Kommissionens förordning (EU) nr 260/2014 av den 24 januari 2014 om ändring, för anpassning till den tekniska utvecklingen, av förordning (EG) nr 440/2008 om testmetoder enligt Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach) (Text av betydelse för EES)

EUROPEISKA KOMMISSIONEN HAR ANTAGIT DENNA FÖRORDNING

med beaktande av fördraget om Europeiska unionens funktionssätt,

med beaktande av Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 av den 18 december 2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach), inrättande av en europeisk kemikaliemyndighet, ändring av direktiv 1999/45/EG och upphävande av rådets förordning (EEG) nr 793/93 och kommissionens förordning (EG) nr 1488/94 samt rådets direktiv 76/769/EEG och kommissionens direktiv 91/155/EEG, 93/67/EEG, 93/105/EG och 2000/21/EG, särskilt artikel 13.3, och

1 I kommissionens förordning (EG) nr 440/2008 fastställs testmetoder som ska användas för tillämpning av förordning (EG) nr 1907/2006 när det gäller bestämning av ämnens fysikalisk-kemiska egenskaper, toxicitet och ekotoxicitet.

2 Det är nödvändigt att uppdatera förordning (EG) nr 440/2008 för att med prioritet införa nya och uppdaterade testmetoder som nyligen har antagits av OECD, i syfte att minska användningen av djur för försöksändamål, i enlighet med Europaparlamentets och rådets direktiv 2010/63/EU av den 22 september 2010 om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål och rådets direktiv 86/609/EEG av den 24 november 1986 om tillnärmning av medlemsstaternas lagar och andra författningar om skydd av djur som används för försök och andra vetenskapliga ändamål.

3 Anpassningen omfattar två metoder för bestämning av fysikalisk-kemiska egenskaper, varav en uppdaterad testmetod för vattenlöslighet och en ny testmetod för fördelningskoefficient som är relevant för långlivade, bioackumulerande och toxiska ämnen (PBT-ämnen); fyra nya metoder och en uppdaterad metod för bestämning av ekotoxicitet och omvandling, spridning och fördelning i miljön; nio metoder för bestämning av toxicitet och andra hälsoeffekter (inklusive fyra testmetoder för inhalationstoxicitet), varav tre uppdaterade metoder och en ny metod för att minska antalet djur som används och för att förbättra bedömningen av effekter, en uppdaterad metod för 28-dagars toxicitetstest med upprepad oral dosering som nu innefattar parametrar för bedömning av endokrin aktivitet, en uppdaterad testmetod för toxikokinetik som är viktig för utformning och förståelse av toxikologiska studier samt uppdaterade metoder för test av kronisk toxicitet, test av karcinogenicitet och kombinerat test av kronisk toxicitet och karcinogenicitet.

4 Förordning (EG) nr 440/2008 bör därför ändras i enlighet med detta.

5 De åtgärder som föreskrivs i denna förordning är förenliga med yttrandet från den kommitté som inrättats enligt artikel 133 i förordning (EG) nr 1907/2006.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

Bilagan till förordning (EG) nr 440/2008 ska ändras i enlighet med bilagan till den här förordningen.

Artikel 2

Denna förordning träder i kraft den tredje dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning.

1 EUT L 396, 30.12.2006, s. 1.

2 EUT L 142, 31.5.2008, s. 1.

3 EUT L 276, 20.10.2010, s. 33.

4 EGT L 358, 18.12.1986, s. 1.

BILAGA

Bilagan till förordning (EG) nr 440/2008 ska ändras på följande sätt:

1 Kapitel A.6 ska ersättas med följande:

2 Kapitel A.23 ska läggas till:

3 Kapitel B.2 ska ersättas med följande:

4 Kapitlen B.7 och B.8 ska ersättas med följande:

5 Kapitlen B.29 och B.30 ska ersättas med följande:

6 Kapitlen B.32 och B.33 ska ersättas med följande:

7 Kapitel B.36 ska ersättas med följande:

8 Kapitel B.52 ska läggas till:

9 Kapitel C.10 ska ersättas med följande:

10 Följande kapitel läggs till som kapitlen C.27, C.28, C.29 och C.30:

1 Denna information ges endast som information till användarna. Andra motsvarande datorprogram kan användas om man kan visa att de ger samma resultat.

2 För en rad olika mätningar i serum och plasma, särskilt för glukos, är nattlig fasta att föredra. Huvudorsaken till denna preferens är att den ökade variabilitet som oundvikligen följer av utebliven fasta skulle tendera att maskera subtilare effekter och försvåra tolkningen. Å andra sidan kan dock den nattliga fastan inkräkta på djurens allmänna metabolism och kan, särskilt under foderstudier, störa den dagliga exponeringen för testkemikalien. Om nattlig fasta används ska klinisk biokemisk bestämning utföras efter utförandet av funktionella observationer under vecka 4 i studien.

3 Eftersom en lång fasteperiod kan införa partiskhet i glukosmätningar för de behandlade djuren jämfört med kontrolldjuren, bör försöksledaren avgöra om det är lämpligt att djuren fastar. Om man använder en fasteperiod bör den vara avpassad för den art som används, för råtta kan det vara 16 timmar (fastande över natten). Bestämning av fasteglukos kan utföras efter en natts fasta under den sista exponeringsveckan, eller efter en natts fasta innan obduktionen (i det senare fallet tillsammans med alla andra kliniska patologiska parametrar).

5 Eftersom en lång fasteperiod kan införa partiskhet i glukosmätningar för de behandlade djuren jämfört med kontrolldjuren, bör försöksledaren avgöra om det är lämpligt att djuren fastar. Om man använder en fasteperiod bör den vara avpassad för den art som används, för råtta kan det vara 16 timmar (fastande över natten). Bestämning av fasteglukos kan utföras efter en natts fasta under den sista exponeringsveckan, eller efter en natts fasta innan obduktionen (i det senare fallet tillsammans med alla andra kliniska patologiska parametrar).

7 För ett antal mätningar i serum och plasma, särskilt glukos, är det önskvärt med fasta över natten. Den största orsaken till detta är att den ökade variationen som oundvikligen resulterar från icke-fastande, tenderar att maskera mer subtila effekter och göra tolkningen svår. Dock bör det noteras att fastande över natten kan påverka djurens allmänna metabolism, särskilt beträffande utfodringsstudier, och kan störa den dagliga exponeringen av testkemikalien. Samtliga djur bör bedömas i samma fysiologiska tillstånd och därför bör detaljerade eller neurologiska bedömningar planeras för annan dag än den kliniska biokemiska provtagningen.

8 Korrosivitetsbedömningen kan baseras på ett expertutlåtande på grundval av bevis såsom erfarenhet från människor eller djur, befintliga (in vitro) data, dvs. avsnitt B.40 (10), B.40 a (11) i denna bilaga eller OECD TG 435 (12), pH-värden, information från liknande kemikalier eller andra relevanta data.

9 SiO2 tillsattes för att neutralisera toxicitet.

11 Procentuell nedbrytning i FC-kärl (som innehåller referensämne).

12 Procentuell nedbrytning i FI-kärl.

Tillägg 1

Kalkylblad för beräkning av de minsta vattenvolymer som krävs för detektion av testämnen med olika log POW-värden i vattenfasen

Antaganden:

Maximal volym av enskilda alikvoter = 10 % av den totala volymen; 5 alikvoter = 50 % av den totala volymen.

Testämnens koncentration 0,7 löslighet i endera fasen. Vid lägre koncentrationer krävs större volymer.

Volym som används för bestämning av detektionsgräns = 100 ml.

log Pow som en funktion av log Sw och log Pow som en funktion av SR (Sokt/Sw) åskådliggör testämnenas förhållanden på ett rimligt sätt.

Uppskattning av Sw

log Pow | Formel | log Sw | Sw (mg/l)

4 | –0,922 log P ow 4,184 | 0,496 | 3,133E+00

4,5 | –0,922 log P ow 4,184 | 0,035 | 1,084E+00

5 | –0,922 log P ow 4,184 | –0,426 | 3,750E-01

5,5 | –0,922 log P ow 4,184 | –0,887 | 1,297E-01

6 | –0,922 log P ow 4,184 | –1,348 | 4,487E-02

6,5 | –0,922 log P ow 4,184 | –1,809 | 1,552E-02

7 | –0,922 log P ow 4,184 | –2,270 | 5,370E-03

7,5 | –0,922 log P ow 4,184 | –2,731 | 1,858E-03

8 | –0,922 log P ow 4,184 | –3,192 | 6,427E-04

Uppskattning av Soct

log Pow | Formel | Sokt (mg/l)

4 | log P ow 0,88log SR 0,41 | 3,763E+04

4,5 | log P ow 0,88log SR 0,42 | 4,816E+04

5 | log P ow 0,88log SR 0,43 | 6,165E+04

5,5 | log P ow 0,88log SR 0,44 | 7,890E+04

6 | log P ow 0,88log SR 0,45 | 1,010E+05

6,5 | log P ow 0,88log SR 0,46 | 1,293E+05

7 | log P ow 0,88log SR 0,47 | 1,654E+05

7,5 | log P ow 0,88log SR 0,48 | 2,117E+05

8 | log P ow 0,88log SR 0,49 | 2,710E+05

Testämnets totala massa (mg) | Massaoct/Massavatten | MassaH2O (mg) | KoncH2O (mg/l) | Massaoct (mg) | Koncokt (mg/l)

1319 | 526 | 2,5017 | 2,6333 | 1317 | 26333

1686 | 1664 | 1,0127 | 1,0660 | 1685 | 33709

2158 | 5263 | 0,4099 | 0,4315 | 2157 | 43149

2762 | 16644 | 0,1659 | 0,1747 | 2762 | 55230

3535 | 52632 | 0,0672 | 0,0707 | 3535 | 70691

4524 | 166436 | 0,0272 | 0,0286 | 4524 | 90480

5790 | 526316 | 0,0110 | 0,0116 | 5790 | 115807

7411 | 1664357 | 0,0045 | 0,0047 | 7411 | 148223

9486 | 5263158 | 0,0018 | 0,0019 | 9486 | 189713

Beräkning av volymer

log Kow | Detektionsgräns (mikrogram/l) | 0,001 | 0,01 | 0,10 | 1,00 | 10

4 | 0,04 | 0,38 | 3,80 | 38 | 380

4,5 | 0,09 | 0,94 | 9,38 | 94 | 938

5 | 0,23 | 2,32 | 23,18 | 232 | 2318

5,5 | 0,57 | 5,73 | 57,26 | 573 | 5726

6 | 1,41 | 14,15 | 141 | 1415 | 14146

6,5 | 3,50 | 34,95 | 350 | 3495 | 34950

7 | 8,64 | 86,35 | 864 | 8635 | 86351

7,5 | 21,33 | 213 | 2133 | 21335 | 213346

8 | 52,71 | 527 | 5271 | 52711 | 527111

Använd volym vid detektionsgränsen (I) | 0,1

Beräkningsnyckel

Utgör < 10 % av vattenfasens totala volym, 1 liters jämviktskärl.

Utgör < 10 % av vattenfasens totala volym, 2 liters jämviktskärl.

Utgör < 10 % av vattenfasens totala volym, 5 liters jämviktskärl.

Utgör < 10 % av vattenfasens totala volym, 10 liters jämviktskärl.

Överskrider 10 % även av ett 10 liters jämviktskärl.

log Pow | Sw (mg/l) | Detektionsgräns (mikrogram/l) | 0,001 | 0,01 | 0,10 | 1,00 | 10

4 | 10 | 0,01 | 0,12 | 1,19 | 11,90 | 118,99

5 | 0,02 | 0,24 | 2,38 | 23,80 | 237,97

3 | 0,04 | 0,40 | 3,97 | 39,66 | 396,62

1 | 0,12 | 1,19 | 11,90 | 118,99 | 1189,86

4,5 | 5 | 0,02 | 0,20 | 2,03 | 20,34 | 203,37

2 | 0,05 | 0,51 | 5,08 | 50,84 | 508,42

1 | 0,10 | 1,02 | 10,17 | 101,68 | 1016,83

0,5 | 0,20 | 2,03 | 20,34 | 203,37 | 2033,67

5 | 1 | 0,09 | 0,87 | 8,69 | 86,90 | 869,01

0,5 | 0,17 | 1,74 | 17,38 | 173,80 | 1738,02

0,375 | 0,23 | 2,32 | 23,18 | 231,75 | 2317,53

0,2 | 0,43 | 4,35 | 43,45 | 434,51 | 4345,05

5,5 | 0,4 | 0,19 | 1,86 | 18,57 | 185,68 | 1856,79

0,2 | 0,37 | 3,71 | 37,14 | 371,36 | 3713,59

0,1 | 0,74 | 7,43 | 74,27 | 742,72 | 7427,17

0,05 | 1,49 | 14,85 | 148,54 | 1485,43 | 14854,35

6 | 0,1 | 0,63 | 6,35 | 63,48 | 634,80 | 6347,95

0,05 | 1,27 | 12,70 | 126,96 | 1269,59 | 12695,91

0,025 | 2,54 | 25,39 | 253,92 | 2539,18 | 25391,82

0,0125 | 5,08 | 50,78 | 507,84 | 5078,36 | 50783,64

6,5 | 0,025 | 2,17 | 21,70 | 217,02 | 2170,25 | 21702,46

0,0125 | 4,34 | 43,40 | 434,05 | 4340,49 | 43404,93

0,006 | 9,04 | 90,43 | 904,27 | 9042,69 | 90426,93

0,003 | 18,09 | 180,85 | 1808,54 | 18085,39 | 180853,86

7 | 0,006 | 7,73 | 77,29 | 772,89 | 7728,85 | 77288,50

0,003 | 15,46 | 154,58 | 1545,77 | 15457,70 | 154577,01

0,0015 | 23,19 | 231,87 | 2318,66 | 23186,55 | 231865,51

0,001 | 46,37 | 463,73 | 4637,31 | 46373,10 | 463731,03

7,5 | 0,002 | 19,82 | 198,18 | 1981,77 | 19817,73 | 198177,33

0,001 | 39,64 | 396,35 | 3963,55 | 39635,47 | 396354,66

0,0005 | 79,27 | 792,71 | 7927,09 | 79270,93 | 792709,32

0,00025 | 158,54 | 1585,42 | 15854,19 | 158541,86 | 1585418,63

8 | 0,001 | 33,88 | 338,77 | 3387,68 | 33876,77 | 338767,72

0,0005 | 67,75 | 677,54 | 6775,35 | 67753,54 | 677535,44

0,00025 | 135,51 | 1355,07 | 13550,71 | 135507,09 | 1355070,89

0,000125 | 271,01 | 2710,14 | 27101,42 | 271014,18 | 2710141,77

Använd volym vid detektionsgränsen (l) | 0,1

Tillägg 2

Exempel på glasmantlat reaktionskärl för det försök med långsam omrörning som används för att bestämma POW

Tillägg 1

K × t-protokoll

1. En stegvis koncentration × tid-studie (k × t) kan övervägas som ett alternativ till det traditionella protokollet för bedömning av inhalationstoxicitet (12) (13) (14). Den bör företrädesvis utföras när det finns ett specifikt regelverk eller vetenskapligt behov som kräver testning av djur under flera tidsperioder, såsom katastrofhanterings- eller markanvändningsplanering. Detta tillvägagångssätt börjar med ett test vid en koncentrationsgräns (exponeringssession 1) i vilka djuren exponeras för en testkemikalie under fem tidsperioder (t.ex. 15, 30, 60, 120 och 240 minuter) så att flera löptider kommer att erhållas inom en exponeringssession (se figur 1). När förordning (EG) nr 1272/2008 används, är respektive koncentrationsgräns för gaser, ångor och aerosoler 20000 ppm, 20 mg/l och 5 mg/l. Dessa nivåer kan endast överskridas om det finns ett specifikt regelverk eller vetenskapligt behov som kräver testning vid dessa nivåer (se punkt 37 i B.2 i huvudtexten).

