöks med samma replikatstruktur som användes för embryona som producerades av F0-paren, det vill säga inledningsvis sex replikat per testkemikaliebehandling och tolv replikat i kontrollgruppen (eller kontrollgrupperna).

Tillägg 8

RÄKNING AV ANALFENANS PAPILLÄRA UTVÄXTER

Huvudsaklig utrustning och huvudsakliga reagenser

Dissektionsmikroskop (med kamera monterad om så önskas)

Fixativ (till exempel Davidsons fixativ [Bouins fixativ rekommenderades inte]), om man inte väljer att räkna från en bild

Förfarande

Efter obduktionen bör en bild tas av analfenan för att möjliggöra en enkel räkning av analfenans papillära utväxter. Även om fotografering är den rekommenderade metoden, kan analfenan även fixeras med Davidsons fixativ eller annat lämpligt fixativ under ungefär en minut. Det är viktigt att hålla analfenan platt under fixeringen så att det sedan blir enklare att räkna de papillära utväxterna. Fiskkroppen med analfenan kan förvaras i Davidsons fixativ eller annat lämpligt fixativ tills det är dags för analys. Räkna antalet ledplattor (se figur 1) med papillära utväxter som sticker fram från ledplattans bakre kant.

Figur 1 Papillära utväxter på analfenan

Tillägg 9

Detaljerad Tidslinje för Meogrt-Testet

Testveckorna 1–3 (F0)

F0-generationen, som består av lekande fiskar som har uppfyllt urvalskriterierna (se punkterna 16–20), exponeras under tre veckor så att de framväxande könscellerna och gonadvävnaderna exponeras för testkemikalien. I varje replikatakvarium ska det endast finnas ett enda avelspar (avelspar med XX-hona och XY-hane). De lagda äggen samlas in, räknas och bedöms med avseende på fertilitet (befruktning) under 21 på varandra följande dagar, med start testdag 1.

Testvecka 4 (F0 och F1)

Helst bör de befruktade och livskraftiga äggen (embryona) samlas in under en och samma dag, men finns det inte tillräckligt med embryon kan embryona samlas in under två dagar. Om insamlingen sker under två dagar ska alla embryon inom samma behandling som samlades in under den första dagen läggas samman med dem som samlades in under den andra dagen i en gemensam pool. Därefter fördelas de samlade embryona för varje behandling slumpvis till de olika replikatinkubatorerna med 20 embryon per inkubator. Eventuella dödsfall bland befruktade ägg (embryon) kontrolleras och registreras dagligen. Döda ägg tas bort från inkubatorerna (dödsfall bland befruktade ägg kan, särskilt i tidiga stadier, märkas genom en tydlig förlust av genomskinlighet och genom färgförändringar som orsakas av koagulering och/eller utfällning av protein, vilket leder till ett vitt och ogenomskinligt utseende, OECD 2010).

Anmärkning: Om någon av behandlingarna kräver en andra dag av insamling, måste alla behandlingar (inklusive kontrollgrupperna) följa detta förfarande. Om det efter den andra dagen av insamling fortfarande inte finns tillräckligt med embryon inom en behandling för att placera 20 embryon i varje inkubator, ska antalet embryon som används inom denna specifika behandling minskas till 15 embryon per inkubator. Om det inte finns tillräckligt med embryon för att placera 15 embryon i varje inkubator, ska antalet replikatinkubatorer minskas tills det finns tillräckligt med embryon för att placera 15 embryon i varje inkubator. Dessutom kan ytterligare avelspar tillföras till varje behandlingsgrupp och kontrollgrupp i F0 för öka produktionen av ägg, så att rekommendationen på 20 embryon per replikat uppnås.

På testdag 24 avlivas F0-avelsparen på ett skonsamt sätt och deras vikt och längd registreras. Vid behov kan F0-avelsparen eventuellt behållas ytterligare 1–2 dygn för att starta om F1.

Testveckorna 5–6 (F1)

Ett till två dygn innan kläckningen förväntas starta ska rörelsen av äggen i inkubatorn avbrytas eller minskas, för att påskynda kläckningen. Allteftersom embryona kläcks ska ynglen varje dag samlas i en gemensam pool utifrån behandling och sedan systematiskt fördelas till de olika replikatakvarierna för yngel inom en viss behandling, med maximalt 12 yngel per akvarium. Detta görs genom att yngel slumpvis väljs ut, varefter ett yngel i taget placeras i replikat efter replikat med slumpens hjälp; på så sätt arbetar man sig igenom den specifika behandlingens replikat till dess att alla replikat inom behandlingen har 12 yngel. Om det inte finns tillräckligt med yngel för att fylla alla replikat, ska det säkerställas att så många replikat som möjligt har 12 yngel för att starta F1-fasen.

Ägg som inte har kläckts när det har gått dubbelt så lång tid som mediandagen för kläckning i kontrollgruppen räknas som ej levnadsdugliga och kasseras. Antalet yngel registreras och kläckningens resultat (kläckbarheten) beräknas för varje replikat.

Testveckorna 7–11 (F1)

Överlevnaden hos fiskynglen kontrolleras och registreras varje dag för samtliga replikat. På testdag 43 registreras antalet överlevande fiskar i varje replikat, liksom det antal fiskyngel som ursprungligen placerades i replikatet (nominellt 12 stycken). Därigenom går det att beräkna överlevnaden i procent från kläckning till stadiet för subadult fisk.

Testvecka 12 (F1)

Under testdagarna 78–85 ska ett litet prov tas från stjärtfenan på varje enskild fisk för att fastställa det genotypiska könet för individen (det vill säga genom fenklippning). Denna information används för bildandet av avelspar.

Inom tre dygn från det att det genotypiska könet har fastställts för varje enskild fisk bildas 12 avelspar per behandling och 24 avelspar per kontrollgrupp på ett slumpvis sätt. Två XX- och två XY-fiskar från varje replikat väljs slumpvis ut och samlas sedan i en gemensam pool utifrån kön, varefter de med hjälp av slumpen väljs ut att bilda avelspar (det vill säga XX-XY-par). Minst 12 replikat per kemikaliebehandling och minst 24 replikat för kontrollgruppen bildas med ett avelspar per replikat. Om ett replikat saknar antingen två XX- eller två XY-fiskar för samlingen i en gemensam pool, ska fiskar med lämpliga könsgenotyper erhållas från andra replikat inom samma behandling.

De kvarvarande fiskarna (maximalt åtta fiskar per replikat) avlivas på ett skonsamt sätt och används för provtagning avseende de olika endpoint-värdena för subadult fisk. Dessutom sparas dmy-data (XX eller XY) för all undersökt subadult fisk, för att säkerställa att alla endpointdata kan kopplas till det genetiska könet för varje enskild fisk.

Testveckorna 13–14 (F1)

Exponeringen fortsätter medan de subadulta avelsparen utvecklas till vuxna fiskar. På testdag 98 (det vill säga dagen innan ägginsamlingen påbörjas) avlägsnas alla ägg från såväl akvarierna som honorna.

Testveckorna 15–17 (F1)

De lagda äggen samlas in dagligen under 21 dagar i följd i varje replikat och bedöms med avseende på fekunditet och fertilitet.