2. I situationer där det finns lite eller ingen information om en testkemikalies toxicitet, bör en inledande studie utföras, i vilken grupper om maximalt 3 djur per kön exponeras för de målkoncentrationer som försöksledaren har valt, vanligtvis i 240 minuter.

3. Om en koncentrationsgräns testas under exponeringssession 1 och lägre mortalitet än 50 % observeras, behövs inga ytterligare tester utföras. Om det finns ett regelverk eller vetenskapligt behov av att fastställa förhållandet koncentration/tid/respons för högre nivåer än den angivna koncentrationsgränsen bör nästa exponering utföras vid en högre nivå som t.ex. två gånger koncentrationsgränsen (dvs. 2 L i figur 1).

4. Om toxicitet observeras vid koncentrationsgränsen behöver ytterligare tester utföras (huvudstudie). Dessa exponeringar utförs antingen vid lägre koncentrationer (i figur 1: exponeringssession II, III eller IV) eller högre koncentrationer med kortare varaktigheter (i figur 1: exponeringssession IV) med anpassade tidsperioder som inte är så vitt åtskilda.

5. Testet (inledande koncentration och ytterligare koncentrationer) utförs med 1 djur/kön per koncentration/tidpunkt eller med 2 djur av det mer mottagliga könet per koncentration/tidpunkt. Under vissa omständigheter kan försöksledaren välja att använda 2 råttor per kön per koncentration/tidpunkt (eller 4 djur av det mer mottagliga könet per koncentration/tidpunkt) (15). Att använda 2 djur per kön per koncentration och tidpunkt kan generellt minska förutfattade meningar angående uppskattningarnas variation, öka framgångsgraden och förbättra konfidensintervallets täckning i förhållande till det protokoll som beskrivs här. Mer information finns i GD 39 (2).

6. Helst ska varje exponeringssession genomföras på en dag. Detta ger möjlighet att fördröja nästa exponering tills det finns en rimlig garanti för överlevnad, och det gör att försöksledaren kan justera målkoncentrationen och tidsperioden för nästa exponeringssession. Det rekommenderas att börja varje exponeringssession med den grupp som kommer att exponeras längst, t.ex. gruppen för exponering i 240 minuter följt av den som exponeras i 120 minuter, och så vidare. Om, till exempel, djur i 240-minutersgruppen dör efter 90 minuter eller uppvisar allvarliga tecken på toxicitet (t.ex. extrema förändringar i andningsmönster såsom ansträngd andning) är det inte meningsfullt att utsätta en grupp för 120 minuter eftersom dödligheten sannolikt skulle vara 100 %. Därför bör försöksledaren välja kortare exponeringstider för den koncentrationen (t.ex. 90, 65, 45, 33 och 25 minuter).

7. Kammarens koncentration bör mätas ofta för att bestämma den tidsviktade genomsnittskoncentrationen för varje exponeringsvaraktighet. När det är möjligt bör tidpunkten för dödsfallet för varje djur (snarare än exponeringsvaraktighet) användas för den statistiska analysen.

8. Man bör se närmare på resultaten från de fyra första exponeringssessionerna för att identifiera luckor i koncentration-tidskurvan (se figur 1). Vid en otillräcklig tillpassning bör en ytterligare exponering (5:e koncentration) genomföras. Koncentrations- och exponeringsvaraktigheter för den 5:e exponeringen bör väljas för att täcka denna lucka.

9. Alla exponeringssessioner (inklusive den första exponeringssessionen) används för att beräkna förhållandet koncentration-tid-respons med hjälp av statistisk analys (16). Om det är möjligt ska för varje k × t-intervall det tidsviktade medelvärdet och exponeringsvaraktigheten fram till döden användas (om dödsfallet inträffar under exponeringen). Figur 1 Hypotetisk illustration av förhållandet koncentration-tid-mortalitet för råttor Ofyllda symboler = överlevande; fyllda symboler = döda djur Trianglar = honor; cirklar = hanar Heldragen linje = LC50-värden (7,5–240 min) för hanar med n = 1 Streckad linje = LC50-värden (7,5–240 min) för honor med n = 1 Prickad linje = hypotetiska LC50-värdeslinjer för hanar och honor om n hade varit lika med 2 (12). Ordförklaringar Koncentration: Exponeringstid: Exponeringstid (min) Koncentration (L=limit)

10. Nedan finns ett exempel på ett stegvist förfarande: Exponeringssession 1 – testning vid koncentrationsgräns (se figur 1) 1 djur/kön per koncentration/tidpunkt, totalt Målkoncentration = koncentrationsgräns. Exponera fem grupper av djur för denna målkoncentration för respektive varaktighet 15, 30, 60, 120 och 240 minuter. ↓ Exponeringssession II– huvudstudie 1 djur/kön per koncentration/tidpunkt, totalt 10 djur. Exponera fem grupper av djur vid en lägre koncentration (1/2 l) med något längre exponeringsvaraktigheter (faktor √2 utspritt; se figur 1). ↓ Exponeringssession III – huvudstudie 1 djur/kön per koncentration/tidpunkt, totalt 10 djur. Exponera fem grupper av djur vid en lägre koncentration (1/4 l) med något längre exponeringsvaraktigheter (faktor √2 utspritt; se figur 1). ↓ Exponeringssession IV′ – huvudstudie 1 djur/kön per koncentration/tidpunkt, totalt 10 djur. Exponera fem grupper av djur vid en lägre koncentration (1/8 l) med något längre exponeringsvaraktigheter (faktor √2 utspritt; se figur 1). ↓ eller Exponeringssession IV – huvudstudie 1 djur/kön per koncentration/tidpunkt, totalt 10 djur. Exponera fem grupper av djur vid en högre koncentration (2 l) med något kortare exponeringsvaraktigheter (faktor √2 utspritt; se figur 1).

Matematisk behandling av resultaten för k × t-protokollet

11. Ett k × t-förfarande med 4 eller 5 exponeringskoncentrationer och fem varaktigheter ger 20 respektive 25 datapunkter. Med dessa datapunkter kan k × t-förhållandet beräknas med hjälp av statistisk analys (16): Ekvation 1: Probit P b 0 b 1ln C b 2ln t där C = koncentration; t = exponeringstid, eller Ekvation 2: Response C nt där n b 1 b 2. Med hjälp av ekvation 1 kan LC50-värdet beräknas för en given tidsperiod (t.ex. 4 timmar, 1 timme, 30 minuter eller valfri tidsperiod inom intervallet för testets tidsperioder) med P = 5 (50 % respons). Observera att Habers lag endast är tillämplig när n = 1. LC01 kan beräknas med hjälp av P = 2,67.

1 Om det inte finns någon information tillgänglig om könsmottaglighet används råttor av båda könen, dvs. 1 djur/kön per koncentration. Baserat på befintlig information eller om det blir uppenbart under denna exponeringssession att ett kön är mer mottagligt, används 10 djur av det mer mottagliga könet (2 djur per koncentration/tidpunkt) för varje koncentrationsnivå under efterföljande testning.10 djur

2 När förordning (EG) nr 1272/2008 används, är respektive koncentrationsgräns för gaser, ångor och aerosoler 20000 ppm, 20 mg/l och 5 mg/l. Vid förväntad toxicitet, eller baserat på resultaten från det inledande testet, bör lägre startkoncentrationer väljas. I fall av regulatoriska eller vetenskapliga behov kan högre koncentrationer användas.

3 Helst ska exponering av djur vid nästa koncentrationsnivå fördröjas tills det finns rimlig anledning att anta att de tidigare testade djuren överlever. Detta gör att försöksledaren kan justera målkoncentration och varaktighet för nästa exponeringssession.

4 Den minsta dosering (koncentration × tid) som resulterade i mortalitet vid den inledande koncentrationen (första exponeringssessionen) gäller som vägledning för att fastställa nästa kombination av koncentration och exponeringsvaraktighet. Normalt minskas koncentrationen tvåfaldigt (1/2 l) och djuren exponeras under ett nytt tidsintervall med ett finare rutnät av geometrisk uppdelning av exponeringsperioder med faktor 1,4 (√2; se hänvisning 11) runt tiden för den minsta letala dosnivån (tid × koncentration) som observerades under den första exponeringen. I denna figur (figur 1), observerades mortalitet först i exponeringssession I efter 15 min., varaktigheterna under session II centreras därför omkring 30 min., och är 15, 21 30, 42 och 60 min. Efter de första två exponeringarna rekommenderas att plotta datan i en liknande figur som visas ovan, och att kontrollera att förhållandet mellan koncentration och tid har en vinkel på 45 grader (n = 1), eller om förhållandet koncentration-tid-respons är mindre brant (t.ex. n = 2) eller brantare (t.ex. n = 0,8). I de senare fallen rekommenderas det att anpassa efterföljande koncentrationer och varaktigheter enligt detta.

5 Den minsta dosering (koncentration × tid) som resulterade i mortalitet vid den inledande koncentrationen (första exponeringssessionen) gäller som vägledning för att fastställa nästa kombination av koncentration och exponeringsvaraktighet. Normalt minskas koncentrationen tvåfaldigt (1/2 l) och djuren exponeras under ett nytt tidsintervall med ett finare rutnät av geometrisk uppdelning av exponeringsperioder med faktor 1,4 (√2; se hänvisning 11) runt tiden för den minsta letala dosnivån (tid × koncentration) som observerades under den första exponeringen. I denna figur (figur 1), observerades mortalitet först i exponeringssession I efter 15 min., varaktigheterna under session II centreras därför omkring 30 min., och är 15, 21 30, 42 och 60 min. Efter de första två exponeringarna rekommenderas att plotta datan i en liknande figur som visas ovan, och att kontrollera att förhållandet mellan koncentration och tid har en vinkel på 45 grader (n = 1), eller om förhållandet koncentration-tid-respons är mindre brant (t.ex. n = 2) eller brantare (t.ex. n = 0,8). I de senare fallen rekommenderas det att anpassa efterföljande koncentrationer och varaktigheter enligt detta.

6 Den minsta dosering (koncentration × tid) som resulterade i mortalitet vid den inledande koncentrationen (första exponeringssessionen) gäller som vägledning för att fastställa nästa kombination av koncentration och exponeringsvaraktighet. Normalt minskas koncentrationen tvåfaldigt (1/2 l) och djuren exponeras under ett nytt tidsintervall med ett finare rutnät av geometrisk uppdelning av exponeringsperioder med faktor 1,4 (√2; se hänvisning 11) runt tiden för den minsta letala dosnivån (tid × koncentration) som observerades under den första exponeringen. I denna figur (figur 1), observerades mortalitet först i exponeringssession I efter 15 min., varaktigheterna under session II centreras därför omkring 30 min., och är 15, 21 30, 42 och 60 min. Efter de första två exponeringarna rekommenderas att plotta datan i en liknande figur som visas ovan, och att kontrollera att förhållandet mellan koncentration och tid har en vinkel på 45 grader (n = 1), eller om förhållandet koncentration-tid-respons är mindre brant (t.ex. n = 2) eller brantare (t.ex. n = 0,8). I de senare fallen rekommenderas det att anpassa efterföljande koncentrationer och varaktigheter enligt detta.

7 I vissa fall kan det vara nödvändigt att öka koncentrationen (2 l) under ett nytt tidsintervall med ett ännu finare rutnät av geometrisk uppdelning av exponeringsperioder med faktor 1,4 (√2) omkring tiden för den minsta letala koncentrationsnivån som observerades under den första exponeringen. Den minsta exponeringstiden bör helst överstiga 5 minuter, den maximala exponeringstiden bör inte överstiga 8 timmar.

Tillägg 1

DEFINITIONER

Androgenicitet är förmågan hos en kemikalie att agera som ett naturligt androgent hormon (t.ex. testosteron) i en däggdjursorganism.

Antiandrogenicitet är förmågan hos en kemikalie att undertrycka verkan av ett naturligt androgent hormon (t.ex. testosteron) i en däggdjursorganism.

Anti-östrogenicitet är förmågan hos en kemikalie att undertrycka verkan av ett naturligt östrogent hormon (t.ex. 17ß-östradiol) i en däggdjursorganism.

Antityreoid aktivitet är förmågan hos en kemikalie att undertrycka verkan av ett naturligt sköldkörtelhormon (t.ex. T3) i en däggdjursorganism.

Dosering är en allmän term som omfattar dos, dess frekvens och doseringens varaktighet.

Dos är den mängd testkemikalie som administreras. Dosen uttrycks som testkemikaliens vikt per enhet kroppsvikt av försöksdjur per dag (t.ex. mg/kg kroppsvikt/dag), eller som en konstant kostkoncentration.

Uppenbar toxicitet är en allmän term som beskriver tydliga tecken på toxicitet efter tillförsel av testkemikalien. Dessa bör vara tillräckliga för en riskbedömning och bör vara sådana att en ökning av den tillförda dosen kan förväntas resultera i utvecklingen av allvarliga toxicitetssymptom och sannolikt leda till mortalitet.

NOAEL är förkortningen för nivån där ingen skadlig effekt observeras. Detta är den högsta dosnivå där inga behandlingsrelaterade fynd observerats på grund av behandling.

Östrogenicitet är förmågan hos en kemikalie att agera som ett naturligt östrogent hormon (t.ex. 17ß-östradiol) i en däggdjursorganism.

Testkemikalie: Alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.

Tyreoid aktivitet är förmågan hos en kemikalie att agera som ett naturligt sköldkörtelhormon (t.ex. T3) i en däggdjursorganism.

Validering är en vetenskaplig process utformad för att karakterisera de operativa kraven och begränsningarna hos en testmetod och visa dess tillförlitlighet och relevans för ett visst ändamål.

Tillägg 2

Endpoints rekommenderade för upptäckt av endokrinstörande ämnen (EDS) i denna B.7-testmetod

Obligatoriska endpoints | Valfria endpoints

Testiklar Epididymis Binjurar Prostata + sädesblåsor med koagulerande körtlar | Äggstockar Uterus, inklusive cervix Sköldkörtel

Könskörtlar: Testiklar och Äggstockar Accessoriska könsorgan: Epididymis, Prostata + sädesblåsa med koagulerande körtlar Uterus, inklusive cervix Binjure Sköldkörtel Vagina | Vaginala utstryk Manliga bröstkörtlar Hypofys

Cirkulerande T3- och T4-nivåer Cirkulerande TSH-nivåer

Tillägg 1

DEFINITION

Tillägg 1

DEFINITION

Tillägg 1

DEFINITION

Tillägg 1

DEFINITION

Tillägg 1

DEFINITION

Tillägg

DEFINITIONER

Tillägg 1

DEFINITION

Tillägg 2

Förfarande för varje startkoncentration för gaser (ppm/4 h) Allmänna anmärkningar

För varje startkoncentration ska förfarandet som är beskrivet i detta tillägg följas för respektive testprogram.

Beroende på antalet humant avlivade eller döda djur ska testproceduren följa de angivna pilarna.

1 I följande tabeller refereras till GHS (Globally Harmonised System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). EU-motsvarigheten är förordning (EG) nr 1272/2008. När det gäller akut inhalationstoxicitet, tillämpar inte förordning (EG) nr 1272/2008 (9) kategori 5.

Tillägg 2a

Akut inhalations toxicitet: Tes tförfarande med en s tartkoncentration av 100 ppm/4 h för gas er

3 ♂ + 3 ♀, eller 6 djur av det mer mottagliga könet per steg

0-6: Antal döende eller döda djur/testad koncentration

GHS: Globally Harmonized Classification System

∞: oklassifierad

Testning vid ≥ 20000 ppm/4h: se vägledningsdokument 39 (8)

Tillägg 2b

Akut inhalationstoxicitet: Testförfarande med en startkoncentration av 500 ppm/4 h för gaser

3 ♂ + 3 ♀, eller 6 djur av det mer mottagliga könet per steg

0-6: Antal döende eller döda djur/testad koncentration

GHS: Globally Harmonized Classification System

∞: oklassifierad

Testning vid ≥ 20000 ppm/4h: se vägledningsdokument 39 (8)

Tillägg 2c

Akut inhalationstoxicitet: Testförfarande med en startkoncentration av 2500 ppm/4 h för gaser

3 ♂ + 3 ♀, eller 6 djur av det mer mottagliga könet används per steg

0–6: Antal döende eller döda djur/testad koncentration

GHS: Globally Harmonized Classification System

∞: oklassifierad

Testning vid ≥ 20000 ppm/4h: se vägledningsdokument 39 (8)

Tillägg 2d

Akut inhalationstoxicitet: Testförfarande med en startkoncentration av 20000 ppm/4 h för gaser

3 ♂ + 3 ♀, eller 6 djur av det mer mottagliga könet används per steg

0-6: antal döende eller döda djur/testad koncentration

GHS: Globally Harmonized Classification System

∞: oklassifierad

Testning vid ≥ 20000 ppm/4h: se vägledningsdokument 39 (8)

Tillägg 3

Förfarande för varje startkoncentration för ångor (mg/l/4 h) Allmänna anmärkningar

För varje startkoncentration ska förfarandet som är beskrivet i detta tillägg följas för respektive testprogram.

Beroende på antalet humant avlivade eller döda djur ska testproceduren följa de angivna pilarna.

1 I följande tabeller refereras till GHS (Globally Harmonised System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). EU-motsvarigheten är förordning (EG) nr 1272/2008. När det gäller akut inhalationstoxicitet, tillämpar inte förordning (EG) nr 1272/2008 (9) kategori 5.

Tillägg 3a

Akut inhalationstoxicitet: Testförfarande med en startkoncentration av 0,5 mg/L/4 h för ångor

3 ♂ + 3 ♀, eller 6 djur av det mer mottagliga könet används per steg

0-6: antal döende eller döda djur/testad koncentration

GHS: Globally Harmonized Classification System

∞: oklassifierad

Testning vid 50 mg/L/4h: se vägledningsdokument 39 (8)

Tillägg 3b

Akut Inhalationstoxicitet: Testförfarande med en startkoncentration av 2 mg/L/4 h för ångor

3 ♂ + 3 ♀, eller 6 djur av det mer mottagliga könet används per steg

0–6: antal döende eller döda djur/testad koncentration

GHS: Globally Harmonized Classification System

∞: oklassifierad

Testning vid 50 mg/L/4h: se vägledningsdokument 39 (8)

Tillägg 3c

Akut Inhalationstoxicitet: Testförfarande med en startkoncentration av 10 mg/L/4 h för ångor

3 ♂ + 3 ♀, eller 6 djur av det mer mottagliga könet används per steg

0–6: antal döende eller döda djur/testad koncentration

GHS: Globally Harmonized Classification System

∞: oklassifierad

Testning vid 50 mg/L/4h: se vägledningsdokument 39 (8)

Tillägg 3d

Akut Inhalationstoxicitet: Testförfarande med en startkoncentration av 20 mg/L/4 h för ångor

3 ♂ + 3 ♀, eller 6 djur av det mer mottagliga könet används per steg

0-6: Antal döende eller döda djur/testad koncentration

GHS: Globally Harmonized Classification System

∞: oklassifierad

Testning vid 50 mg/L/4h: se vägledningsdokument 39 (8)

Tillägg 4

Förfarande för varje startkoncentration för aerosoler (mg/l/4 h) Allmänna anmärkningar

För varje startkoncentration ska förfarandet som är beskrivet i detta tillägg följas för respektive testprogram.

Beroende på antalet humant avlivade eller döda djur ska testproceduren följa de angivna pilarna.

1 I följande tabeller refereras till GHS (Globally Harmonised System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). EU-motsvarigheten är förordning (EG) nr 1272/2008. När det gäller akut inhalationstoxicitet, tillämpar inte förordning (EG) nr 1272/2008 (9) kategori 5.

Tillägg 4a

Akut Inhalationstoxicitet: Testförfarande med en startkoncentration av 0,05 mg/L/4h för ångor

3 ♂ + 3 ♀, eller 6 djur av det mer mottagliga könet används per steg

0-6: Antal döende eller döda djur/testad koncentration

GHS: Globally Harmonized Classification System

∞: oklassifierad

Testning vid 12,5 ng/L/4h: se vägledningsdokument 39 (8)

Tillägg 4b

Akut inhalationstoxicitet: Testförfarande med en startkoncentration av 0,5 mg/L/4h för aerosoler

3 ♂ + 3 ♀, eller 6 djurav det mer mot tagliga könet används per steg

0-6: Antal döende eller döda djur/testad koncentration

GHS: Globally Harmonized Classification System

∞: oklassifierad

Testning vid 12,5 mg/L/4h: se vägledningsdokument 39 (8)

Tillägg 4c

Akut inhalationstoxicitet: Testförfarande med en startkoncentration av 1 mg/L/4h för aerosoler

3 ♂ + 3 ♀, eller 6 djurav det mer mot tagliga könet används per steg

0-6: Antal döende eller döda djur/testad koncentration

GHS: Globally Harmonized Classification System

∞: oklassifierad

Testning vid 12,5 mg/L/4h: se vägledningsdokument 39 (8)

Tillägg 4d

Akut Inhalationstoxicitet: Testförfarande med en startkoncentration av 5 mg/L/4h för aerosoler

3 ♂ + 3 ♀, eller 6 djurav det mer mot tagliga könet används per steg

0-6: Antal döende eller döda djur/testad koncentration

GHS: Globally Harmonized Classification System

∞: oklassifierad

Testning vid 12,5 mg/L/4h: se vägledningsdokument 39 (8)

Tillägg 1

Figur 1 Utrustning för undersökning av biologisk nedbrytning

Husmann-enhet

A. Förvaringskärl

B. Doseringspump

C. Luftningskammare (kapacitet 3 l)

D. Sedimenteringskärl

E. Mammutpump

F. Uppsamlingskärl

G. Luftningssystem

H. Luftflödesmätare

Figur 2 Utrustning för undersökning av biologisk nedbrytning

Porous Pot-enhet

A. Förvaringskärl

B. Doseringspump

C. Poröst luftningskärl

D. Yttre ogenomträngligt kärl

E. Uppsamlingskärl

F. Diffusör

G. Luftflödesmätare

Figur 3 Detaljbeskrivning av Porous Pot-enhetens luftningskärl (3 l)

Tillägg 2

Exempel på en elimineringskurva

Polyetylenglykol 400 Testkoncentration 20 mg/l DOC

Tillägg 3

[SOM INFORMATION]

KOPPLING AV TESTENHETER

För att försöka likställa de mikrobiella populationerna i testenheten som matas med avloppsvatten plus testkemikalie och kontrollenheten som endast matas med avloppsvatten, har man infört dagligt utbyte av slam (1). Förfarandet kallas koppling och metoden kallas kopplade enheter. Koppling gjordes till en början med Husmann-enheter för aktiverat slam men har också gjorts med Porous Pot-enheter (2) (3). Inga betydande skillnader i resultat erhölls mellan icke-kopplade och kopplade enheter (Husmann eller Porous Pots) och det är därför onödigt att använda tid och resurser på koppling av enheter.

Utbyte av slam kan ge bilden av rätt betydande eliminering, eftersom en del av testkemikalien överförs och koncentrationen av testkemikalie i test- och kontrollutflödena blir nästan densamma. Därför måste korrigeringsfaktorer användas, vilka är beroende av den fraktion som utbyts och den genomsnittliga hydrauliska retentionstiden. Närmare detaljer om beräkningen har publicerats (1).

Beräkna den korrigerade DOC- eller COD-elimineringsgrader med användning av följande allmänna formel:

där

Om t.ex. hälften av volymen i luftningskärlet byts ut (a = 0,5) och den genomsnittliga hydrauliska retentionstiden är 6 timmar, är den korrekta formeln följande:

LITTERATUR

1 Fischer W., Gerike P., Holtmann W (1975), Biodegradability Determinations via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled Units of the OECD Confirmatory Test. I The test, Wat. Res. 9, s. 1131–1135.

2 Painter H. A. och Bealing D. J. (1989), Experience and data from the OECD Activated Sludge Simulation Test, s. 113–138, ingår i Laboratory Tests for Simulation of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18, Red. Jacobsen B. N., Muntau H., Angeletti G.

3 Painter H. A., King E. F. (1978), Water Research Centre Porous Pot Method for Assessing Biodegradability, Technical Report TR70, Water Research Centre, Stevenage, UK.

Tillägg 4

UTVÄRDERING AV INHIBERING AV AKTIVERAT SLAM

Förfarande med testkemikalier

1. En kemikalie (eller ett avloppsvatten) bryts eventuellt inte ned eller elimineras i simuleringstest och kan t.o.m. ha en inhiberande effekt på slammets mikroorganismer. Övriga kemikalier är biologisk nedbrytbara i låga koncentrationer men har inhiberande verkan i högre koncentrationer (hormesis). Inhiberande effekter har kanske framkommit på ett tidigare skede eller kan bestämmas med hjälp av toxicitetstest, med användning av liknande eller identiskt inokulat som används vid simuleringstest (1). Sådana metoder är inhibering av syreupptagning (kapitel C.11 i denna bilaga (2) och ISO 8192 (3)) eller inhibering av tillväxt av mikroorganismer i aktiverat slam (ISO 15522 (4)).

2. Vid simuleringstest framgår inhibering genom att skillnaden mellan upplöst organiskt kol (DOC) eller kemisk syreförbrukning (COD) mellan utflödet från testkärlet och utflödet från kontrollkärlet är större än det DOC som tillsatts i form av testkemikalie. Detta kan även uttryckas som att den procentuella elimineringen av DOC (och biokemisk syreförbrukning BOD, kemisk syreförbrukning COD och/eller NH+4) i det organiska mediet minskar när testkemikalie har tillsatts. Om detta inträffar bör testet upprepas med lägre koncentration av testkemikalien tills man når en nivå där ingen inhibering inträffar och därefter eventuellt ytterligare sänka koncentrationen tills testkemikalien har brutits ned biologiskt. Om däremot testkemikalien (eller avloppsvattnet) påverkar processen negativt vid alla testade koncentrationer, tyder detta på att kemikalien är svår eller omöjlig att behandla biologiskt, även om det kan vara värt att upprepa testet med aktiverat slam från en annan källa och/eller låta slammet acklimatisera sig mer gradvis.

3. Omvänt gäller att om testkemikalien bryts ned biologiskt vid första försöket i ett simuleringstest bör koncentrationen ökas, om det är nödvändigt att få information om huruvida kemikalien fungerar inhiberande.

4. Vid bestämning av inhiberingsgraden bör man komma ihåg att populationen i det aktiverade slammet kan ändras så att mikroorganismerna med tiden utvecklar tolerans mot en inhiberande kemikalie.

5. Beräkning av inhiberingsgraden: Den totala procentuella elimineringen Ro, av BOD, DOC, COD osv. för test- och kontrollenheterna kan beräknas genom följande: R o 100 I E I % där: I inflödeskoncentrationen för BOD, DOC, COD osv. för test- eller kontrollkärl (mg/l), E respektive utflödeskoncentrationer (mg/l). I och E måste korrigeras för DOC på grund av testkemikalien i testenheterna, annars får man inte rätt resultat från beräkningen av procentuell inhibering. Graden av inhibering orsakad av testkemikalien kan beräknas genom följande: % inhibering 100 R c R t R c där: Rc procentuell eliminering i kontrollkärlen, Rt procentuell eliminering i testkärlen.

LITTERATUR

1 Reynolds L. m.fl. 1987), Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability, Chemosphere 16: 2259.

2 Kapitel C.11 i denna bilaga, Biologisk nedbrytbarhet – Aktiverat slam – respirationshämningstest.

3 ISO 8192 (2007), Water quality - Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation.

4 ISO 15522 (1999), Water Quality - Determination of the inhibitory effect of water constituents on activated sludge microorganisms.

Tillägg 5

Dåligt vattenlösliga kemikalier, flyktiga kemikalier

Dåligt vattenlösliga kemikalier

Det verkar finnas få publicerade rapporter rörande test som simulerar vattenrening och omfattar kemikalier med dålig eller ingen löslighet i vatten (1) (2) (3).

Det finns ingen enskild metod för dispergering av testkemikalie som kan tillämpas på alla olösliga kemikalier. Två av de fyra typer av metoder som beskrivs i ISO 10634 (4) verkar vara lämpliga för att dispergera testkemikalier för simuleringstest – användning av emulgeringsmedel och/eller ultraljud. Den resulterande dispersionens stabilitet bör fastställas under minst 24 timmar. Lämpligt stabiliserade dispersioner i en behållare med kontinuerlig omrörning (punkt 38) kan därefter doseras till luftningskärlet separat från avloppsvatten från hushåll (eller syntetiskt avloppsvatten).

Om en dispersion är stabil bör man undersöka hur testkemikalien kan bestämmas i den dispergerade formen. Det är sannolikt inte lämpligt med DOC, vilket betyder att en specifik analysmetod för testkemikalien bör etableras som kan användas på utflöde, utflödets fasta ämnen och aktiverat slam. Därefter fastställs vad som händer med testkemikalien vid simulering av aktivslamprocessen, i vätskeform och fast form. Då kan en massbalans etableras för att fastställa huruvida det har skett biologisk nedbrytning av testkemikalien. Detta ger dock endast indikation på primär biologisk nedbrytning. Man bör försöka demonstrera slutlig biologisk nedbrytning genom att tillämpa respirometritest för lätt bionedbrytbarhet (kapitel C.4 i denna bilaga (5) C, F eller D) med inokulat i form av slam som exponerats för testkemikalien i simuleringstestet.

Flyktiga kemikalier

Simulering av avloppsvattenrening på flyktiga kemikalier är både diskutabelt och problematiskt. På samma sätt som för dåligt vattenlösliga testkemikalier tycks det även för flyktiga kemikalier ha publicerats mycket få rapporter som beskriver simuleringstest. En konventionell typ av apparatur för fullständig blandning kan anpassas genom att försegla luftnings- och sedimenteringskärlen, och därefter mäta och kontrollera luftflödet med flödesmätare och låta utloppsgasen passera genom fällor för uppsamling av flyktigt organiskt material. I vissa fall används vakuumpump för att dra utloppsgasen genom en kall fälla eller purge-trap som innehåller Tenax och silikagel för gaskromatografianalyser. Testkemikalien i fällan kan bestämmas analytiskt.

Testet genomförs i två delar. Först körs enheterna utan slam men med syntetiskt avloppsvatten plus testkemikalie som pumpas in i luftningskärlet. Prover tas av inflöde, utflöde och utloppsgas och analyseras för testkemikalien under några dagar. Utifrån insamlade data kan procentandelen testkemikalie (Rvs) som strippats ur systemet beräknas.

Därefter genomförs normalt biologiskt test (med slam) under liknande förhållanden som använts vid strippningen. Likaså mäts DOC eller COD för att kontrollera att enheterna fungerar effektivt. Mängden testkemikalie i inflöde, utflöde och utloppsgas bestäms då och då under testets första fas, och efter acklimatiseringen mer frekvent. Utifrån de data som fås under steady state kan procentandelen eliminerad testkemikalie från vätskefasen i alla processer (RT) (fysisk och biologisk eliminering) beräknas, såväl som andelen (RV) som strippats från systemet.

Beräkning:

a Vid icke-biologiskt test kan procentandelen (RVP) testmaterial som strippats från systemet beräknas genom följande:

b Vid biologiskt test kan procentandelen (RV) testmaterial som strippats från systemet beräknas genom följande:

c Vid biologiskt test beräknas procentandelen testkemikalie (RT) som eliminerats genom alla processer genom följande:

d Då kan procentandelen (RBA) som eliminerats genom bionedbrytning plus adsorption beräknas genom följande:

e En jämförelse mellan andelen testkemikalie som strippats från systemen för biologiskt test (Rv) och icke-biologiskt test (Rvp) indikerar den totala effekt som den biologiska behandlingen har haft på utsläpp av testkemikalien i atmosfären.