Testvecka 18 (repetition av testvecka 4) (F1 och F2)

På morgonen testdag 120 samlas äggen in i alla replikatakvarier. De insamlade äggen bedöms och befruktade ägg (med filamenten avlägsnade) från vart och ett av avelsparen samlas i en gemensam pool för varje behandling, varefter de systematiskt fördelas till inkubationskammare för ägg med 20 befruktade ägg per inkubator. Inkubatorerna kan placeras i separata inkubationsakvarier som har ställts i ordning för varje behandling eller i det replikatakvarium som efter kläckning kommer att innehålla de kläckta fiskynglen. Helst bör embryona samlas in under en och samma dag, men om det inte finns tillräckligt med embryon kan de samlas in under två dagar. Om insamlingen sker under två dagar ska alla embryon inom samma behandling som samlades in under den första dagen läggas samman med dem som samlades in under den andra dagen i en gemensam pool. Därefter fördelas de samlade embryona för varje behandling slumpvis till de olika replikatinkubatorerna med 20 embryon per inkubator. Anmärkning: Om någon av behandlingarna kräver en andra dag av insamling, måste alla behandlingar (inklusive kontrollgrupperna) följa detta förfarande. Om det efter den andra dagen av insamling fortfarande inte finns tillräckligt med embryon inom en behandling för att placera 20 embryon i varje inkubator, ska antalet embryon som används inom denna specifika behandling minskas till 15 embryon per inkubator. Om det inte finns tillräckligt med embryon för att placera 15 embryon i varje inkubator, ska antalet replikatinkubatorer minskas tills det finns tillräckligt med embryon för att placera 15 embryon i varje inkubator.

På testdag 121 (eller testdag 122 för att säkerställa att F2-generationen har fått en bra start) avlivas F1-avelsparen på ett skonsamt sätt och analyseras med avseende på endpoint-värdena för vuxen fisk. Vid behov kan F1-avelsparen eventuellt behållas ytterligare 1–2 dygn för att starta om F2.

Testveckorna 19–20 (F2)

Ett till två dygn innan kläckningen förväntas starta ska rörelsen av äggen i inkubatorn avbrytas eller minskas, för att påskynda kläckningen. Om testet avslutas i och med slutförandet av kläckningen av F2-generationen, ska ynglen varje dag räknas och kasseras. (Embryon som inte har kläckts efter en lång inkuberingstid, vilket definieras som dubbelt så lång tid som mediandagen för kläckning i kontrollgruppen, räknas som ej levnadsdugliga.)

Tillägg 10

STATISTISK ANALYS

De typer av biologiska data som erhålls genom MEOGRT-testet är inte unika för testet och med undantag för patologiska data har många lämpliga statistiska metoder tagits fram för att på ett korrekt sätt analysera liknande data utifrån datauppgifternas egenskaper, vilket innefattar normalitet, varianshomogenitet, huruvida studiens utformning passar för hypotestest eller regressionsanalys, parametriska respektive icke-parametriska tester etc. Generellt sett följer de statistiska analyser som föreslås rekommendationerna från OECD gällande ekotoxicitetsdata (OECD 2006) och ett flödesschema över beslutsgången vid MEOGRT-dataanalys kan hittas i figur 2.

Det förväntas att datamängderna mestadels kommer att uppvisa monotona responser. Därtill bör det övervägas huruvida ett ensidigt statistiskt test eller ett tvåsidigt statistiskt test ska användas. Såvida det inte finns en biologisk motivering för att ett ensidigt test är olämpligt, rekommenderas det att ett ensidigt test används. Samtidigt som specifika statistiska tester rekommenderas i följande avsnitt ska, om lämpligare och/eller mer kraftfulla statistiska metoder finns framtagna för tillämpning på de specifika data som genereras i MEOGRT-testet, i stället sådana statistiska tester användas så att dessa fördelar kan utnyttjas.

MEOGRT-data ska analyseras separat för varje genotypiskt kön. Det finns två strategier för att analysera data för fisk som har bytt kön (antingen XX-hanar eller XY-honor). 1) Uteslut alla data för fiskar som har bytt kön inom hela testet, utom prevalensen av könsbyten inom varje enskilt replikat. 2) Behåll data för alla fiskar som har bytt kön i datamängden och analysera data baserat på genotyp.

Histopatologiska data

Histopatologiska data rapporteras i form av allvarlighetsgrader, vilka bedöms med hjälp av en nyutvecklad statistisk metod, RSCABS (Rao-Scott Cochrane-Armitage by Slices) (Green m.fl., 2014). Anpassningen Rao-Scott bevarar information gällande testreplikationen medan metoden by Slices inkluderar den biologiska förväntan att allvarlighetsgraden tenderar att öka med ökande behandlingskoncentrationer. För varje diagnos specificerar RSCABS-resultaten vilka behandlingar som har högre prevalens för patologi än kontrollgrupperna och den tillhörande allvarlighetsnivån.

Fekunditetsdata

Analyser av fekunditetsdata sker genom ett step-down-test av typen Jonckheere-Terpstra eller Williams test för att fastställa behandlingens effekter, förutsatt att data överensstämmer med en monoton koncentrationsrespons. Med ett step-down-test görs alla jämförelser vid signifikansnivån 0,05 och utan justering för antalet gjorda jämförelser. Data förväntas överensstämma med en monoton koncentrationsrespons, men detta kan verifieras antingen genom visuell inspektion av data eller genom framtagning av linjära och kvadratiska kontraster för behandlingarnas medelvärden efter en rangordningsomvandling av data. Såvida inte den kvadratiska kontrasten är signifikant och den linjära kontrasten är icke-signifikant kan trendtestet betraktas som slutfört. I annat fall används Dunnetts test för att fastställa behandlingseffekterna, om data är normalfördelade med homogena varianser. Om dessa krav inte är uppfyllda används Dunns text med en Bonferonni-Holm-justering. Alla angivna tester utförs oberoende av eventuella övergripande F- eller Kruskal-Wallis-tester. Närmare upplysningar anges i OECD 2006.

Alternativa metoder kan användas, som en generaliserad linjär modell med Poisson-fel för äggräkning (utan omvandling), om detta kan motiveras statistiskt (Cameron och Trividi, 2013). Rådfrågning av statistikexpertis rekommenderas om en alternativ metod används.

Daglig äggräkning inom en och samma generation

För variansanalysmodellen (ANOVA-modellen) gäller att Y = Tid*Tid+Behandling + *Behandling + Tid*Behandling + *Tid*Behandling, med slumpmässiga effekter för Replikat(Generation*Behandling) och Tid*Replikat(Behandling), vilket möjliggör komponenter med ojämn varians av båda typer mellan generationer. Här syftar tid på hur ofta äggräkningen äger rum (till exempel varje dag eller varje vecka). Detta är en analys avseende upprepade mätningar, där korrelationerna mellan observationer gällande samma replikat förklarar datauppgifternas karaktär av upprepade mätningar.

Huvudeffekterna av behandling testas med hjälp av Dunnetts test (eller Dunnett-Hsus test), som tar hänsyn till antalet jämförelser. Justeringar krävs för huvudeffekten av generation eller tid, eftersom det för dessa båda faktorer inte finns någon kontrollnivå och varje par av nivåer utgör en jämförelse av möjligt intresse. För dessa båda huvudeffekter kan, om F-testet för huvudeffekten är signifikant på 0,05-nivån, de parvisa jämförelserna mellan olika nivåer av faktorn testas på 0,05-nivån utan ytterligare justering.

Modellen innefattar två- och trefaktorinteraktioner, vilket innebär att en huvudeffekt för exempelvis tid eventuellt inte är signifikant trots att tid har en signifikant påverkan på resultaten. Detta innebär att om en två- eller trefaktorinteraktion som innefattar tid är signifikant på 0,05-nivån, så kan man acceptera jämförelserna av nivåer av tid på 0,05-signifikansnivån utan ytterligare justering.