LITTERATUR

1 Horn J. A., Moyer J. E., Hale J.H. (1970), Biological degradation of tertiary butyl alcohol, Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ., s. 939–854.

2 Pitter P., Chudoba J. (1990), Biodegradability of organic substances in the aquatic environment, CRC Press, Boston, Förenta staterna.

3 Stover E. L., Kincannon D. F. (1983), Biological treatability of specific organic compounds found in chemical industry waste waters, J. Wat. Pollut. Control Fed. 55, 97,

4 ISO 10634 (1995), Water Quality - Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.

5 Kapitel C.4 i denna bilaga, Bestämning av lätt bionedbrytbarhet.

Tillägg 6

Slamretentionstidens (SRT) inverkan på reningsmöjligheterna för en kemikalie

INLEDNING

1. Den metod som beskrivs i huvudtexten syftar till att fastställa om de kemikalier som testas (i regel kemikalier som veterligen är inherent, men inte lätt, bionedbrytbara) kan brytas ned biologiskt inom de gränser som gäller i avloppsreningsverk. Resultaten uttrycks som procentandel eliminering och procentandel biologisk nedbrytning. Driftsbetingelserna i aktivslamenheterna och valet av inflöde kan ge rätt stora variationer vad gäller koncentrationen av testkemikalie i utflödet. Testerna genomförs vanligen med endast en nominell koncentration av fasta ämnen i slammet eller en nominell slamretentionstid (SRT) och de beskrivna systemen för slamkassering kan leda till att SRT-värdet varierar betydligt under testet, både från dag till dag och under en dag.

2. I denna variant (1) (2) kontrolleras SRT med mycket snävare gränser under varje 24-timmarsperiod (på samma sätt som i full skala), vilket ger en mer konstant koncentration i utflödena. Avloppsvatten från hushåll rekommenderas eftersom det ger enhetligare och högre procentandel eliminering. Dessutom undersöks verkningarna av ett antal SRT-värden och i en mer detaljerad studie kan verkningarna av ett urval temperaturer på utflödeskoncentrationen fastställas.

3. Det finns fortfarande inget allmänt samförstånd om vilken kinetisk modell som gäller när kemikalier bryts ned biologiskt under de förhållanden som råder vid avloppsvattenrening. Monod-modellen för bakteriell tillväxt och substratanvändning valdes (1) (2) för behandling av insamlade data, eftersom metoden endast var avsedd att tillämpas på kemikalier tillverkade i stora volymer som leder till en koncentration över 1 mg/l i avloppsvattnet. Den förenklade modellens giltighet och de antaganden som gjordes fastställdes genom användning en serie alkoholetoxylat med varierande grader av primär bionedbrytbarhet (2) (3). Anmärkning: Denna metodvariant påminner mycket om testmetod C.10-A och nedan anges endast de detaljer som avviker.

PRINCIP FÖR TESTMETODEN

4. Porous Pot-enheter för aktiverat slam utformade för att ge (nästan) kontinuerlig kassering av blandad vätska, vilket möjliggör en mycket exakt kontroll av slamretentionstiden (SRT eller θs), körs i icke-kopplat läge med ett urval olika slamretentionstider och, alternativt, med ett urval olika temperaturer. Retentionstiden är i regel 2–10 dagar och temperaturen mellan 5 och 20 °C. Avloppsvattnet, helst från hushåll, och en lösning av testkemikalien doseras separat till enheterna med ett flöde som ger den önskade retentionstiden (3–6 timmar) och önskad koncentration av testkemikalien i inflödet. Kontrollenheter som inte matas med testkemikalie körs parallellt för jämförande ändamål.

5. Olika typer av apparatur kan användas, men stor vikt bör fästas vid att säkerställa god kontroll av slamretentionstiden. Om den utrustning som används t.ex. innehåller ett sedimenteringskärl, kan det vara nödvändigt att räkna med förlust av fasta ämnen via utflödet. Dessutom bör speciella försiktighetsmått vidtas för att undvika fel på grund av variationer av mängden slam i sedimenteringskärlet.

6. Enheterna körs vid var och en av de olika betingelser som har valts, och efter att jämvikt har nåtts fås genomsnittliga steady state-koncentrationer av testkemikalie i utflödena, och alternativt DOC, under en period som omfattar cirka tre veckor. Utöver bedömning av procentandelen eliminering för testkemikalie, och alternativt DOC, fås förhållandet mellan driftsbetingelserna och koncentrationen i utflödet uttryckt i grafisk form. Utifrån detta kan preliminära kinetiska konstanter beräknas och prognoser för de betingelser under vilka testkemikalien kan behandlas.

INFORMATION OM TESTKEMIKALIEN

7. Se kapitel C.10 A, punkterna 12 och 13.

GODKÄNNANDENIVÅER

8. Se kapitel C.10 A, punkterna 14 och 15.

REFERENSKEMIKALIE

9. Se kapitel C.10 A, punkt 16.

TESTRESULTATENS REPRODUCERBARHET

10. Se kapitel C.10 A, punkterna 17 och 18.

METODBESKRIVNING

Apparatur

11. Lämplig enhet är ett modifierat Porous Pot-system (tillägg 6.1). Det består av ett inre kärl konstruerat av poröst polypropen med tjocklek på 3,2 mm och porstorlek på cirka 90 μm, med stumsvetsad söm (detta ger en robustare enhet än den som beskrivs i punkt 21 i detta kapitel C.10 A). Innerkärlet omsluts av ett ogenomträngligt ytterkärl av polyetylen som består av två delar: en rund bas med hål för två luftkanaler och en slamkasseringskanal, och en övre cylinder som är skruvad på basen och vars utlopp är placerat så att Porous Pot-kärlet får en känd volym på 3 liter. En av luftkanalerna har en diffusör och den andra är öppen och placerad i rät vinkel till diffusörens utlopp. Detta system ger den turbulens som krävs för att säkerställa att innehållet blandas fullständigt och att koncentrationerna av löst syre hålls över 2 mg/l.

12. Lämpligt antal enheter hålls vid kontrollerad temperatur mellan 5 och 20 °C (± 1 °C), antingen i vattenbad eller i utrymmen med konstant temperatur. Pumpar krävs för att dosera lösning av testkemikalie och sedimenterat avloppsvatten med önskat flöde (0–1,0 ml/min och 0–25 ml/min) och en tredje pump för att avlägsna överloppsslam från luftningskärlen. Den mycket låga flödeshastighet som krävs för överskottsslam nås genom att använda en pump ställd på högre flödeshastighet som körs intermittent med hjälp av en timer, t.ex. 10 sekunder per minut, så att en pumpinställning på 3 ml/min ger ett flöde på 0,5 ml/min.

Filtreringsapparatur eller centrifug

13. Se kapitel C.10 A, punkt 23.

Analysutrustning

14. Se kapitel C.10 A, punkt 24.

Vatten

15. Se kapitel C.10 A, punkterna 25 och 26.

Organiskt medium

16. Se kapitel C.10 A, punkt 27.

Syntetiskt slam

17. Se kapitel C.10 A, punkt 28.

Avloppsvatten från hushåll

18. Se kapitel C.10 A, punkt 29.

Aktiverat slam

19. Se kapitel C.10 A, punkt 30.

Stamlösningar av testkemikalien

20. Se kapitel C.10 A, punkterna 31 och 32.

FÖRFARANDE

Förberedning av inokulat

21. Se kapitel C.10 A, punkt 34 (endast denna gäller) – använd aktiverat slam (cirka 2,5 g/l).

Antal testenheter

22. För ett enkelt test, dvs. för att mäta procentandelen eliminering, behövs bara en slamretentionstid (SRT). För att få de data som behövs för beräkning av preliminära kinetiska konstanter behövs däremot 4 eller 5 SRT-värden. Vanligen används retentionstider mellan 2 och 10 dagar. Det är i regel praktiskt att göra ett test med 4 eller 5 SRT-värden samtidigt vid en och samma temperatur. I mer omfattande studier kan samma SRT-värden, eller eventuellt ett annat urval värden, användas vid andra temperaturer inom området 5–20 °C. För primär bionedbrytning (huvudändamål) behövs i regel bara en enhet per uppsättning testbetingelser. Vid test av slutlig bionedbrytbarhet behövs dock en kontrollenhet för varje uppsättning testbetingelser; denna matas med enbart slam, inte testkemikalie. Om man tror att det finns testkemikalie i det slam som används, är det nödvändigt att använda kontrollenheter vid bedömning av primär biologisk nedbrytning och därefter göra nödvändiga korrigeringar i beräkningarna.

Dosering av organiskt medium och testkemikalie

23. Se kapitel C.10 A, punkterna 36–39, men notera att testkemikalielösningen doseras separat och att flera olika slamkasseringsgrader används. Det behövs också regelbunden övervakning (t.ex. två gånger om dagen) och vid behov justering, inom ±10 %, av flödeshastigheterna för inflöden, utflöden och slamkassering. Om det uppstår svårigheter med analysmetoden när avloppsvatten från hushåll används, kan testet genomföras med syntetiskt avloppsvatten, men då måste man se till att olika media ger jämförbara kinetiska data.

Hantering av enheterna för aktiverat slam

24. Se kapitel C.10 A, punkterna 40–43, men SRT ska endast kontrolleras genom konstant kassering av slam.

Provtagning och analys

25. Se kapitel C.10 A, punkterna 44–50, med undantag för att testkemikaliens koncentration måste bestämmas och bestämning av DOC är frivillig. COD ska inte användas.

DATA OCH RAPPORTERING

Behandling av resultaten

26. Se kapitel C.10 A, punkterna 52–54.

Presentation av testresultat

27. Se kapitel C.10 A, punkterna 56–62.

Beräkning av kinetiska konstanter

28. Det är mera realistiskt att ange genomsnittlig steady state-koncentration av testkemikalien i utflödet och beskriva hur denna varierar enligt driftsbetingelserna än att ange procentuell primär bionedbrytning. Detta kan göras genom att beakta ekvation 6 i tillägg 6.2 som kan ge värden för KS, μm och θSC, den kritiska slamretentionstiden. (Alternativt kan ungefärliga värden för KS och μm fås med hjälp av ett enkelt datorprogram för att anpassa den teoretiska kurvan som beräknats med ekvation 2 (tillägg 6.2) till de experimentella värdena. Även om ingen given lösning är unik, går det att få en rimlig approximering av KS och μm.)

Resultatvariation

29. Den vanliga erfarenheten är att man får varierande värden för de kinetiska parametrarna för individuella kemikalier. Man tror att slammets odlingsbetingelser och de betingelser som gäller i det test som används (som i punkt 5 och i andra test) har en stor effekt på de värden som erhålls. En aspekt av denna variation har diskuterats av Grady m.fl. (4) som har föreslagit att termerna extant and intrinsic ska användas för de två extrema betingelser som representerar gränserna för den fysiologiska status som en odling kan ha under ett kinetiskt experiment. Om odlingens status inte tillåts variera under testet, återspeglar de kinetiska parametervärdena betingelserna i den miljö från vilken mikroorganismerna har tagits – för dessa värden används benämningen extant, dvs. något som fortsatt existerar. Vid den andra yttersta gränsen är testbetingelserna sådana att de medger full utveckling av proteinsyntessystemet och därmed möjlighet till största möjliga tillväxt, och då används benämningen intrinsic för de kinetiska parametrar som erhålls, dvs. de är endast beroende av substratets karaktär och typen av bakterier i odlingen. Som riktlinje kan sägas att extant-värden fås när förhållandet mellan substratets koncentration och kompetenta mikroorganismer (So/Xo) hålls lågt, t.ex. 0,025, och intrinsic-värden fås när förhållandet är högt, t.ex. minst 20. I båda fallen gör So bör vara samma eller högre än det relevanta värdet för Ks, halvmättnadskonstanten.

30. Variationen och andra aspekter rörande bionedbrytningens kinetik diskuterades nyligen vid en SETAC-workshop (5). Dessa studier, rapporterade och projekterade, bör ge en klarare uppfattning om den kinetik som fungerar i vattenreningsverk, och därmed en bättre tolkning av befintliga data och förslag till mer relevanta utformningar av nya testmetoder.

LITTERATUR:

1 Birch R. R. (1982), The biodegradability of alcohol ethoxylates, XIII Jornado Com. Espanol Deterg., s. 33–48.

2 Birch R. R. (1984), Biodegradation of noniomic surfactants, J.A.O.C.S., 61(2), s. 340–343.

3 Birch R. R. (1991), Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage treatment, J. Chem. Tech. Biotechnol., 50, s. 411–422.

4 Grady C. P. L., Smets B. F. och Barbeau D. S. (1996), Variability in kinetic parameter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology, Wat. Res., 30 (3), s. 742–748.

5 Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997), Workshop at Port Sunlight, UK, red. Hales S. G., Feitjel T., King H., Fox K., Verstraete W., 4–6 september 1996. SETAC Europe, Bryssel.

Tillägg 6.1

Porous Pot med SRT-kontroll

Testämne

Inflöde

Yttre kärl gjort av plast

Porös polypropylenfodring

Förslut

Diffusorsten

Skuvgänga

Solid Plastbas

Vattenslam

Lufttillförsel

Utflöde

Tillägg 6.2

Beräkning av kinetiska konstanter

1. Utifrån antagandet att Monod-kinetik kan tillämpas och med beaktande av en massbalans av aktiva fasta ämnen och substrat över systemet med aktiverat slam (1), kan man få steady state-uttryck enligt följande: 1 θ s μ m S 1 K s S 1 K d (1) eller S 1 K s 1 K d θ s θ s μ m K d 1 (2) där S1 koncentrationen substrat i utflödet (mg/l) KS halvmättnadskonstant, den koncentration vid vilken μ = μm/2 (mg/l) μ specifik tillväxthastighet (d–1) μm maximivärde för μm(d–1) Kd specifik sönderfallshastighet för aktiva fasta ämnen (d–1) θS slammets medelretentionstid, SRT (d) Undersökning av denna ekvation leder till följande slutsatser: i) Koncentrationen i utflödet är oberoende av koncentrationen i inflödet (S0); således varierar den procentuella bionedbrytningen enligt koncentrationen i inflödet S0. ii) Den enda anläggningskontrollparameter som påverkar S1 är slamretentionstiden θS. iii) För en given koncentration i inflödet, S0, finns det en kritisk slamretentionstid, dvs. 1 θ SC μ s S 0 K s S 0 K d (3) där θSC kritisk slamretentionstid, under vilken de kompetenta mikroorganismerna sköljs ut ur anläggningen. iv) Eftersom de övriga parametrarna i ekvation (2) är associerade med tillväxtkinetik, är det sannolikt att temperaturen påverkar utflödets substratnivå och den kritiska slamåldern, dvs. den slamretentionstid som behövs för att få en viss grad av rening ökar med sjunkande temperatur.

2. Utifrån en massbalans för fasta ämnen i Porous Pot-systemet och utifrån antagandet att koncentrationen fasta ämnen i anläggningens utflöde X2 är lågt i jämförelse med luftningskärlets utflöde X1, är slamretentionstiden θ s V X 1 Q 0 Q 1 X 2 Q 1 X 1 (4) och θ s V X 1 Q 1 X 1 V Q 1 där V luftningskärlets volym (l) X1 koncentrationen fasta ämnen i luftningskärlet (mg/l) X2 koncentrationen fasta ämnen i utflödet (mg/l) Q0 inflödets flödeshastighet (l/d) Q1 avloppsslammets flödeshastighet (l/d) Det är således möjligt att hålla slamretentionstiden på ett förhandsvalt värde genom att kontrollera avloppsslammets flödeshastighet Q1. Slutsatser:

3. Huvudsyftet med detta test är alltså att kunna förutse testkemikaliens koncentration i utflödet, och därmed testkemikaliens nivåer i vattenrecipienten.

4. Genom att plotta S1 mot θS kan den kritiska slamretentionstiden θSC i vissa fall uppskattas på enkelt sätt, se t.ex. kurva 3 i figur 1. Om detta inte är möjligt kan θSC beräknas med ungefärliga värden på μm och KS genom att plotta S1 mot S1•θS. Omordning av ekvation 1 ger följande: S 1 θ s 1 θ s K d K s μ m S 1 μ m (5) Om Kd är lågt blir 1 + θs • Kd ~ 1 och ekvation 5 blir enligt följande: S 1 θ s K s μ m S 1 μ m (6) Då bör kurvan bli en rak linje (se figur 2) som har lutningen 1/μm och skärningspunkt med KS/μm; likaså är θS ~1/μm. Figur 1 Tre temperaturer, fem SRT-värden Figur 2 Regressionslinje SRT · S1 mot S1 vid T = 5 °C Ordlista: Koncentration i utflöde Kurva

Tillägg 7

TEST VID LÅGA (μg/l) KONCENTRATIONER

1. Kemikalierna i vattenmiljön förekommer ofta i mycket låga koncentrationer (μg/l), även i avloppsvatten. Vid sådana koncentrationer fungerar de sannolikt inte som primära substrat som resulterar i tillväxt, utan sönderfaller mer sannolikt som icke-växande sekundära substrat, parallellt med förekomsten av flera olika naturligt förekommande kolföreningar. Av det följer att sönderfallet av sådana kemikalier inte följer modellen som beskrivs i tillägg 6. Det finns flera modeller som kan tillämpas och under de betingelser som råder i system för rening av avloppsvatten kan flera modeller vara samtidigt aktiva. Det kommer att behövas en hel del mera forskning för att få klarhet i detta problem.

2. Fram till dess kan förfarandet som beskrivs i huvudtexten (kapitel C.10 A) följas, men endast för primär bionedbrytbarhet, med användning av lämpligt låga koncentrationer (< 100 μg/l) och ett validerat analysförfarande. Den procentuella bionedbrytningen kan beräknas (se punkt 54 i testmetoden) förutsatt att de abiotiska processerna (adsorption, flyktighet osv.) beaktas. Som exempel kan nämnas en studie gjord av Nyholm m.fl. (1) (2) med användning av en 4-timmarscykel i ett fill and draw-system. De rapporterade pseudo-första ordningens konstanter för 5 kemikalier som tillsatts till syntetiskt avloppsvatten i koncentrationer på 5–100 μg/l. För slutlig bionedbrytbarhet kan 14C-märkta kemikalier användas. Beskrivning av detta går utöver räckvidden för denna testmetod eftersom det än så länge inte finns överenskomna förfaranden, om än en föreslagen metod för ISO 14592 (3) innehåller vägledning om användningen av 14C-märkta kemikalier.

SCAS-test

3. Senare föreslogs ett enklare tvåstegstest (4) (5) (6) där SCAS-metoden (Semi Continous Activated Sludge) följs av ett kortvarigt kinetiskt test på prover tagna från SCAS-enheterna. SCAS-systemet körs med kända slamkasseringsgrader (till åtskillnad från den ursprungliga C.12-testmetoden) och matas med modifierat syntetiskt avloppsvatten eller avloppsvatten från hushåll. Det syntetiska avloppsvattnet modifierades (på grund av föränderligt pH-värde och slammets dåliga sedimentering) genom tillsats av fosfat som buffert, jästextrakt, järn(III)klorid och spårelementsalter, och COD höjdes till cirka 750 mg/l genom ökad koncentration av pepton och köttextrakt. Enheterna kördes med en 24-timmarscykel: luftning under 23 timmar, kassering av slam, sedimentering, borttagning av supernatant (utflöde) och därefter tillsats av syntetiskt avloppsvatten plus testkemikalie, upp till μg/l (dvs. ungefär samma koncentration som användes i korttidstestet). En gång i veckan ersattes 10 % av totalslammet med färskt slam för att upprätthålla balans i den mikrobiella populationen.

4. Koncentrationen av testkemikalie i början och i slutet av luftningen uppmäts och testet fortsätts tills en konstant eliminering av testkemikalie erhålls, vilket tar från en vecka till flera månader.

Korttidstest

5. Ett korttidstest (t.ex. 8 timmar) används för att bestämma (pseudo) första ordningens kinetiska konstant för sönderfall av testkemikalien i aktiverat slam med kända men olika ursprung och olika historia. Slamprover tas särskilt från SCAS-reaktorer – i slutet av luftningsperioden när koncentrationen organiskt substrat är låg – medan acklimatiseringsexperiment pågår (punkterna 3, 4). För jämförelse kan slam också tas från en parallell SCAS-enhet som inte exponeras för testkemikalie. Blandningar av slam och testkemikalie tillsatta i två eller flera koncentrationen i området 1–50μg/l luftas, utan tillsats av syntetiskt avloppsvatten eller annat organiskt substrat. Kvarvarande testkemikalie i lösningen bestäms med regelbundna mellanrum, t.ex. varje timme, beroende på kemikaliens sönderfallsegenskaper, under högst 24 timmar. Proverna centrifugeras före själva analysen.

Beräkningar

6. Data från SCAS-enheterna används för att beräkna procentandelen eliminerad testkemikalie (punkt 54). Likaså kan en konstant för genomsnittlig eliminering K1 (normaliserad för koncentrationen suspenderade fasta ämnen) kalkyleras genom följande: K 1 1 t ln C e C i 1 SS 1 g h där t luftningstiden (23 timmar) Ce koncentrationen vid luftningsperiodens slut (μg/l) Ci koncentrationen vid luftningsperiodens början (μg/l) SS koncentrationen av fasta ämnen i aktiverat slam (g/l)

7. För korttidstestet plottas logaritmen av procentuell återstående koncentration mot tiden och lutningen på den första delen (10–50 % sönderfall) av grafen motsvarar K1, (pseudo)första ordningens konstant. Konstanten normaliseras med hänsyn till koncentrationen fasta ämnen i slammet genom att dividera lutningen med koncentrationen fasta ämnen i slammet. De rapporterade resultaten måste också innehålla uppgifter om initialkoncentrationen för testkemikalie och suspenderade fasta ämnen, slamretentionstiden, slammatning och slamkälla samt uppgifter om eventuell förhandsexponering för testkemikalien.

Resultatvariation

8. Variationen och andra aspekter rörande bionedbrytningens kinetik diskuterades nyligen vid en SETAC-workshop (7). Dessa studier bör, rapporterade och projekterade, ge en klarare uppfattning om den kinetik som fungerar i vattenreningsverk, och därmed en bättre tolkning av befintliga data och förslag till mer relevanta utformningar av nya testmetoder.

LITTERATUR

1 Nyholm N., Jacobsen B. N., Pedersen B. M., Poulsen O, Dambourg A. och Schultz B. (1992), Removal of micropollutants in laboratory activated sludge reactors. Biodegradability, Wat. Res. 26, s. 339–353.

2 Jacobsen B.N., Nyholm N., Pedersen B.M., Poulsen O. och Ostfeldt P. (1993), Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors under various operating conditions: Sorption, Wat. Res. 27, s. 1505–1510.

3 ISO 14592 (ISO/TC 147/ SC5/ WG4, N264) (1998), Water Quality - Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations in water.

4 Nyholm N., Ingerslev F., Berg U. T., Pedersen J. P. och Frimer-Larsen H. (1996), Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in activated sludge waste water treatment plants using short-term batch experiments and μg/l range spiked concentrations, Chemosphere 33 (5), s. 851–864.

5 Berg U. T. och Nyholm N. (1996), Biodegradability simulation Studies in semi-continuous activated sludge reactors with low (μg/l range) and standard (ppm range) chemical concentrations, Chemosphere 33 (4), s. 711–735.

6 Danish Environmental Protection Agency 1996), Activated sludge biodegradability simulation test, Environmental Project, No. 337, Nyholm, N. Berg, UT, Ingerslev, F. Miljö- och energiministeriet, Köpenhamn.

7 Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997), Workshop at Port Sunlight, UK, Red. Hales S. G., Feitjel T., King H., Fox K. och Verstraete W., 4–6 september 1996, SETAC Europe, Bryssel.

Tillägg 8

Figur 1 Roterande rör

Ordlista:

Planvy

Vy A/B

Drivhjul

Frirullande hjul

Drivmotor

Reduktionsväxel

Inre läpp

Lutningsmekanism

Konisk växel

Figur 2 Flödesschema

DEFINITIONER

Tillägg 1

DEFINITIONER

I denna testmetod gäller följande definitioner:

syntetiskt sediment: rekonstituerat, konstgjort sediment som är en blandning av material avsedda att efterlikna de fysiska beståndsdelarna i naturligt sediment.

överliggande vatten: det vatten som hålls ovanför sedimentet i testkärlet.

porvatten: det vatten som finns i mellanrummen mellan sediment- och jordpartiklar.

spikat sediment: sediment med tillsatt testämne.

testkemikalie: alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.

Tillägg 2

Rekommendationer för odling av Chironomus riparius

1. Chironomus-larver kan odlas i kristalliseringskärl eller stora behållare. Fin kvartssand sprids som ett tunt skikt på cirka 5–10 mm på behållarens botten. Även kiselgur (t.ex. Merck, Art. 8117) har visat sig vara ett lämpligt substrat (det räcker med ett tunt lager på några mm). Lämpligt vatten tillsätts till ett djup på flera cm. Vattennivåerna bör fyllas på efter behov för att ersätta avdunstning och förebygga uttorkning. Vattnet kan vid behov ersättas. Det bör finnas en skonsam luftning. De kärl som innehåller larver bör hållas i en lämplig bur som hindrar vuxna exemplar från att rymma. Buren bör vara tillräckligt stor för att de vuxna exemplaren ska kunna svärma, annars kan kopulation utebli (minimum är cirka 30 × 30 × 30 cm).

2. Burarna ska hållas i rumstemperatur eller ett tempererat utrymme vid 20 ± 2 °C med en ljusperiod på 16 timmar (intensitet ca 1000 lux) och 8 timmar mörker. Det har rapporterats att luftfuktighet under 60 % RH kan hämma reproduktion.

Utspädningsvatten

3. Allt lämpligt naturligt eller syntetiskt vatten kan användas. Ofta används källvatten, avklorerat kranvatten och artificiella medier (t.ex. Elendt M4 eller M7, se nedan). Vattnet måste luftas före användningen. Vid behov kan odlingsvattnet förnyas genom att försiktigt hälla eller sifonera använt vatten från odlingskärlen utan att förstöra larvrören.

Utfodring av larver

4. Chironomus-larverna ges fiskfoder i flingform (Tetra Min®, Tetra Phyll® eller motsvarande patenterat märke), cirka 250 mg per kärl och dag. Fodret kan ges i form av torrt malet pulver eller som suspension i vatten: 1,0 g flingfoder blandas med 20 ml utspädningsvatten till en homogen blandning. Beredningen kan ges med en dosering på cirka 5 ml per kärl och dag (skaka om före användning). Äldre larver kan få en större dos.

5. Utfodringen justeras enligt vattenkvaliteten. Om odlingsmediet blir grumligt bör dosen sänkas. Foderdoseringen måste övervakas noggrant. För liten mängd leder till att larverna emigrerar mot vattenkolumnen och för stor mängd leder till ökad mikrobiell aktivitet och lägre syrekoncentrationer. Båda omständigheterna kan leda till minskad tillväxt.

6. Även celler av vissa grönalger (t.ex. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) kan tillsättas när nya odlingskärl läggs upp.

Utfodring av vuxna exemplar

7. Vissa testutövare har föreslagit att bomullskompresser indränkta i mättad sukroslösning kan användas som foder för vuxna exemplar.

Kläckning

8. Vid 20 ± 2 °C börjar vuxna exemplar kläckas i odlingskärlen efter cirka 13–15 dagar. Hanarna är lätta att känna igen på sina fjäderantenner.

Äggmassor

9. När vuxna exemplar finns i odlingsburen bör alla larver i odlingskärlen kontrolleras tre gånger per vecka för att se om gelatinösa äggmassor har deponerats. Om sådana upptäcks, bör de avlägsnas försiktigt. Äggmassorna överförs till ett litet kärl som innehåller ett prov av odlingsvattnet. De används sedan för att starta nya odlingskärl (t.ex. 2–4 äggmassor per kärl) eller för toxicitetstest.

10. Första stadiets larver bör kläckas efter 2–3 dagar.

Uppläggning av nya odlingskärl

11. När odlingarna är etablerade bör det vara möjligt att lägga upp en färsk larvodling veckovis eller med längre intervall beroende på testningskraven, och avlägsna äldre kärl efter att vuxna myggor har kläckts. På detta sätt fås regelbunden tillgång till vuxna exemplar med minimal insats.

Beredning av testlösningarna M4 och M7

12. M4-mediet upptäcktes av Elendt (1990). M7-mediet bereds på samma sätt som M4-mediet med undantag för de ämnen som anges i tabell 1, för vilka koncentrationerna är fyra gånger lägre i M7 jämfört med M4. En publikation om M7-mediet är under arbete (Elendt, personlig kommunikation). Testlösningen ska inte beredas enligt Elendt och Bias (1990) eftersom de angivna koncentrationerna av NaSiO3·5H2O, NaNO3, KH2PO4 och K2HPO4 inte är lämpliga.

Beredning av M7-medium

13. Varje stamlösning (I) bereds individuellt och en kombinerad stamlösning (II) bereds av dessa stamlösningar (I) (se tabell 1). 50 ml av den kombinerade stamlösningen (II) och de mängder av varje stamlösning med makronäring som anges i tabell 2 och avjoniserat vatten tillsätts upp till 1 liter för att bereda M7-mediet. En stamlösning med vitaminer bereds genom att tillsätta tre vitaminer till avjoniserat vatten enligt tabell 3, och 0,1 ml av den kombinerade vitaminstamlösningen tillsätts till det slutliga M7-mediet strax före användningen (vitaminstamlösningen förvaras djupfryst i små alikvoter). Mediet luftas och stabiliseras.

LITTERATUR

BBA (1995), Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system, redigerat av M. Streloke och H. Köpp. Berlin 1995.

Stamlösningar (I) | Mängd (mg) som byggs upp till 1 liter med avjoniserat vatten | Beredning av kombinerad stamlösning (II): blanda följande mängder (ml) stamlösning (I) och bygg upp till 1 liter med avjoniserat vatten | Slutliga koncentrationer i testlösningarna (mg/l)

M4 | M7 | M4 | M7

H3BO3 | 57190 | 1,0 | 0,25 | 2,86 | 0,715

MnCl2 · 4H2O | 7210 | 1,0 | 0,25 | 0,361 | 0,090

LiCl | 6120 | 1,0 | 0,25 | 0,306 | 0,077

RbCl | 1420 | 1,0 | 0,25 | 0,071 | 0,018

SrCl2 · 6H2O | 3040 | 1,0 | 0,25 | 0,152 | 0,038

NaBr | 320 | 1,0 | 0,25 | 0,016 | 0,004

Na2MoO4 · 2H2O | 1260 | 1,0 | 0,25 | 0,063 | 0,016

CuCl2 · 2H2O | 335 | 1,0 | 0,25 | 0,017 | 0,004

ZnCl2 | 260 | 1,0 | 1,0 | 0,013 | 0,013

CaCl2 · 2H6O | 200 | 1,0 | 1,0 | 0,010 | 0,010

KI | 65 | 1,0 | 1,0 | 0,0033 | 0,0033

Na2SeO3 | 43,8 | 1,0 | 1,0 | 0,0022 | 0,0022

NH4VO3 | 11,5 | 1,0 | 1,0 | 0,00058 | 0,00058

Na2EDTA · 2H2O | 5000 | 20,0 | 5,0 | 2,5 | 0,625

FeSO4 · 7H2O | 1991 | 20,0 | 5,0 | 1,0 | 0,249

Mängd som byggs upp till 1 liter med avjoniserat vatten (mg) | Mängd stamlösning med makronäringsämnen som tillsätts för att bereda medium M4 och M7 (ml/l) | Slutliga koncentrationer i testlösningarna M4 och M7 (mg/l)

CaCl2 · 2H2O | 293800 | 1,0 | 293,8

MgSO4 · 7H2O | 246600 | 0,5 | 123,3

KCl | 58000 | 0,1 | 5,8

NaHCO3 | 64800 | 1,0 | 64,8

NaSiO3 · 9H2O | 50000 | 0,2 | 10,0

NaNO3 | 2740 | 0,1 | 0,274

KH2PO4 | 1430 | 0,1 | 0,143

K2HPO4 | 1840 | 0,1 | 0,184

Mängd som byggs upp till 1 liter med avjoniserat vatten (mg) | Mängd stamlösning med vitaminer som tillsätts för att bereda medium M4 och M7 (ml/l) | Slutliga koncentrationer i testlösningarna M4 och M7 (mg/l)

Tiaminhydroklorid | 750 | 0,1 | 0,075

Cyanokobalamin (B12) | 10 | 0,1 | 0,0010

Biotin | 7,5 | 0,1 | 0,00075

LITTERATUR

Elendt, B. P. (1990), Selenium Deficiency in Crustacean, Protoplasma 154, s. 25–33.