Därefter följer F-tester gällande signifikansen av behandling sett till tid, de så kallade skivorna (slices) i variansanalystabellen. Om exempelvis skivan för behandling inom F1 och tid 12 är signifikant på 0,05-nivån, kan de parvisa jämförelserna för behandling inom F1 och tid 12 accepteras på 0,05-nivå utan ytterligare justering. Liknande påståenden gäller för tester avseende tid inom F1 och behandling och för generation inom en tid och behandling.

Slutligen gäller för jämförelser som inte faller under någon av ovanstående kategorier att jämförelser ska justeras med användning av Bonferroni-Holm-justeringen för p-värden. Ytterligare information om analyser av sådana modeller kan hittas i Hocking (1985) och Hochberg och Tamhane (1987).

Alternativt registreras rådata som presenteras i testrapporten som fekunditeten (antalet ägg) per replikat för varje dygn. Replikatets genomsnitt inom dessa rådata ska då beräknas med en kvadratrotstransformation. En ensidig variansanalys för de transformerade replikatgenomsnitten ska beräknas följt av Dunnett-kontraster. Det kan även vara till hjälp att visuellt inspektera fekunditetsuppgifterna för varje behandling och/eller replikat via ett punktdiagram som visar data i förhållande till tid. På så sätt går det att göra en informell bedömning av de potentiella effekterna över tid.

Alla övriga biologiska data

De statistiska analyserna är baserade på det underliggande antagandet att med rätt val av dos blir data monotona. Följaktligen förväntas data vara monotona och de utvärderas formellt med avseende på monotonicitet med användning av linjära och kvadratiska kontraster. Om data är monotona rekommenderas ett Jonckheere-Terpstra-test för trender inom replikats medianvärden (enligt rekommendationerna i OECD 2006). Om den kvadratiska kontrasten är signifikant och den linjära kontrasten inte är det, anses data vara icke-monotona.

Om data är icke-monotona, i synnerhet om det beror på reducerad respons hos behandlingen med högst koncentration eller de båda behandlingar som har högst koncentrationer, bör det övervägas om datamängden ska censureras så att analysen utförs utan dessa behandlingar. Detta beslut måste fattas genom professionell bedömning och utifrån alla tillgängliga data, i synnerhet data som indikerar uppenbar toxicitet vid dessa behandlingsnivåer.

För vikt och längd rekommenderas inga transformationer, även om sådana då och då kan behövas. Det rekommenderas dock att man gör en logaritmisk transformation för vitellogenin-data, en kvadratrotstransformation för SSC-data (papillära utväxter på analfenan) och en arcussinus-kvadratrotstransformation för data gällande andelen kläckta ägg, överlevnaden i procent, könsfördelningen och procentandelen fertila (befruktade) ägg. Tiden till kläckning och tiden till första lektillfälle ska behandlas som tid till händelse-data, där individuella embryon som inte kläckts inom den definierade perioden eller replikat som aldrig leker behandlas som högercensurerade data. Tiden till kläckning ska beräknas utifrån mediandagen för kläckning för varje replikat. Dessa endpoints bör analyseras med användning av en proportionell riskmodell av Cox-typ med blandade effekter.

Biologiska data från prov på vuxna fiskar har en mätning per replikat, det vill säga det finns en XX-fisk och en XY-fisk per replikatakvarium. Därför rekommenderas det att en ensidig variansanalys görs på replikatgenomsnitten. Om variansanalysens förutsättningar (normalitet och varianshomogenitet, enligt bedömning utifrån residualerna från variansanalys med Shapiro-Wilks test respektive Levenes test) är uppfyllda, ska Dunnett-kontraster användas för att fastställa behandlingar som avviker från kontrollgruppen. Om å andra sidan variansanalysens förutsättningar inte är uppfyllda, ska ett Dunns test utföras för att fastställa vilka behandlingar som avviker från kontrollgruppen. Ett liknande förfarande rekommenderas för data som är i form av procentantal (fertilitet, kläckning och överlevnad).

Biologiska data från prov på subadult fisk har mellan en och åtta mätningar per replikat, vilket innebär att det kan vara ett varierande antal individer som bidrar till replikatets genomsnitt för varje genotypiskt kön. Därför rekommenderas det att en variansanalysmodell med blandade effekter används följt av Dunnett-kontraster, om förutsättningarna gällande normalitet och varianshomogenitet är uppfyllda (utifrån residualerna från variansanalysen med blandade effekter). Om de inte är uppfyllda ska ett Dunns test utföras för att fastställa vilka behandlingar som avviker från kontrollgruppen.

Figur 2 Flödesschema över de rekommenderade statistiska metoderna för analys av MEOGRT-data

LITTERATUR

1 OECD (2014). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A guidance to application (bilagor till den här publikationen finns som ett separat dokument), OECD Publishing, Paris.

2 Cameron AC and Trivedi PK (2013). Regression Analysis of Count Data, 2nd edition, Econometric Society Monograph No 53, Cambridge University Press.

3 Hocking RR (1985). The Analysis of Linear Models, Monterey, Kalifornien: Brooks/Cole.

4 Hochberg Y and Tamhane AC (1987). Multiple Comparison Procedures. John Wiley and Sons, New York.

Tillägg 1

DEFINITIONER

Tillägg 2

NÅGRA KEMISKA EGENSKAPER FÖR ETT GODTAGBART SPÄDVATTEN

Ämne | Gränsvärde för koncentration

Partiklar | 5 mg/l

Totalt organiskt kol | 2 mg/l

Icke-joniserad ammoniak | 1 μg/l

Restklor | 10 μg/l

Total mängd bekämpningsmedel som innehåller organiska fosforföreningar | 50 ng/l

Total mängd bekämpningsmedel som innehåller klororganiska föreningar plus polyklorerade bifenyler | 50 ng/l

Totalt organiskt klor | 25 ng/l

Aluminium | 1 μg/l

Arsenik | 1 μg/l

Krom | 1 μg/l

Kobolt | 1 μg/l

Koppar | 1 μg/l

Järn | 1 μg/l

Bly | 1 μg/l

Nickel | 1 μg/l

Zink | 1 μg/l

Kadmium | 100 ng/l

Kvicksilver | 100 ng/l

Silver | 100 ng/l

Tillägg 3

TESTBETINGELSER FÖR LAGDA-TESTET

1. Art som används för testet | Xenopus laevis

2. Testtyp | Kontinuerligt genomflöde

3. Vattentemperatur | Den nominella temperaturen är 21 °C. Medeltemperaturen under hela testets längd ska vara 21 ± 1 °C (skillnaderna mellan olika replikat och olika behandlingar ska inte överskrida 1,0 °C)

4. Belysningstyp | Fluorescerande lampor (brett spektrum) på 600–2000 lux (lumen/m2) vid vattenytan

5. Fotoperiod | 12 timmars ljus, 12 timmars mörker

6. Testlösningens volym och testkärl (akvarium) | 4–10 l (med ett minsta vattendjup på 10–15 cm) Akvarium i glas eller rostfritt stål

7. Volymutbyten av testlösningar | Konstant, med tanke på såväl bevarandet av de biologiska betingelserna som den kemiska exponeringen (till exempel fem byten av akvarievolymen per dygn)

8. Testorganismernas ålder vid testets start | NF-stadium (Nieuwkoop och Faber) 8–10

9. Antal organismer per replikat | 20 djur (embryon)/akvarium (replikat) vid exponeringens början och 10 djur (juvenila grodor)/akvarium (replikat) efter NF-stadium 66 och fram till exponeringens slut

10. Antal behandlingar | Minst fyra testkemikaliebehandlingar plus lämplig kontrollgrupp (eller lämpliga kontrollgrupper)

11. Antal replikat per behandling | Fyra replikat per behandling för testkemikalien och åtta replikat för kontrollgruppen (eller kontrollgrupperna)