Elendt, B. P. och W. R. Bias (1990), Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna, Water Research 24 (9), s. 1157–1167.

1 Dessa ämnen avviker i M4 och M7, såsom anges ovan.

2 Dessa ämnen bereds individuellt, blandas och autoklaveras omedelbart.

Tillägg 3

BEREDNING AV SYNTETISKT SEDIMENT

Sedimentsammansättning

Syntetiskt sediment ska ha följande sammansättning:

Beståndsdel | Egenskaper | % av sedimentets torrvikt

Torv | Sphagnum, så nära pH 5,5–6 som möjligt utan synliga växtrester och finfördelad (partikelstorlek ≤1 mm) och lufttorkad. | 4–5

Kvartssand | Partikelstorlek: > 50 % av partiklarna bör ha storlek inom området 50–200 μm | 75–76

Kaolinitlera | Kaolinithalt ≥ 30 % | 20

Organiskt kol | Justeras genom tillsats av torv och sand | 2 (± 0,5)

Kalciumkarbonat | CaCO3, pulveriserat, kemiskt rent | 0,05–0,1

Vatten | Konduktivitet ≤ 10 μS/m | 30–50

Beredning

Torven lufttorkas och mals ner till ett fint pulver. En suspension av behövlig mängd torvpulver i avjoniserat vatten bereds med effektiv homogeniseringsapparat. Suspensionens pH justeras till 5,5 ± 0,5 med CaCO3. Suspensionen konditioneras minst två dagar med skonsam omrörning vid 20 ± 2 °C, för att stabilisera pH och etablera en stabil mikrobiell komponent, varefter pH uppmäts på nytt och bör vara 6,0 ± 0,5. Torvsuspensionen blandas sedan med de övriga beståndsdelarna (sand och kaolinlera) och avjoniserat vatten till ett homogent sediment med en vattenhalt som ger kring 30–50 procent torrvikt av sediment. Därefter mäts den slutliga blandningens pH på nytt och justeras vid behov till 6,5–7,5 med CaCO3. Prover tas av sedimentet för att bestämma torrvikten och halten organiskt kol. Likaså rekommenderas att det syntetiska sediment som ska användas i ett chironomidtoxicitetstest konditioneras före användningen i sju dagar i samma betingelser som råder i det efterföljande testet.

Förvaring

De torra beståndsdelarna för beredning av syntetiskt sediment kan lagras i ett torrt och svalt utrymme vid rumstemperatur. Berett (vått) sediment ska inte lagras för användning i test. Det bör användas omedelbart efter den 7 dagar långa konditioneringsperioden i slutet av beredningen.

LITTERATUR

Kapitel C.8 i denna bilaga, Toxicitet hos daggmaskar.

Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998), Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media, Ecotox. and Environ. Safety 39, s. 10–20.

Tillägg 4

Ämne | Koncentrationer

Partikelinnehåll | < 20 mg/l

Totalt organiskt kol | < 2 mg/l

Ojoniserad ammoniak | < 1 μg/l

Hårdhet som CaCO3 | < 400 mg/l

Restklor | < 10 μg/l

Bekämpningsmedel med organiska fosforföreningar, totalt. | < 50 ng/l

Bekämpningsmedel med organiska klorföreningar plus polyklorerade bifenyler, totalt. | < 50 ng/l

Totalt organiskt klor | < 25 ng/l

1 Här bör noteras att om man misstänker växelverkan mellan hårdhetsjoner och testämnet, bör vatten med lägre hårdhet användas (och i en sådan situation får Elendt Medium M4 inte användas).

Tillägg 5

Vägledning för övervakning av kläckning av chironomider

Fällor placeras på testbägarna. Dessa fällor behövs från dag 20 fram till testets slut. Exempel på en fälla visas nedan.

Tillägg 1

DEFINITIONER

I denna testmetod gäller följande definitioner:

syntetiskt sediment: rekonstituerat, konstgjort sediment som är en blandning av material avsedda att efterlikna de fysiska beståndsdelarna i naturligt sediment.

överliggande vatten: det vatten som hålls ovanför sedimentet i testkärlet.

porvatten: det vatten som finns i mellanrummen mellan sediment- och jordpartiklar.

spikat sediment: sediment med tillsatt testämne.

testkemikalie: alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.

Tillägg 2

Rekommendationer för odling av Chironomus riparius

1. Chironomus-larver kan odlas i kristalliseringskärl eller stora behållare. Fin kvartssand sprids som ett tunt skikt på cirka 5–10 mm på behållarens botten. Även kiselgur (t.ex. Merck, Art. 8117) har visat sig vara ett lämpligt substrat (det räcker med ett tunt lager på några mm). Lämpligt vatten tillsätts till ett djup på flera cm. Vattennivåerna bör fyllas på efter behov för att ersätta avdunstning och förebygga uttorkning. Vattnet kan vid behov ersättas. Det bör finnas en skonsam luftning. De kärl som innehåller larver bör hållas i en lämplig bur som hindrar vuxna exemplar från att rymma. Buren bör vara tillräckligt stor för att de vuxna exemplaren ska kunna svärma, annars kan kopulation utebli (minimum är cirka 30 × 30 ×30 cm).

2. Burarna ska hållas i rumstemperatur eller ett tempererat utrymme vid 20 ± 2 °C med en ljusperiod på 16 timmar (intensitet ca 1000 lux) och 8 timmar mörker. Det har rapporterats att luftfuktighet under 60 % RH kan hämma reproduktion.

Utspädningsvatten

3. Allt lämpligt naturligt eller syntetiskt vatten kan användas. Ofta används källvatten, avklorerat kranvatten och artificiella medier (t.ex. Elendt M4 eller M7, se nedan). Vattnet måste luftas före användningen. Vid behov kan odlingsvattnet förnyas genom att försiktigt hälla eller sifonera använt vatten från odlingskärlen utan att förstöra larvrören.

Utfodring av larver

4. Chironomus-larverna ges fiskfoder i flingform (Tetra Min®, Tetra Phyll® eller motsvarande patenterat märke), cirka 250 mg per kärl och dag. Fodret kan ges i form av torrt malet pulver eller som suspension i vatten: 1,0 g flingfoder blandas med 20 ml utspädningsvatten till en homogen blandning. Beredningen kan ges med en dosering på cirka 5 ml per kärl och dag (skaka om före användning). Äldre larver kan få en större dos.

5. Utfodringen justeras enligt vattenkvaliteten. Om odlingsmediet blir grumligt bör dosen sänkas. Foderdoseringen måste övervakas noggrant. För liten mängd leder till att larverna emigrerar mot vattenkolumnen och för stor mängd leder till ökad mikrobiell aktivitet och lägre syrekoncentrationer. Båda omständigheterna kan leda till minskad tillväxt.

6. Även celler av vissa grönalger (t.ex. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) kan tillsättas när nya odlingskärl läggs upp.

Utfodring av vuxna exemplar

7. Vissa testutövare har föreslagit att bomullskompresser indränkta i mättad sukroslösning kan användas som foder för vuxna exemplar.

Kläckning

8. Vid 20 ± 2 °C börjar vuxna exemplar kläckas i odlingskärlen efter cirka 13–15 dagar. Hanarna är lätta att känna igen på sina fjäderantenner.

Äggmassor

9. När vuxna exemplar finns i odlingsburen bör alla larver i odlingskärlen kontrolleras tre gånger per vecka för att se om gelatinösa äggmassor har deponerats. Om sådana upptäcks, bör de avlägsnas försiktigt. Äggmassorna överförs till ett litet kärl som innehåller ett prov av odlingsvattnet. De används sedan för att starta nya odlingskärl (t.ex. 2–4 äggmassor per kärl) eller för toxicitetstest.

10. Första stadiets larver bör kläckas efter 2–3 dagar.

Uppläggning av nya odlingskärl

11. När odlingarna är etablerade bör det vara möjligt att lägga upp en färsk larvodling veckovis eller med längre intervall beroende på testningskraven, och avlägsna äldre kärl efter att vuxna myggor har kläckts. På detta sätt fås regelbunden tillgång till vuxna exemplar med minimal insats.

Beredning av testlösningarna M4 och M7

12. M4-mediet upptäcktes av Elendt (1990). M7-mediet bereds på samma sätt som M4-mediet med undantag för de ämnen som anges i tabell 1, för vilka koncentrationerna är fyra gånger lägre i M7 jämfört med M4. En publikation om M7-mediet är under arbete (Elendt, personlig kommunikation). Testlösningen ska inte beredas enligt Elendt och Bias (1990) eftersom de angivna koncentrationerna av NaSiO3·5H2O, NaNO3, KH2PO4 och K2HPO4 inte är lämpliga.

Beredning av M7-medium

13. Varje stamlösning (I) bereds individuellt och en kombinerad stamlösning (II) bereds av dessa stamlösningar (I) (se tabell 1). Femtio ml av den kombinerade stamlösningen (II) och de mängder av varje stamlösning med makronäring som anges i tabell 2 och avjoniserat vatten tillsätts upp till 1 liter för att bereda M7-mediet. En stamlösning med vitaminer bereds genom att tillsätta tre vitaminer till avjoniserat vatten enligt tabell 3, och 0,1 ml av den kombinerade vitaminstamlösningen tillsätts till det slutliga M7-mediet strax före användningen (vitaminstamlösningen förvaras djupfryst i små alikvoter). Mediet luftas och stabiliseras. Tabell 1 Stamlösningar av spårelement för M4- och M7-medium Stamlösningar (I) Mängd (mg) som byggs upp till 1 liter med avjoniserat vatten Beredning av kombinerad stamlösning (II): blanda följande mängder (ml) stamlösning (I) och bygg upp till 1 liter med avjoniserat vatten Slutliga koncentrationer i testlösningarna (mg/l) M4 M7 M4 M7 H3BO3 57190 1,0 0,25 2,86 0,715 MnCl2 · 4H2O 7210 1,0 0,25 0,361 0,090 LiCl 6120 1,0 0,25 0,306 0,077 RbCl 1420 1,0 0,25 0,071 0,018 SrCl2 · 6H2O 3040 1,0 0,25 0,152 0,038 NaBr 320 1,0 0,25 0,016 0,004 Na2MoO4 · 2H2O 1260 1,0 0,25 0,063 0,016 CuCl2 · 2H2O 335 1,0 0,25 0,017 0,004 ZnCl2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 CaCl2 · 2H6O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na2SeO3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 NH4VO3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 Na2EDTA · 2H2O 5000 20,0 5,0 2,5 0,625 FeSO4 · 7H2O 1991 20,0 5,0 1,0 0,249 Tabell 2 Stamlösningar med makronäringsämnen för medium M4 och M7 Mängd som byggs upp till 1 liter med avjoniserat vatten (mg) Mängd stamlösning med makronäringsämnen som tillsätts för att bereda medium M4 och M7 (ml/l) Slutliga koncentrationer i testlösningarna M4 och M7 (mg/l) CaCl2 · 2H2O 293800 1,0 293,8 MgSO4 · 7H2O 246600 0,5 123,3 KCl 58000 0,1 5,8 NaHCO3 64800 1,0 64,8 NaSiO3 · 9H2O 50000 0,2 10,0 NaNO3 2740 0,1 0,274 KH2PO4 1430 0,1 0,143 K2HPO4 1840 0,1 0,184 Tabell 3 Stamlösningar med vitaminer för medium M4 och M7 Alla tre vitaminlösningar kombineras till en enda vitaminstamlösning. Mängd som byggs upp till 1 liter med avjoniserat vatten (mg) Mängd stamlösning med vitaminer som tillsätts för att bereda medium M4 och M7 (ml/l) Slutliga koncentrationer i testlösningarna M4 och M7 (mg/l) Tiaminhydroklorid 750 0,1 0,075 Cyanokobalamin (B12) 10 0,1 0,0010 Biotin 7,5 0,1 0,00075

LITTERATUR

BBA (1995), Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system, redigerat av M. Streloke och H. Köpp. Berlin 1995.

Elendt, B. P. (1990), Selenium Deficiency in Crustacean, Protoplasma 154, s. 25–33.

Elendt B. P. och Bias W. R.(1990), Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna, Water Research 24 (9), s. 1157–1167.

1 Dessa ämnen avviker i M4 och M7, såsom anges ovan.

2 Dessa ämnen bereds individuellt, blandas och autoklaveras omedelbart.

Tillägg 3

BEREDNING AV SYNTETISKT SEDIMENT

Sedimentsammansättning

Syntetiskt sediment ska ha följande sammansättning:

Beståndsdel | Egenskaper | % av sedimentets torrvikt

Torv | Sphagnum, så nära pH 5,5–6 som möjligt utan synliga växtrester och finfördelad (partikelstorlek ≤1 mm) och lufttorkad. | 4–5

Kvartssand | Partikelstorlek: > 50 % av partiklarna bör ha storlek inom området 50–200 μm | 75–76

Kaolinitlera | Kaolinithalt ≥ 30 % | 20

Organiskt kol | Justeras genom tillsats av torv och sand | 2 (± 0,5)

Kalciumkarbonat | CaCO3, pulveriserat, kemiskt rent | 0,05–0,1

Vatten | Konduktivitet ≤ 10 μS/m | 30–50

Beredning

Torven lufttorkas och mals ner till ett fint pulver. En suspension av behövlig mängd torvpulver i avjoniserat vatten bereds med effektiv homogeniseringsapparat. Suspensionens pH justeras till 5,5 ± 0,5 med CaCO3. Suspensionen konditioneras minst två dagar med skonsam omrörning vid 20 ± 2 °C, för att stabilisera pH och etablera en stabil mikrobiell komponent, varefter pH uppmäts på nytt och bör vara 6,0 ± 0,5. Torvsuspensionen blandas sedan med de övriga beståndsdelarna (sand och kaolinlera) och avjoniserat vatten till ett homogent sediment med en vattenhalt som ger kring 30–50 procent torrvikt av sediment. Därefter mäts den slutliga blandningens pH på nytt och justeras vid behov till 6,5–7,5 med CaCO3. Prover tas av sedimentet för att bestämma torrvikten och halten organiskt kol. Likaså rekommenderas att det syntetiska sediment som ska användas i ett chironomidtoxicitetstest konditioneras före användningen i sju dagar i samma betingelser som råder i det efterföljande testet.

Förvaring

De torra beståndsdelarna för beredning av syntetiskt sediment kan lagras i ett torrt och svalt utrymme vid rumstemperatur. Berett (vått) sediment ska inte lagras för användning i test. Det bör användas omedelbart efter den 7 dagar långa konditioneringsperioden i slutet av beredningen.