12. Antal organismer per testkemikaliekoncentration | Minst 80 djur per behandling för testkemikalien och minst 160 djur för kontrollgruppen (eller kontrollgrupperna)

13. Spädvatten | Valfritt vatten som möjliggör normal tillväxt och normal utveckling hos Xenopus laevis (till exempel källvatten eller kolfilterrenat kranvatten)

14. Luftning | Ingen luftning krävs, men luftning av akvarierna kan behövas om nivån av upplöst syre faller under de rekommenderade gränserna och flödet av testlösning maximeras

15. Upplöst syre i testlösning | Upplöst syre: ≥ 40 % av luftmättnadsvärdet eller ≥ 3,5 mg/l

16. pH-värde för testlösning | 6,5–8,5 (skillnaderna mellan olika replikat och olika behandlingar bör inte överstiga 0,5)

17. Testlösningens hårdhet och alkalinitet | 10–250 mg CaCO3/l

18. Utfodringsprogram | (Se tillägg 4)

19. Exponeringsperiod | Från NF-stadium 8–10 och fram till tio veckor efter mediantiden för NF-stadium 62 i kontrollgruppen för vatten och/eller lösningsmedel (maximalt 17 veckor)

20. Biologiska endpoints | Dödlighet (och avvikande utseende/missbildningar), tid till NF-stadium 62 (provtagning på yngel), bedömning av sköldkörtelns histologi (provtagning på yngel), tillväxt (vikt och längd), leversomatiskt index (provtagning på juvenila grodor), genetiska/fenotypiska könsfördelningar (provtagning på juvenila grodor), histopatologisk bedömning av gonader, äggledare eller sädesledare, njure och lever (provtagning på juvenila grodor) och vitellogenin i plasma (provtagning på juvenila grodor, valfritt)

21. Giltighetskriterier för testet | Upplöst syre ska vara ≥ 40 % av luftmättnadsvärdet, den genomsnittliga vattentemperaturen ska vara 21 ± 1 °C och skillnaderna mellan olika replikat och olika behandlingar ska vara < 1,0 °C, pH-värdet för testlösningen ska ligga mellan 6,5 och 8,5, dödligheten i kontrollgruppen ska vara ≤ 20 % i varje enskilt replikat, den genomsnittliga tiden till NF-stadium 62 i kontrollgruppen ska vara ≤ 45 dygn, den genomsnittliga vikten för testorganismerna vid NF-stadium 62 och vid testets slut i kontrollgruppen och kontrollgruppen för lösningsmedel (om sådan används) ska vara 1,0 ± 0,2 g respektive 11,5 ± 3 g och bevis ska finnas tillgängliga som visar att koncentrationerna av testkemikalien i lösningarna på ett tillfredsställande sätt har hållits inom ± 20 % av de genomsnittliga uppmätta värdena.

Tillägg 4

UTFODRINGSPROGRAM

Det bör noteras att även om detta utfodringsprogram rekommenderas är alternativ tillåtna, förutsatt att testorganismerna växer och utvecklas i en lämplig takt.

Utfodring av yngel

Beredning av foder för yngel

A 1:1 (volymförhållande) startfoder för öring: alger/TetraFin® (eller motsvarande), enligt följande:

B Havskräfta:

Utfodringsschema

I tabell 1 anges typen av foder och mängden foder som ska ges under yngelstadierna av exponeringen. Djuren ska matas tre gånger per dygn måndag till fredag och en gång per dygn under helgen.

Tid (efter befruktning) | Startfoder för öring: alger/TetraFin® (eller motsvarande) | Havskräfta

Vardagar (tre gånger per dygn) | Helg (en gång per dygn) | Vardagar (två gånger per dygn) | Helg (en gång per dygn)

Dag 4–14 (i vecka 0–1) | 0,33 ml | 1,2 ml | 0,5 ml (från dag 8 till dag 15) 1 ml (från och med dag 16) | 0,5 ml (från dag 8 till dag 15) 1 ml (från och med dag 16)

Vecka 2 | 0,67 ml | 2,4 ml

Vecka 3 | 1,3 ml | 4,0 ml | 1 ml | 1 ml

Vecka 4 | 1,5 ml | 4,0 ml | 1 ml | 1 ml

Vecka 5 | 1,6 ml | 4,4 ml | 1 ml | 1 ml

Vecka 6 | 1,6 ml | 4,6 ml | 1 ml | 1 ml

Vecka 7 | 1,7 ml | 4,6 ml | 1 ml | 1 ml

Vecka 8–10 | 1,7 ml | 4,6 ml | 1 ml | 1 ml

Övergång från foder för yngel till foder för juvenila grodor

När ynglen har slutfört sin metamorfos övergår de till en foderblandning för juvenila grodor enligt beskrivningen nedan. När denna övergång sker ska fodret för yngel fasas ut i takt med att fodret för juvenila grodor fasas in. Detta kan åstadkommas genom att man proportionellt minskar fodret för yngel samtidigt som man proportionellt ökar fodret för juvenila grodor allteftersom varje grupp om fem yngel passerar NF-stadium 62 och närmar sig slutet av metamorfosen i NF-stadium 66.

Utfodring av juvenila grodor

Foder för juvenila grodor

Så snart metamorfosen är slutförd (stadium 66) ändras utfodringsprogrammet till enbart sjunkande grodfoder av god kvalitet med storleken 3/32 tum (Xenopus ExpressTM, Florida, Förenta staterna) eller motsvarande.

Beredning av krossade pelletar för övergång från yngel till juvenila grodor

Pelletar av sjunkande grodfoder körs lite snabbt i en kaffekvarn eller mixer, eller krossas med mortelstöt i en mortel, för att minska storleken på pelletarna med ungefär 1/3. Alltför lång malning eller krossning leder till att pelletarna blir pulver, vilket inte rekommenderas.

Utfodringsschema

I tabell 2 anges typen av foder och mängden foder som ska ges under stadierna för juvenila grodor och vuxna djur. Djuren ska utfodras en gång om dagen. Det bör noteras att medan djuren genomgår metamorfosen fortsätter de att få en portion havskräftor, till dess att > 95 % av djuren har slutfört metamorfosen.

Djuren ska inte utfodras den dag då testet avslutas, för att inte utfodringen ska skapa osäkerhet i viktmätningen.

Tid (veckor efter mediandagen för metamorfos) | Krossade pelletar (mg per juvenil groda) | Hela pelletar (mg per juvenil groda)

Allteftersom djuren slutför metamorfosen | 25 | 0

Vecka 0–1 | 25 | 28

Vecka 2–3 | 0 | 110

Vecka 4–5 | 0 | 165

Vecka 6–9 | 0 | 220

1 Dag 0 definieras som den dag då hCG-injiceringen görs.

3 Den första dagen i vecka 0 är mediandagen för metamorfos för djuren i kontrollgruppen.

Tillägg 5

Fastställande av Genetiskt kön (Genetisk Könsbestämning)

Metoden för genetisk könsbestämning för Xenopus laevis bygger på Yoshimoto m.fl. (2008). Detaljerade förfaranden för genotypningen kan vid behov hämtas från denna publikation. Alternativa metoder (till exempel realtids-PCR [qPCR] med hög genomströmning) kan användas om det anses lämpligt.

Primrar för Xenopus laevis

DM-W-markör

Positiv kontroll

DNA-rening

Rena DNA:t från muskel- eller hudvävnad med användning av exempelvis Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit (katalognr 69506) eller någon liknande produkt, i enlighet med produktens instruktioner. DNA kan elueras från spinnkolonnerna med användning av mindre buffertlösning för att få fram mer koncentrerade prov, om det bedöms nödvändigt för PCR-undersökningen. Observera att DNA är mycket stabilt, så se till att undvika korskontaminering som skulle kunna leda till felaktig bestämning av hanar som honor eller vice versa.

PCR

Ett provprotokoll med användning av JumpStart™ Taq från Sigma anges i tabell 1.

Tabell 1 Provprotokoll med användning av JumpStart™ Taq från Sigma

Mastermix | 1x (μl) | [Slutlig]

NFW | 11 | –

10X buffertlösning | 2,0 | –

MgCl2 (25 mM) | 2,0 | 2,5 mM

Deoxinukleosidtrifosfater (dNTP) (10 mM vardera) | 0,4 | 200 μM

Markör, framåtriktad primer (8 μM) | 0,8 | 0,3 μM

Markör, bakåtriktad primer (8 μM) | 0,8 | 0,3 μM

Kontroll, framåtriktad primer (8 μM) | 0,8 | 0,3 μM

Kontroll, bakåtriktad primer (8 μM) | 0,8 | 0,3 μM

JumpStart™ Taq | 0,4 | 0,05 enheter/μl

DNA-mall | 1,0 | ~200 pg/μl

Reaktion:

Termocykler-profil:

Agarosgel-elektrofores (3 %) (provprotokoll)

50X TAE

Tris | 24,2 g

Isättika | 5,71 ml

Na2 (EDTA)·2H2O | 3,72 g

Tillsätt vatten till 100 ml

1X TAE

H2O | 392 ml

50X TAE | 8 ml

3:1-agaros

3 delar NuSieve™ GTG™-agaros

1 del Fisher-agaros med låg elektroosmos (EEO)

Metod

1 Bered en 3-procentig gel genom att tillsätta 1,2 g agarosmix till 43 ml 1X TAE. Rotera för att lösa upp stora klumpar.

2 Kör agarosblandningen i mikrovågsugn tills den är helt upplöst (se till att den inte kokar över). Låt blandningen svalna något.

3 Tillsätt 1,0 μl etidiumbromid (10 mg/ml). Rotera kolven. Observera att etidiumbromid är mutagent, så alternativa kemikalier bör i den mån det är tekniskt möjligt användas för detta steg för att minimera hälsoriskerna för personalen.

4 Häll gelen i en form med kam. Låt svalna helt.

5 Tillsätt gel till apparaten. Täck gelen med 1X TAE.

6 Tillsätt 1 μl med 6x laddningsfärg till varje PCR-produkt på 10 μl.

7 Pipettera proverna i brunnarna.

8 Kör med konstant spänning, 160 volt, under ~20 minuter.

En bild på agarosgel som uppvisar bandmönstren för hane och hona visas i figur 1.

Figur 1: Bild på agarosgel som uppvisar bandmönstret för en hane (♂) (ett enda band vid ~203 bp: DMRT1) och för en hona (♀) (två band vid ~259 bp: DM-W och 203 bp: DMRT1).

LITTERATUR

Yoshimoto S, Okada E, Umemoto H, Tamura K, Uno Y, Nishida-Umehara C, Matsuda Y, Takamatsu N, Shiba T and Ito M. 2008. A W-linked DM-domain gene, DM-W, participates in primary ovary development in Xenopus laevis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105: 2469–2474.

1 Nukleasfritt vatten

3 I enlighet med artikel 4.1 i Europaparlamentets och rådets direktiv 2004/37/EG av den 29 april 2004 om skydd för arbetstagare mot risker vid exponering för carcinogener eller mutagena ämnen i arbetet (sjätte särdirektivet enligt artikel 16.1 i rådets direktiv 89/391/EEG) (EUT L 158, 30.4.2004, s. 50).

Tillägg 6

MÄTNING AV VITELLOGENIN

Vitellogenin (VTG) mäts med hjälp av en metod för enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) som ursprungligen utvecklades för mätning av VTG hos knölskallelöja (Parks m.fl., 1999). För närvarande finns det inga kommersiellt tillgängliga antikroppar för Xenopus laevis. Med tanke på all den information som finns om detta protein och tillgången till kostnadseffektiva kommersiella tjänster för produktion av antikroppar, är det dock rimligt att tro att laboratorier enkelt kan utveckla en ELISA för att utföra denna mätning (Olmstead m.fl., 2009). Olmstead m.fl. (2009) ger även en beskrivning av testet modifierat för mätning av VTG hos Xenopus tropicalis, enligt nedan. För metoden används en antikropp som har tagits fram avseende VTG hos Xenopus tropicalis, men det är känt att den även fungerar för VTG hos Xenopus laevis. Det bör noteras att icke-kompetitiva ELISA-metoder också kan användas och att dessa kan ha lägre detektionsgränser än den metod som beskrivs nedan.

Utrustning och reagenser

Föradsorberat serum för primär antikropp (Ab)

Blanda 1 del anti-Xenopus tropicalis VTG-serum för primär antikropp med 2 delar plasma från kontrollhane och lämna i rumstemperatur under ~75 minuter, lägg sedan blandningen på is under 30 minuter, centrifugera vid > 20000 g under 1 timme vid 4 °C, avlägsna supernatanten, dela upp i alikvoter och förvara vid –20 °C

Sekundär antikropp

Get-anti-kanin-IgG-HRP-konjugat (till exempel Bio-Rad 172-1019)

VTG-standard

Renad Xenopus laevis-VTG i koncentrationen 3,3 mg/ml

TMB (3,3',5,5'-tetrametylbenzidin) (till exempel KPL 50-76-00 eller Sigma T0440)

Normalt getserum (NGS)(till exempel Chemicon® S26, 100 ml)

EIA-mikrotiterplattor av polystyren med 96 brunnar (till exempel ICN: 76-381-04, Costar: 53590, Fisher: 07-200-35)

Hybridiseringsugn som håller 37 °C (eller en luftinkubator som snabbt hittar rätt temperatur) för plattor, vattenbad för rör

Annan normalt förekommande laboratorieutrustning och andra normalt förekommande kemikalier och material

Beredning

Coating-buffert (50 mM karbonatbuffert, pH 9,6):

10X PBS (0,1 M fosfat, 1,5 M NaCl):

Tvättbuffert (PBST):

Testbuffert:

Provtagning

Blod samlas in med ett hepariniserat mikrohematokritrör och läggs på is. Efter tre minuters centrifugering repas röret, varefter det bryts upp och plasman hälls över i mikrocentrifugrör på 0,6 ml som innehåller 0,13 enheter frystorkad aprotinin. (Dessa rör förbereds i förväg genom att lämplig mängd aprotinin tillsätts, fryses och frystorkas i en vakuumcentrifug [speed-vac] inställd på låg temperatur tills ämnet är torrt.) Förvara plasman vid –80 °C tills det är dags för analys.

Förfarande för en platta

Bestrykning (coating) av plattan

Blanda 20 μl renad VTG med 22 ml karbonatbuffert (slutlig koncentration på 3 μg/ml). Tillsätt 200 μl till varje brunn i en 96-hålsplatta. Täck plattan med självhäftande tätningsfilm och låt den inkubera vid 37 °C under två timmar (eller vid 4 °C över natten).

Blockering av plattan

Blockeringslösning bereds genom att 2 ml normalt getserum (NGS) tillsätts till 38 ml karbonatbuffert. Avlägsna coating-lösningen och skaka torrt. Tillsätt 350 μl blockeringslösning i varje brunn. Täck med självhäftande tätningsfilm och låt plattan inkubera vid 37 °C under två timmar (eller vid 4 °C över natten).