LITTERATUR:

Kapitel C.8 i denna bilaga, Toxicitet hos daggmaskar.

Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998), Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media, Ecotox. and Environ. Safety 39, s. 10–20.

Tillägg 4

Ämne | Koncentrationer

Partikelinnehåll | < 20 mg/l

Totalt organiskt kol | < 2 mg/l

Ojoniserad ammoniak | < 1 μg/l

Hårdhet som CaCO3 | < 400 mg/l

Restklor | < 10 μg/l

Bekämpningsmedel med organiska fosforföreningar, totalt. | < 50 ng/l

Bekämpningsmedel med organiska klorföreningar plus polyklorerade bifenyler, totalt. | < 50 ng/l

Totalt organiskt klor | < 25 ng/l

1 Här bör noteras att om man misstänker växelverkan mellan hårdhetsjoner och testämnet, bör vatten med lägre hårdhet användas (och i en sådan situation får Elendt Medium M4 inte användas).

Tillägg 5

Vägledning för övervakning av kläckning av chironomider

Fällor placeras på testbägarna. Dessa fällor behövs från dag 20 fram till testets slut. Exempel på en fälla visas nedan.

Tillägg 1

FÖRKORTNINGAR OCH DEFINITIONER

Tillägg 2

Exempel på en bionedbrytningskurva

Figur 1 Biologisk nedbrytning av 1-oktanol i CO2 Headspace-test

Ordlista:

Bionedbrytning

Nedbrytningsfas

Maximal bionedbrytning

Platåfas

Tiodagarsfönster

Testningstid (dagar)

Tillägg 1

DEFINITIONER

bioackumulering: ökningen av testkemikaliens koncentration i eller på en organism i förhållande till testkemikaliens koncentration i det omgivande mediet. Bioackumulering uppstår till följd av både biokoncentrations- och biomagnifieringsprocesser (se nedan).

biokoncentration: ökningen av testkemikaliens koncentration i eller på en organism till följd av upptagning av kemikalien som endast sker från det omgivande mediet (t.ex. via kroppsytan och förtärd jord) i förhållande till testkemikaliens koncentration i det omgivande mediet.

biomagnifiering: ökningen av testkemikaliens koncentration i eller på en organism, främst till följd av upptagning från förorenad föda eller förorenat byte, i förhållande till testkemikaliens koncentration i födan eller bytet. Biomagnifiering kan leda till överföring eller ackumulering av testämnet inom näringsvävar.

eliminering: eliminering av en testkemikalie betyder att kemikalien avlägsnas från testorganismens vävnad genom aktiva eller passiva processer som inträffar oberoende av om testämnet finns eller inte finns i det omgivande mediet.

bioackumuleringsfaktor (BAF): den koncentration av testkemikalien under valfri tidpunkt under upptagningsfasen som förekommer i eller på testorganismen (Ca uttryckt som g per kg torrvikt mask) dividerad med testkemikaliens koncentration i det omgivande mediet (Cs uttryckt som g per kg torrvikt jord); BAF uttrycks med enheten kg jord per kg mask.

bioackumuleringsfaktor vid stabilt tillstånd (BAFss): den BAF som gäller vid stabilt tillstånd och som inte förändras betydligt över en längre tidsperiod medan koncentrationen av testkemikalie i det omgivande mediet (Cs uttryckt som g per kg torrvikt jord) är konstant under denna tidsperiod.

kinetisk bioackumuleringsfaktor (BAFK): de bioackumuleringsfaktorer som beräknas direkt från förhållandet mellan upptagningskonstant och elimineringskonstant (ks och ke, se nedan).

bioackumuleringsfaktor biota-jord (BSAF): den fettnormaliserade koncentrationen av testkemikalien i eller på testorganismen dividerad med den organiskt kol-normaliserade koncentrationen av testkemikalien vid stabilt tillstånd. Ca uttrycks som g per kg fettinnehåll i organismen och Cs som g per kg organiskt innehåll i jorden; BSAF har enheten kg organiskt kol per kg fett.

platå eller stabilt tillstånd: jämvikt råder mellan upptagnings- och elimineringsprocesser som inträffar samtidigt under exponeringsfasen. Stabilt tillstånd syns i kurvan över BAF mot tiden när kurvan blir parallell med tidsaxeln och tre på varandra följande analyser av BAF på prover som tagits med minst två dagars mellanrum ligger inom 20 % från varandra, och det inte finns några statistiskt signifikanta skillnader mellan de tre provtagningsperioderna. För testkemikalier som tas upp långsamt är det lämpligare med ett intervall på sju dagar (49).

fördelningskoefficienten organiskt kol-vatten (Koc): förhållandet mellan en kemikalies koncentration i eller på jordens fraktion av organiskt kol och kemikaliens koncentration i vatten vid jämvikt.

fördelningskoefficienten oktanol-vatten (Kow): förhållandet mellan en kemikalies löslighet i n-oktanol och i vatten vid jämvikt; uttrycks även som Pow. Logaritmen av Kow (log Kow) används som indikator för en kemikalies potential för bioackumulering i vattenlevande organismer.

upptagnings- eller exponeringsfasen: den tid under vilken testorganismerna är exponerade för testkemikalien.

upptagningskonstant (ks): ett numeriskt värde som definierar hur snabbt koncentrationen av testämnet ökar i eller på testorganismen till följd av upptagning från jordfasen; ks uttrycks som g jord per kg mask per dag.

elimineringsfas: den tid efter överföringen av testorganismerna från ett förorenat medium till ett medium som inte innehåller testämne, under vilken eliminering (eller nettoförlust) av kemikalien från testorganismerna studeras.

elimineringskonstant (ke): det numeriska värde som definierar reduktionshastigheten för koncentrationen av testämne i eller på testorganismen efter överföring av testorganismerna från ett medium som innehåller testämnet till ett medium som inte innehåller testämnet; ke uttrycks som d-1.

testkemikalie: alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.

Tillägg 2

Beräkning av upptagnings- och elimineringsparametrar

Den huvudsakliga endpointen för ett bioackumuleringstest är bioackumuleringsfaktorn BAF. Uppmätt BAF kan beräknas genom att dividera koncentrationen i testorganismen Ca med koncentrationen i jorden Cs vid stabilt tillstånd. Om stabilt tillstånd inte uppnås under upptagningsfasen beräknas BAFK utifrån konstanterna i stället för utifrån BAFSS. Det bör dock finnas en anmärkning om huruvida BAF är baserat på koncentrationer vid stabilt tillstånd eller inte.

Den vanliga metoden för att få fram kinetisk bioackumuleringsfaktor (BAFK), upptagningskonstant (ks) och elimineringskonstant (ke) är att använda icke-linjära datorbaserade parameteruppskattningsmetoder, t.ex. baserade på de modeller som beskrivs i (68). Utifrån en viss uppsättning sekventiella tid-koncentrationsdata och modellekvationerna

C a k s k e C s 1 e –ke t | 0 < t < tc | (ekvation 1)

eller

C a k s k e C s e –ke t tc e –ke t | t > tc | (ekvation 2)

där

beräknar dessa datorprogram värden för BAFK, ks och ke.

Om bakgrundskoncentrationen i icke-exponerade maskar t.ex. på dag 0 avviker betydligt från noll (kan vara fallet t.ex. för metaller) bör denna bakgrundskoncentration Ca,0 införlivas i ekvationerna, enligt följande:

C a C a,0 k s k e C s 1 e –ke t | 0 < t < tc | (ekvation 3)

och

C a C a,0 k s k e C s e –ke t tc e –ke t | t > tc | (ekvation 4)

Om en signifikant minskning av testkemikaliekoncentrationen i jorden kan observeras över tid under upptagningsfasen, kan följande modeller användas, t.ex. (67) (79):

C s C 0 e –k 0t | (ekvation 5)

där

C a k s k e k 0 e –k 0t e –ke t | 0 < t < tc | (ekvation 6)

C a k s k e k 0 e –k 0tc e –ke tc*e k t tc | t > tc | (ekvation 7)

där

Om stabilt tillstånd nås under upptagningsfasen (t.ex. t = ∞) kan ekvation 1

C a k s k e C s 1 e –ke t | 0 < t < tc | (ekvation 1)

reduceras till

eller

C a C s k s k e BAF K | (ekvation 8).

Då är ks/ke x Cs en tillnärmning av testämneskoncentrationen i maskvävnad vid stabilt tillstånd (Ca,ss).

Ackumuleringsfaktorn biota-jord (BSAF) kan beräknas enligt följande:

BSAF BAF K* f oc f lip | (ekvation 9)

där foc är fraktionen organiskt kol i jorden och flip är fraktionen fett i maskar, båda helst bestämda på prover som tagits i testet och på grundval av torrvikt eller våtvikt.

Elimineringskinetiken kan modelleras med stöd av data från elimineringsfasen och med tillämpning av följande modellekvation och en datorstödd icke-linjär metod för modelluppskattning. Om datapunkterna plottade mot tiden indikerar en konstant exponentiell minskning av testämneskoncentrationen i djuren, kan en one-compartment-modell (ekvation 9) användas för att beskriva elimineringens tidsförlopp.

C a t C a,ss e –ke t | (ekvation 10)

Elimineringsprocesserna verkar i bland ha två faser med en snabb minskning av Ca till en början och därefter en långsammare avgång av testämne senare under elimineringen, t.ex. (27) (68). De två faserna kan tolkas genom antagande om att det finns två olika enheter i organismen från vilka testämnet avgår med olika hastigheter. I sådana fall bör information inhämtas från specifik litteratur, t.ex. (38) (39) (40) (78).

Med användning av modellekvationerna ovan kan de kinetiska parametrarna ks och ke även kalkyleras i ett steg genom att samtidigt tillämpa modeller för första ordningens kinetik på alla data från både upptagnings- och elimineringsfasen. Beskrivning av en metod som ger möjlighet till en sådan kombinerad beräkning av upptagnings- och elimineringskonstanter kan sökas i hänvisningarna (41), (73) och (70).

C a K s K e C s 1 e –k et m 1 K s k e C s e K e t t c e –K et m 2 | (ekvation 11)

Anmärkning: När upptagnings- och elimineringsparametrar uppskattas samtidigt utifrån kombinerade upptagnings- -och elimineringsdata är m såsom visas i ekvation 11 en deskriptor som gör det möjligt för datorprogrammet att tilldela ekvationens subtermer till datauppsättningarna för respektive fas och göra utvärderingen korrekt (m = 1 för upptagningsfasen och m = 2 för elimineringsfasen).

Dessa modellekvationer bör dock användas med försiktighet, särskilt när det sker ändringar i testkemikaliens biotillgänglighet eller om (bio)nedbrytning sker under testet (se t.ex. (79)).

Tillägg 3

EXEMPEL PÅ SCHEMAN FÖR TEST AV BIOACKUMULERING FRÅN JORDAR

Test med daggmaskar

a) Upptagningsfas med 8 provtagningsdatum som används för beräkning av kinetik. Dag Aktivitet – 6 Konditionering av förberedd jord under 48 timmar. – 4 Spikning av jordfraktionen med testkemikalielösning, avdunstning av eventuellt lösningsmedel, blandning av jordbeståndsdelarna, fördelning av jord i testkärlen och stabilisering till jämvikt under testbetingelserna i 4 dagar (3 veckor för metallspikad jord). – 3 till – 1 Separation av testorganismerna från odlingen för acklimatisering, beredning och fuktning av jordbeståndsdelarna. 0 Mätning av temperatur och jordens pH, avlägsnande av jordprover från behandlade kärl och lösningsmedelskontroller för bestämning av testkemikaliens koncentration, tillsats av föda, vägning och slumpvis fördelning av maskarna till testkärlen med bibehållande av tillräckligt antal maskar för bestämning av analytiska bakgrundsvärden, våt- och torrvikt och fettinnehåll, vägning av alla testkärl för kontroll av jordens fukthalt och kontroll av lufttillförsel om stängda testsystem används. 1 Kontroll av lufttillförsel, registrering av maskarnas beteende och temperatur samt tagning av jord- och maskprover för bestämning av koncentrationen testämne. 2 Samma som dag 1. 3 Kontroll av lufttillförsel, maskarnas beteende och temperatur. 4 Samma som dag 1. 5–6 Samma som dag 3. 7 Samma som dag 1: tillförsel av föda, kontroll av jordens fukthalt genom vägning av testkärlen och vattenpåfyllnad motsvarande avdunstningen. 8–9 Samma som dag 3. 10 Samma som dag 1. 11–13 Samma som dag 3. 14 Samma som dag 1: tillförsel av föda, kontroll av jordens fukthalt genom vägning av testkärlen och vattenpåfyllnad motsvarande avdunstningen. 15–16 Samma som dag 3. 17 Samma som dag 1. 18–20 Samma som dag 3. 21 Samma som dag 1: mätning av temperatur och jordens pH, kontroll av jordens fukthalt genom vägning av testkärlen, slut på upptagningsfasen, överföring av maskarna från återstående exponerade replikat till kärl som innehåller ren jord för elimineringsfasen (ingen tarmtömning) samt provtagning av jord och maskar från lösningsmedelskontrollerna. Aktiviteterna före exponering (stabiliseringsfasen) bör tidplaneras med beaktande av testkemikaliens egenskaper. Aktiviteterna för dag 3 bör genomföras dagligen (åtminstone på arbetsdagar).

b) Elimineringsfas Dag Aktivitet – 6 Beredning och fuktning av jordens beståndsdelar samt konditionering av beredd jord i 48 timmar. – 4 Blandning av jordens beståndsdelar, fördelning av jord till testkärlen och inkubation under testbetingelserna i 4 dagar. 0 (upptagningsfasens slut) Mätning av temperatur och jordens pH, vägning och slumpmässig fördelning av maskar till testkärlen, tillförsel av föda, överföring av maskar från återstående exponerade replikat till kärl som innehåller ren jord samt tagning av jord- och maskprover efter 4–6 timmar för bestämning av testkemikaliens koncentration. 1 Kontroll av lufttillförsel, registrering av maskarnas beteende och temperatur samt tagning av jord- och maskprover för bestämning av testkemikaliens koncentration. 2 Samma som dag 1. 3 Kontroll av lufttillförsel, maskarnas beteende och temperatur. 4 Samma som dag 1. 5–6 Samma som dag 3. 7 Samma som dag 1: tillförsel av föda, kontroll av jordens fukthalt genom vägning av testkärlen och vattenpåfyllnad motsvarande avdunstningen. 8–9 Samma som dag 3. 10 Samma som dag 1. 11–13 Samma som dag 3. 14 Samma som dag 1: tillförsel av föda, kontroll av jordens fukthalt genom vägning av testkärlen och vattenpåfyllnad motsvarande avdunstningen. 15–16 Samma som dag 3. 17 Samma som dag 1. 18–20 Samma som dag 3. 21 Samma som dag 1: mätning av temperaturen och jordens pH, kontroll av jordens fuktighet genom vägning av testkärlen samt tagning av jord- och maskprover från lösningsmedelskontrollerna. Beredning av jorden före elimineringsfasens början bör göras på samma sätt som beredningen före upptagningsfasen. Aktiviteterna för dag 3 bör genomföras dagligen (åtminstone på arbetsdagar).