Beredning av standardlösningar

Blanda 5,8 μl renad VTG-standard med 1,5 ml testbuffert i ett engångsprovrör av borsilikatglas på 12 × 75 mm. Detta ger en koncentration på 12760 ng/ml. Gör därefter en serieutspädning genom att tillsätta 750 μl av den tidigare lösningen till 750 μl testbuffert, för att få slutliga koncentrationer på 12760, 6380, 3190, 1595, 798, 399, 199, 100, och 50 ng/ml.

Beredning av prov

Starta med en lösning av plasma i testbuffert på 1:300 (kombinera exempelvis 1 μl plasma med 299 μl testbuffert) eller 1:30. Om en större mängd VTG förväntas kan ytterligare eller mer omfattande utspädningar behövas. Försök hålla B/Bo inom standardlösningarnas intervall. För prover utan märkbara VTG-nivåer, till exempel från hanar och honor i kontrollgruppen (som alla är omogna), ska lösningen på 1:30 användas. Prover som späds ut mindre än så kan uppvisa oönskade matriseffekter.

Därtill rekommenderas det att man använder ett prov för positiv kontroll på varje platta. Detta prov hämtas från en plasmasamling som innehåller höga inducerade VTG-nivåer. Samlingen späds inledningsvis i NGS, delas upp i alikvoter och förvaras vid –80 °C. För varje platta tinas en alikvot som späds ytterligare i testbuffert och hanteras på samma sätt som ett vanligt prov i testet.

Inkubering med primär antikropp

Den primära antikroppen bereds genom att föradsorberat serum för den primära antikroppen späds i testbuffert i förhållandet 1:2000 (till exempel 8 μl i 16 ml testbuffert). Kombinera 300 μl lösning av den primära antikroppen med 300 μl av provet/standardlösningen i ett glasrör. Bo-röret bereds på ett liknande sätt med 300 μl testbuffert och 300 μl antikropp. Dessutom ska ett NSB-rör beredas med enbart 600 μl testbuffert, det vill säga utan antikropp. Täck rören med Parafilm och rotera dem försiktigt för att blanda om. Låt inkubera i vattenbad vid 37 °C under en timme.

Tvätt av plattan

Precis innan inkuberingen av den primära antikroppen är klar ska plattan tvättas. Detta görs genom att innehållet skakas ut och plattan bankas torr på absorberande papper. Fyll därefter brunnarna med 350 μl tvättlösning, töm ut lösningen och banka plattan torr. En multipipett med repetitionsfunktion eller en platt-tvätt kan komma väl till pass i detta sammanhang. Tvättsteget upprepas två gånger till, så att det sammanlagt blir tre tvättar.

Fyllande av plattan

När plattan har tvättats ska rören tas ut ur vattenbadet och roteras försiktigt. Tillsätt 200 μl från varje rör med provlösning, standardlösning, Bo och NSB till dubbla brunnar i plattan. Täck plattan med självhäftande tätningsfilm och låt den inkubera under en timme vid 37 °C.

Inkubering med sekundär antikropp

När inkuberingen i föregående steg är klar ska plattan tvättas tre gånger igen, på samma sätt som ovan. Den utspädda sekundära antikroppen bereds genom att 2,5 μl av den sekundära antikroppen blandas med 50 ml testbuffert. Tillsätt 200 μl utspädd sekundär buffertlösning till varje brunn, täta på samma sätt som ovan och inkubera under en timme vid 37 °C.

Tillsättning av substrat

När inkuberingen med den sekundära antikroppen är klar ska plattan tvättas tre gånger på samma sätt som beskrivs ovan. Tillsätt sedan 100 μl TMB-substrat i varje brunn. Låt reaktionen fortgå under 10 minuter, helst på en plats utan starkt ljus. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 100 μl 1 M fosforsyra. Detta ändrar färgen från blå till intensivt gul. Mät absorbansen vid 450 nm med en plattläsare.

Beräkning av B/Bo

Subtrahera det genomsnittliga NSB-värdet från alla mätresultat. B/Bo för varje prov och standardlösning beräknas genom att absorptionsvärdet (B) divideras med den genomsnittliga absorptionen för Bo-provet.

Erhållande av standardkurva och fastställande av okända mängder

Ta fram en standardkurva med hjälp av någon programvara för framtagning av grafer (till exempel Slidewrite™ eller Sigma Plot®) som extrapolerar kvantiteten från provets B/Bo-värde utifrån B/Bo-värdena för standardlösningar. Normalt plottas mängden på en logaritmisk skala och kurvan får en sigmoidform (S-form). Det kan dock hända att den ser linjär ut vid användning av ett smalt intervall av standardlösningar. Korrigera provmängderna utifrån utspädningsfaktorn och redovisa som mg VTG/ml plasma.

Fastställande av lägsta detektionsgränser (MDL – Minimum Detection Limits)

Ofta, i synnerhet för normala hanar, är det inte helt klart hur resultat från låga värden ska redovisas. I dessa fall bör 95-procentiga konfidensgränser användas för att fastställa om värdet ska redovisas som noll eller som något annat tal. Om provresultatet ligger inom konfidensintervallet för nollstandarden (Bo) ska resultatet redovisas som noll. Den lägsta detektionsnivån blir den lägsta standard som konsekvent avviker från nollstandarden, det vill säga de båda konfidensintervallen överlappar inte varandra. För alla provresultat som ligger inom konfidensgränsen för den lägsta detektionsnivån, eller högre, redovisas det beräknade värdet. Om ett prov hamnar mellan konfidensintervallen för nollstandarden och den lägsta detektionsnivån ska hälften av den lägsta detektionsnivån redovisas som värde för detta prov.

LITTERATUR

Olmstead AW, Korte JJ, Woodis KK, Bennett BA, Ostazeski S, Degitz SJ. 2009. Reproductive maturation of the tropical clawed frog: Xenopus tropicalis. General and Comparative Endocrinology 160: 117–123.

Parks LG, Cheek AO, Denslow ND, Heppell SA, McLachlan JA, LeBlanc GA, Sullivan CV. 1999. Fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin: purification, characterisation and quantitative immunoassay for the detection of estrogenic compounds. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology 123: 113–125.

Tillägg 7

STATISTISK ANALYS

LAGDA-testet genererar tre typer av data som kan analyseras statistiskt: 1) kvantitativa kontinuerliga data, 2) tid-till-händelse-data avseende utvecklingstakt (tid till NF-stadium 62) och 3) ordinaldata i form av allvarlighetsgrader eller utvecklingsstadier från histopatologiska bedömningar. Det rekommenderade beslutsträdet för statistisk analys för LAGDA-testet visas i figur 1. Nedan anges även vissa förklarande kommentarer som kan behövas för utförandet av den statistiska analysen av mätningarna från LAGDA-testet. Vid användning av beslutsträdet för analysen ska resultat från mätningarna av dödlighet, tillväxt (vikt och längd) och leversomatiskt index (LSI) analyseras enligt grenen Övriga endpoints.

Kontinuerliga data

Data för kontinuerliga endpoints bör först kontrolleras med avseende på monotonicitet genom rangordningsomvandling av data, tillämpning av en variansanalysmodell och jämförelse av linjära och kvadratiska kontraster. Om data är monotona bör ett step-down-trendtest av typen Jonckheere-Terpstra utföras på replikatens medianvärden varpå inga efterföljande analyser ska utföras. Ett alternativ för data som är normalfördelade med homogena varianser är step-down-testet av Williams-typ. Om data är icke-monotona (kvadratisk kontrast är signifikant och linjär är inte signifikant), bör de analyseras med användning av en variansanalysmodell med blandade effekter. Data bör därefter bedömas med avseende på normalitet (helst med användning av Shapiro-Wilk-testet eller Anderson-Darling-testet) och varianshomogenitet (helst med användning av Levenes test). Båda testerna utförs på residualerna från variansanalysmodellen med blandade effekter. Expertbedömning kan användas i stället för dessa formella tester avseende normalitet och varianshomogenitet, men de formella testerna är att föredra. Om data är normalfördelade med homogen varians är förutsättningarna för en variansanalys med blandade effekter uppfyllda och en signifikant behandlingseffekt fastställs genom Dunnetts test. När icke-normalitet eller variansheterogenitet upptäcks uppfylls inte förutsättningarna för Dunnetts test och en normaliserande och variansstabiliserande omvandling ska eftersökas. Om ingen sådan omvandling går att hitta fastställs en signifikant behandlingseffekt med Dunns test. När så är möjligt ska ett ensidigt test utföras i stället för ett tvåsidigt test, men det krävs expertbedömning för att avgöra vad som är lämpligt för en viss endpoint.

Dödlighet

Data gällande dödlighet ska analyseras för en tidsperiod som omfattar hela testet och ska uttryckas som andelen som dog i ett visst akvarium. Grodyngel som inte slutför metamorfosen inom den angivna tidsramen, grodyngel som ingår i kohorten för delprovtagning på yngel, juvenila grodor som gallras bort och alla djur som eventuellt dör till följd av fel från testutövarens sida, ska behandlas som censurerade data och inte inkluderas i nämnaren vid procentberäkningen. Innan någon statistisk analys genomförs ska dödlighetsförhållandena genomgå en arcussinus-kvadratrotstransformation. Ett alternativ är att använda step-down-testet av Cochran-Armitage-typ, eventuellt med en Rao-Scott-justering vid överdispersion.

Vikt och längd (tillväxtdata)

Hanar och honor är inte sexuellt dimorfa under metamorfosen, så tillväxtdata från delprovtagningen på yngel ska analyseras oberoende av kön. Tillväxtdata för juvenila grodor bör dock analyseras separat utifrån genetiskt kön. En log-transformation kan behövas för dessa endpoints eftersom logaritmisk normalitet inte är ovanligt för storleksdata.

Leversomatiskt index (LSI)

Levervikter ska normaliseras som en proportion av hela kroppsvikten (det vill säga LSI) och analyseras separat utifrån genetiskt kön.

Tid till NF-stadium 62

Data gällande tiden till metamorfos ska behandlas som tid-till-händelse-data, med eventuella dödsfall eller individer som inte uppnår NF-stadium 62 inom 70 dygn behandlade som höger-censurerade data (det vill säga det verkliga värdet är högre än 70 dygn, men studien avslutas efter 70 dygn innan djuren har uppnått NF-stadium 62). Mediantiden till slutförandet av metamorfosen, det vill säga NF-stadium 62, för kontrollgrupperna med spädvatten ska användas för att fastställa testets slutdatum. Mediantiden till slutförandet av metamorfosen kan fastställas genom Kaplan-Meier-skattningar (product-limit). Denna endpoint bör analyseras med användning av en proportionell riskmodell av Cox-typ med blandade effekter som tar hänsyn till studiens replikatstruktur.

Histopatologiska data (allvarlighetsgrader och utvecklingsstadier)

Testets histopatologiska data rapporteras i form av allvarlighetsgrader eller utvecklingsstadier. Ett test vid namn RSCABS (Rao-Scott Cochran-Armitage by Slices) använder ett step-down-trendtest av Cochran-Armitage-typ med Rao-Scott-justering för varje allvarlighetsnivå inom en histopatologisk respons (Green m.fl., 2014). Rao-Scott-justeringen inkluderar testutformningen med replikatkärl i testet. Metoden by Slices inkluderar den biologiska förväntan att effekternas allvarlighetsgrad tenderar att öka med ökande doser eller koncentrationer, samtidigt som de enskilda allvarlighetsgraderna bibehålls och graden av allvar hos eventuella funna effekter visas. RSCABS-metoden fastställer inte bara vilka behandlingar som statistiskt skiljer sig från kontrollgrupperna (det vill säga har en allvarligare patologi än kontrollgrupperna), utan fastställer även vid vilken allvarlighetsgrad skillnaden inträffar, vilket ger en välbehövlig kontext för analysen. Om utvecklingsstadiet för gonader och äggledare eller sädesledare ska fastställas, bör en ytterligare databearbetning utföras eftersom en förutsättning för RSCABS-metoden är att effektens allvarlighetsgrad ökar med dosen. Den observerade effekten skulle kunna vara en fördröjning eller ett påskyndande av utvecklingen. Av den anledningen bör data gällande utvecklingsstadier analyseras såsom de redovisas för att ett påskyndande av utvecklingen ska kunna detekteras, varefter de inverteras manuellt inför en andra analys för att en fördröjning av utvecklingen ska kunna detekteras.

Figur 1 Beslutsträd för statistisk analys för LAGDA-testets data

LITTERATUR

Green JW, Springer TA, Saulnier AN, Swintek J. 2014. Statistical analysis of histopathology endpoints. Environmental Toxicology and Chemistry 33, 1108–1116.

Tillägg 8

ATT TÄNKA PÅ FÖR ATT KUNNA FÖLJA OCH MINIMERA FÖREKOMSTEN AV SKOLIOS

Idiopatisk skolios, som vanligtvis visar sig som en böjd svans hos Xenopus laevis-grodyngel, kan komplicera de morfologiska och beteendemässiga observationerna gällande testpopulationer. Ansträngningar bör göras för att minimera eller eliminera förekomsten av skolios, både i stammen och under testbetingelserna. I det slutliga testet rekommenderas det att prevalensen av måttlig och svår skolios ska vara lägre än 10 %, för att öka konfidensen för att testet kan detektera behandlingsrelaterade utvecklingseffekter hos i övrigt friska grodyngel.

Vid dagliga observationer under det slutliga testet bör såväl förekomsten av skolios (räkning av antalet individer) som hur allvarlig denna skolios är registreras, i de fall då skolios förekommer. Missbildningarnas karaktär bör beskrivas med avseende på plats på kroppen (till exempel framför eller bakom anus/genitalöppningen) och krökningens riktning (till exempel åt sidan eller från rygg till buk). Hur allvarlig skoliosen är kan graderas på följande sätt:

(NR) Ej påfallande (Not Remarkable): ingen krökning.

En vetenskaplig rådgivande panel upprättad av Förenta staternas miljövårdsmyndighet EPA (FIFRA SAP 2013) har gått igenom sammanställda data rörande skolios i femton tester avseende groddjursmetamorfos med Xenopus laevis (NF-stadium 51 till 60+) och lämnat allmänna rekommendationer för hur man kan minska prevalensen av denna missbildning i testpopulationer. Dessa rekommendationer är relevanta för LAGDA-testet, även om detta test omfattar en längre utvecklingsmässig tidslinje.

Historiska lekresultat

Generellt sett ska friska, vuxna grodor av god kvalitet användas som avelspar; genom att eliminera avelspar som ger upphov till avkomma med skolios kan man minimera förekomsten av skolios över tid. I synnerhet kan en minimerad användning av vildfångat avelsbestånd vara gynnsamt. LAGDA-testets exponeringsperiod börjar med embryon i NF-stadium 8–10 och det går inte att fastställa vid testets start huruvida enskilda individer kommer att utveckla skolios. Därför bör man, förutom att följa prevalensen av skolios hos de djur som används i testet, dokumentera de historiska kullresultaten (inklusive prevalensen av skolios hos eventuella yngel som har fått utvecklas). Det kan vara värdefullt att fortsätta följa den del av varje kull som inte används i en viss studie och att redovisa dessa observationer (FIFRA SAP 2013).