Test med enchytraeider

a) Upptagningsfas med 8 provtagningsdatum som används för beräkning av kinetik. Dag Aktivitet – 6 Konditionering av förberedd jord under 48 timmar. – 4 Spikning av jordfraktionen med testkemikalielösning, avdunstning av eventuellt lösningsmedel, blandning av jordbeståndsdelarna, fördelning av jord i testkärlen och stabilisering till jämvikt i testbetingelserna i 4 dagar (3 veckor för metallspikad jord). – 3 till – 1 Separation av testorganismerna från odlingen för acklimatisering, beredning och fuktning av jordbeståndsdelarna. 0 Mätning av temperatur och jordens pH, avlägsnande av jordprover från behandlade kärl och lösningsmedelskontroller för bestämning av testkemikaliens koncentration, tillsats av föda till jorden, vägning och slumpvis fördelning av maskarna till testkärlen med bibehållande av tillräckligt antal maskar för bestämning av analytiska bakgrundsvärden, våt- och torrvikt och fettinnehåll, vägning av alla testkärl för kontroll av jordens fukthalt och kontroll av lufttillförsel om stängda testsystem används. 1 Kontroll av lufttillförsel, registrering av maskarnas beteende och temperatur samt tagning av jord- och maskprover för bestämning av koncentrationen testämne. 2 Samma som dag 1. 3 Kontroll av lufttillförsel, maskarnas beteende och temperatur. 4 Samma som dag 1. 5–6 Samma som dag 3. 7 Samma som dag 1: tillförsel av föda till jorden, kontroll av jordens fukthalt genom vägning av testkärlen och vattenpåfyllnad motsvarande avdunstningen. 9 Samma som dag 1. 10 Samma som dag 3. 11 Samma som dag 1. 12–13 Samma som dag 3. 14 Samma som dag 1: tillförsel av föda till jorden, mätning av temperaturen och jordens pH, kontroll av jordens fukthalt genom vägning av testkärlen; slut på upptagningsfasen; överföring av maskarna från återstående exponerade replikat till kärl som innehåller ren jord för elimineringsfasen (ingen tarmtömning) samt provtagning av jord och maskar från lösningsmedelskontrollerna. Aktiviteterna före exponering (stabiliseringsfasen) bör tidplaneras med beaktande av testkemikaliens egenskaper. Aktiviteterna för dag 3 bör genomföras dagligen (åtminstone på arbetsdagar).

Tillägg 4

Syntetisk jord – rekommendationer för beredning och lagring

Eftersom naturjordar från en viss källa inte alltid finns att tillgå under hela året, och ingående organismer och mikroföroreningar kan påverka testet, rekommenderas syntetiskt substrat, syntetisk jord enligt kapitel C.8 i denna bilaga, Toxicitet för daggmaskar (48), för användning i detta test. Flera olika testarter kan överleva, växa och föröka sig i denna jord, och den ger också maximal standardisering såväl som jämförbarhet inom och mellan laboratorier och odlingsbetingelser.

Jordens beståndsdelar

Torv: | 10 % | Sphagnum-torv, enligt OECD:s riktlinje 207 (48)

Kvartssand: | 70 % | Industriell kvartssand (lufttorkad), minst 50 % av partiklarna bör ha en storlek inom området 50–200 μm, men alla partiklar bör vara ≤ 2 mm

Kaolinitlera: | 20 % | Kaolinithalt ≥ 30 %

Kalciumkarbonat: | ≤ 1 % | CaCO3, pulveriserat, kemiskt rent

Alternativt kan jordens organiska kolhalt minskas, t.ex. genom att sänka torvhalten till 4–5 % av torrjord och öka sandhalten i motsvarande grad. Med en sådan minskning av halten organiskt kol kan möjligheterna till adsorption av testkemikalien till jorden (organiskt kol) minskas, och då blir testkemikalien bättre tillgänglig för maskarna (74). Det har demonstrerats att Enchytraeus albidus och Eisenia fetida kan uppfylla validitetskriterierna för reproduktion vid testning i fältjordar med lägre halt organiskt kol, t.ex. 2,7 % (33), (61), och det finns erfarenheter som visar att detta också kan uppnås i syntetisk jord med 5 % torv.

Beredning

Jordens torra beståndsdelar blandas omsorgsfullt (t.ex. i en storskalig laboratorieblandare). Detta bör göras cirka en vecka innan testet inleds. De blandade torra jordbeståndsdelarna bör fuktas med avjoniserat vatten minst 48 timmar före applicering av testämnet för att nå surhetsjämvikt. För bestämning av pH används en blandning av jord och 1 M lösning av KCl i förhållandet 1:5. Om pH-värdet inte ligger inom rekommenderat område (6,0 ± 0,5) bör tillräcklig mängd CaCO3 tillföras jorden eller så måste en ny sats jord beredas.

Den syntetiska jordens maximala vattenhållningskapacitet (WHC) bestäms enligt ISO 11268-2 (35). Minst två dagar innan testet inleds fuktas den torra syntetiska jorden med tillräcklig mängd avjoniserat eller rekonstituerat vatten till en vattenhalt som motsvarar cirka hälften av den slutliga vattenhalten. Den slutliga vattenhalten bör vara cirka 40–60 % av maximal vattenhållningskapacitet (WHC). Vid teststart ska den förhandsfuktade jorden delas upp i lika många delar som antalet testkoncentrationer och kontroller som används för testet, och fukthalten justeras till 40–60 % av WHCmax genom användning av en lösning av testämnet och/eller genom tillförsel av avjoniserat eller rekonstituerat vatten. Fukthalten bestäms i början och i slutet av testet (vid 105 °C). Fukthalten bör vara optimal för den art som testas (fukthalten kan också kontrolleras genom att försiktigt krama jorden i handen och då bör det komma fram små vattendroppar mellan fingrarna).

Förvaring

De torra beståndsdelarna av syntetisk jord kan förvaras i rumstemperatur fram till användningen. Den förberedda förfuktade jorden kan förvaras i svalt utrymme i upp till tre dagar före spikningen, och vattenavdunstningen bör minimeras. Jord som spikats med testämne bör användas omedelbart, med undantag för om det finns information om att jorden i fråga kan förvaras utan att testämnets toxicitet och biotillgänglighet påverkas. Prover av spikad jord kan sedan förvaras i de förhållanden som rekommenderas för testsystemet i fråga fram till analys.

Tillägg 5

Arter av jordlevande oligochaeter som rekommenderas för testning av bioackumulering från jord

Daggmaskar

Rekommenderad testart är Eisenia fetida (Savigny 1826), som tillhör familjen Lumbricidae. Från och med 1972 är den uppdelad i två underarter (Eisenia fetida och Eisenia andrei (10)). Enligt Jaenike (36) är dessa äkta, separata arter. Eisenia fetida känns lätt igen genom de klargula banden mellan segmenten medan Eisenia andrei har en enhetlig mörkröd färg. De härstammar sannolikt från Svartahavsregionen och finns numera över hela världen, särskilt i antropogent modifierade livsmiljöer såsom komposthögar. Båda kan användas för både ekotoxikologiska test och bioackumuleringstest.

Eisenia fetida och Eisenia andrei säljs allmänt på marknaden, t.ex. som fiskbete. Jämfört med andra daggmaskar (familjen Lumbricidae) har de en kort livscykel och når vuxenstadiet inom cirka 2–3 månader (vid rumstemperatur). Den optimala temperaturen för dessa daggmaskar ligger kring 20–24 °C. De föredrar relativt fuktiga substrat med nästan neutralt pH och en hög halt av organiskt material. Dessa arter har använts i stor utsträckning i standardiserade ekologiska tester i cirka 25 år och odling av dem är därför väl etablerad (48) (77).

Båda arterna kan odlas i ett stort urval djuravfall. Som odlingsmedium rekommenderas enligt ISO (35) en 50/50-blandning av häst- eller boskapsgödsel och torv. Mediet bör ha pH på cirka 6–7 (reglerat med kalciumkarbonat), låg jonisk konduktivitet (lägre än 6 mS/cm eller en salthalt under 0,5 %) bör inte ha för hög halt av ammoniak eller animaliskt urin. Likaså kan man använda kommersiell trädgårdsjord fri från tillsatser eller syntetisk jord enligt OECD (48) eller en 50/50-blandning av båda. Substratet bör vara fuktigt men inte för vått. Lämplig storlek på odlingslådorna är 10–50 liter.

För att få maskar med standardålder och standardmassa är det bäst att inleda odlingen med kokonger. För detta tillsätts vuxna maskar till en odlingslåda med färskt substrat för att de ska producera kokonger. Erfarenheterna har visat att en populationsdensitet på cirka 100 vuxna maskar per kg substrat (våtvikt) ger goda förökningsnivåer. Efter 28 dagar avlägsnas de vuxna maskarna. Daggmaskarna som kläckts ur kokonger används för testning när de har nått vuxenstadium efter minst 2 månader men högst 12 månader.

Maskar av de arter som beskrivs ovan kan anses vara friska om de rör sig genom substratet, inte försöker lämna substratet och förökar sig kontinuerligt. Mycket långsamma rörelser eller gul bakre del (i fråga om Eisenia fetida) tyder på utarmat substrat. Då rekommenderas färskt substrat och/eller mindre antal djur per låda.

Valda ytterligare hänvisningar

Gerard B. M. (1964), Synopsis of the British fauna, nr 6 Lumbricidae, Linnean Soc. London, 6, s. 1–58.

Graff O. (1953), Die Regenwürmer Deutschlands, Schr. Forsch. Anst. Landwirtsch. 7, s. 1–81.

Römbke J. E., Egeler P., Füll C. (1997), Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium, Bericht für das UBA, F + E 206 03 909, 86 S.

Rundgren S. (1977), Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden, Oikos 28, s. 49–55.

Satchell J. E. (1955), Some aspects of earthworm ecology, Soil Zoology (Kevan), s. 180–201.

Sims R. W. och Gerard B. M. (1985), A synopsis of the earthworms, Linnean Soc. London, 31, s. 1–171.

Tomlin A. D. (1984), The earthworm bait market in North America, ingår i Earthworm Ecology - from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (red.), Chapman & Hall, London, s. 331–338.

Enchytraeider

Den rekommenderade testarten är Enchytraeus albidus Henle 1837 (vit ringmask). Enchytraeus albidus är en av de största arterna (upp till 15 mm) bland ringmaskar (Annelida) i Oligochaetfamiljen Enchytraeidae och finns över hela världen, se t.ex. (8). Enchytraeus albidus finns i marina och limniska livsmiljöer och livsmiljöer på land, främst i multnande organiskt material (tång, kompost) men är sällsynt på ängar (42). Denna breda ekologiska tolerans och vissa morfologiska variationer tyder på att det kan finnas olika raser av denna art.

Enchytraeus albidus säljs allmänt på marknaden som fiskfoder. Kontroll bör göras av om odlingen är förorenad av andra, i regel mindre arter (60). Om förorening förekommer bör alla maskar tvättas med vatten i en petriskål. Stora vuxna exemplar av Enchytraeus albidus väljs sedan ut (med användning av stereomikroskop) för start av en ny odling. Alla andra maskar kasseras. Livscykeln är kort eftersom maskarna blir könsmogna mellan 33 dagar (vid 18 °C) och 74 dagar (vid 12 °C). Endast odlingar som har hållits i laboratoriet minst 5 veckor (en generation) utan problem får användas för testning.

Även andra arter av Enchytraeus är lämpliga, särskilt Enchytraeus luxuriosus. Denna art är en äkta jordlevande mask, vilket nyligen har beskrivits i (65). Om andra arter av Enchytraeus används bör de identifieras tydligt och rapporten bör innehålla motivering för valet av denna art.

Enchytraeus crypticus (Westheide & Graefe 1992) är en art som tillhör samma grupp som Enchytraeus luxuriosus. Man har inte med säkerhet kunna bekräfta dess existens på fältet, eftersom den endast har beskrivits utifrån daggmaskodlingar och komposthögar (Römbke 2003). Artens ursprungliga ekologiska krav är därför inte kända. Nyligen gjorda laboratoriestudier av olika slags fältjordar har dock bekräftat att denna art har en bred tolerans när det gäller jordegenskaper som pH och textur (Jänsch m.fl. 2005). Under de senaste åren har denna art ofta använts i ekotoxikologiska studier eftersom den är lätt att odla och testa(se t.ex. Kuperman m.fl. 2003). Den är dock liten (3–12 mm, i genomsnitt 7 mm, Westheide & Müller 1996), vilket gör hanteringen svårare i jämförelse med Enchytraeus albidus. När denna art används i stället för Enchytraeus albidus, kan storleken på testkärlen vara mindre, men det är inget krav. Dessutom bör man beakta att arten förökar sig mycket snabbt med en generationstid på mindre än 20 dagar vid 20 ± 2 °C (Achazi m.fl. 1999) och ännu snabbare vid högre temperaturer.

Enchytraeider av arten Enchytraeus albidus (såväl som andra Enchytraeus-arter) kan odlas i stora plastlådor (t.ex. 30 × 60 × 10 cm eller 20 × 12 × 8 cm, som lämpar sig för odling av små maskar) fyllda med en blandning av syntetisk jord och allmänt tillgänglig oförorenad trädgårdsjord utan tillsatser. Kompostmaterial bör undvikas eftersom det kan innehålla giftiga kemikalier såsom tungmetaller. Fauna bör avlägsnas från odlingsjorden före användning genom djupfrysning i tre omgångar. Rent syntetisk jord kan också användas men då kan förökningshastigheten vara lägre jämfört med blandade substrat. Substratet bör ha pH 6,0 ± 0,5. Odlingen hålls i en inkubator vid 15 ± 2 °C utan ljus. Under alla omständigheter ska temperaturer över 23 °C undvikas. Jorden (syntetisk eller naturlig) ska vara fuktig men inte våt. När jorden kramas försiktigt i handen ska endast små vattendroppar komma fram. Under alla omständigheter bör anoxiska betingelser undvikas (om t.ex. lock används, bör det ha tillräckligt antal hål för att ge tillräcklig luftväxling). Odlingsjorden bör luftas genom försiktig omblandning en gång per vecka.

Maskarna bör utfodras minst en gång per vecka ad libitum med havreflingor som placeras i en kavitet på jordens yta och täcks med jord. Om det finns kvar foder från föregående utfodring bör mängden foder justeras i motsvarande grad. Om det växer svamp på överblivet foder bör det ersättas med en ny mängd havreflingor. För att stimulera förökningen kan havreflingorna kompletteras med allmänt tillgängligt vitaminberikat proteinpulver varannan vecka. Efter tre månader överförs djuren till en färsk kultur eller färskt odlingssubstrat. Havreflingorna ska förvaras i kärl med tättslutande lock och bör behandlas i autoklav eller hettas upp före användning för att undvika infektion med mjölkvalster (t.ex. Glyzyphagus sp., Astigmata, Acarina) eller rovkvalster (t.ex. Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina). Efter desinfektering mals fodret så att det enkelt kan spridas på jordytan. En annan tänkbar foderkälla är bakningsjäst eller fiskfoder TetraMin®.

Allmänt taget gäller att odlingsbetingelserna är tillräckliga om maskarna inte försöker lämna substratet, rör sig snabbt genom jorden, har en glansig yta utan vidhäftande jordpartiklar, har en mer eller mindre vitaktig färg och det går att iaktta maskar av olika åldrar. Dessutom kan maskarna anses vara friska om de förökar sig kontinuerligt.

Valda ytterligare hänvisningar

Achazi R. K., Fröhlich E., Henneken M., Pilz C. (1999), The effect of soil from former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid Enchytraeus crypticus (Enchytraeidae, Oligochaeta), Newsletter on Enchytraeidae 6, s. 117–126.

Jänsch S., Amorim M. J. B., Römbke J. (2005), Identification of the ecological requirements of important terrestrial ecotoxicological test species, Environ. Reviews 13, s. 51–83.

Kuperman R. G., Checkai R. T., Simini M., Phillips C. T., Kolakowski J. E., Kurnas C. W., Sunahara G. I. (2003), Survival and reproduction of Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX, Pedobiologia 47, s. 651–656.

Römbke J. (2003), Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review, Pedobiologia 47, s. 607–616.

Westheide W. och Graefe U. (1992), Two new terrestrial Enchytraeus species (Oligochaeta, Annelida), J. Nat. Hist. 26, s. 479–488.

Westheide W. och Müller M. C. (1996), Cinematographic documentation of enchytraeid morphology and reproductive biology, Hydrobiologia 334, s. 263–267.