Vattenkvalitet

Det är viktigt att säkerställa en fullgod vattenkvalitet, såväl för laboratoriestammen som under testet. Förutom de kriterier avseende vattenkvalitet som rutinmässigt bedöms i samband med tester av akvatisk toxicitet, kan det vara värdefullt att kontrollera och korrigera eventuella näringsbrister (till exempel brist på vitamin C, kalcium eller fosfor) eller alltför höga nivåer av selen och koppar, vilka rapporteras orsaka skolios i varierande grad hos laboratorieuppfödda Rana sp. och Xenopus sp. (Marshall m.fl., 1980, Leibovitz m.fl., 1992, Martinez m.fl., 1992, enligt rapport från FIFRA SAP 2013). Användning av ett lämpligt utfodringsprogram (se tillägg 4) och regelbunden rengöring av akvarierna förbättrar generellt vattenkvaliteten och försöksdjurens hälsa.

Foder

Specifika rekommendationer för ett utfodringsprogram som har visat sig fungera väl för LAGDA-testet anges i detalj i tillägg 4. Det rekommenderas att foderkällorna kontrolleras med avseende på biologiska gifter, herbicider och andra bekämpningsmedel som man vet kan orsaka skolios hos Xenopus laevis eller andra vattenlevande djur (Schlenk och Jenkins, 2013). Till exempel har exponering för vissa kolinesterashämmare kopplats till skolios hos fiskar (Schultz m.fl., 1985) och grodor (Bacchetta m.fl., 2008).

LITTERATUR

Bacchetta, R., P. Mantecca, M. Andrioletti, C. Vismara and G. Vailati. 2008. Axial-skeletal defects caused by carbaryl in Xenopus laevis embryos. Science of the Total Environment 392: 110–118.

Schultz, T.W., J.N. Dumont and R.G. Epler. 1985. The embryotoxic and osteolathyrogenic effects of semicarbazide. Toxicology 36: 185–198.

Leibovitz, H.E., D.D. Culley and J.P. Geaghan. 1982. Effects of vitamin C and sodium benzoate on survival, growth and skeletal deformities of intensively cultured bullfrog larvae (Rana catesbeiana) reared at two pH levels. Journal of the World Aquaculture Society 13: 322–328.

Marshall, G.A., R.L. Amborski and D.D. Culley. 1980. Calcium and pH requirements in the culture of bullfrog (Rana catesbeiana) larvae. Journal of the World Aquaculture Society 11: 445–453.

Martinez, I., R. Alvarez, I. Herraez and P. Herraez. 1992. Skeletal malformations in hatchery reared Rana perezi tadpoles. Anatomical Records 233(2): 314–320.

Schlenk, D. och Jenkins, F. 2013. Endocrine Disruptor Screening Prog (EDSP) Tier 1 Screening Assays and Battery Performance. US EPA FIFRA SAP Minutes No. 2013-03. 21–23 maj 2013. Washington, DC.

Artikel 1

Artikel 2

BILAGA

Tillägg

DEFINITIONER

Tillägg 1

DEFINITIONER

Tillägg 2

FORMLER FÖR BEDÖMNING AV CYTOTOXICITET OCH MUTANTFREKVENS

Tillägg 1

DEFINITIONER

Tillägg 2

TIDSFÖRLOPP FÖR SPERMATOGENESEN HOS DÄGGDJUR

Litteraturhänvisningar

Tillägg

DEFINITIONER

Tillägg

DEFINITIONER

Tillägg 1

DEFINITIONER

Tillägg 2

HUVUDKOMPONENTERNA I DE RHE-TESTMODELLER SOM VALIDERATS FÖR TESTNING AV HUDKORROSION

Tillägg 3

TESTMODELLERNAS PRESTANDA FÖR UNDERKATEGORISERING

PREDIKTIONSSTATISTIK FÖR SAMTLIGA KEMIKALIER

Tillägg 4

Tillägg 1

DEFINITIONER

Tillägg 2

TESTMODELLER SOM INGÅR I DENNA TESTMETOD

Tillägg 3

SPECIFIKA PROTOKOLLPARAMETRAR FÖR VARJE TESTMODELL SOM INGÅR I DENNA TESTMETOD

Tillägg 4

NYCKELPARAMETRAR OCH ACCEPTANSKRITERIER FÖR KVALIFICERING AV HPLC/UPLC-SPEKTROFOTOMETERSYSTEM FÖR MÄTNING AV MTT-FORMAZAN SOM EXTRAHERATS UR RHE-VÄVNADER

Tillägg 1

DEFINITIONER (SE ÄVEN OECD GD 150 (6))

Tillägg 2

FÖRSÖKSSCHEMA SOM VISAR STUDIENS MAXIMALA VARAKTIGHET, BASERAT PÅ EN 14-DAGARS PARNINGSPERIOD

﻿Tillägg 3

SAMMANFATTNING I TABELLFORM AV EFFEKTER PÅ REPRODUKTION/UTVECKLING

Tillägg 1

DEFINITIONER (SE ÄVEN (20) OECD GD 150)

Tillägg 2

FÖRSÖKSSCHEMA SOM VISAR STUDIENS MAXIMALA VARAKTIGHET, BASERAT PÅ EN 14-DAGARS PARNINGSPERIOD

Tillägg 3

SAMMANFATTNING I TABELLFORM AV EFFEKTER PÅ REPRODUKTION/UTVECKLING

Tillägg

DEFINITIONER

Tillägg 1

DEFINITIONER OCH FÖRKORTNINGAR

Tillägg 2

STABILT TRANSFEKTERAD MÄNSKLIG ÖSTROGENRECEPTOR-Α – TRANSAKTIVERINGSANALYS FÖR DETEKTION AV ÖSTROGENAGONISTISK OCH -ANTAGONISTISK AKTIVITET HOS KEMIKALIER MED ANVÄNDNING AV CELLINJEN HERΑ-HELA-9903

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR (SE ÄVEN ALLMÄN INLEDNING)

PRINCIPER FÖR METODEN (SE ÄVEN ALLMÄN INLEDNING)

FÖRFARANDE

Cellinjer

Cellinjens stabilitet

Betingelser för cellodling och överföring till platta

Acceptanskriterier

Positiva och negativa referensstandarder för ER-agonisttest

Tabell 1 Godtagbara intervallvärden för de fyra referensstandarderna för ER-agonisttestet

Positiva och negativa referensstandarder för ER-antagonisttestet

Tabell 2 Kriterier och godtagbara intervallvärden för de två referensstandarderna för ER-antagonisttestet

Positiva kontroller och vehikelkontroller

Kvalitetskriterier för ER-agonisttest

Kvalitetskriterier för ER-antagonisttest

Vehikel

Beredning av testkemikalierna

Löslighet och cytotoxicitet: överväganden för koncentrationsintervalltest

Kemisk exponering och beredning av testplattor

Tabell 3 Exempel på fördelning av koncentrationer av referensstandarderna i testplattan i ER-agonisttestet

Tabell 4 Exempel på fördelning av koncentrationer av test- och kontrollkemikalierna i testplattan i ER-agonisttest

Tabell 5 Exempel på fördelning av koncentrationer av referensstandarderna i testplattan i ER-antagonisttest

Tabell 6 Exempel på fördelning av koncentrationer av test- och kontrollkemikalierna i testplattan i ER-antagonisttest

Luciferastest

DATAANALYS

ER-agonisttest

Överväganden i fråga om induktion av EC50, PC50 och PC10

ER-antagonisttest

Överväganden i fråga om induktion av IC30 och IC50

Tillägg 3