EU-förordning

Kommissionens förordning (EU) 2016/266 av den 7 december 2015 om ändring, för anpassning till den tekniska utvecklingen, av förordning (EG) nr 440/2008 om testmetoder enligt Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach) (Text av betydelse för EES)

CELEX: 32016R0266
Typ: EU-förordning
Datum: 20151207
EUT: L 054

EUROPEISKA KOMMISSIONEN HAR ANTAGIT DENNA FÖRORDNING

med beaktande av fördraget om Europeiska unionens funktionssätt,

med beaktande av Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 av den 18 december 2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach), inrättande av en europeisk kemikaliemyndighet, ändring av direktiv 1999/45/EG och upphävande av rådets förordning (EEG) nr 793/93 och kommissionens förordning (EG) nr 1488/94 samt rådets direktiv 76/769/EEG och kommissionens direktiv 91/155/EEG, 93/67/EEG, 93/105/EG och 2000/21/EG, särskilt artikel 13.2, och

1 I kommissionens förordning (EG) nr 440/2008 fastställs testmetoder som ska användas för tillämpning av förordning (EG) nr 1907/2006 när det gäller bestämning av kemikaliers fysikalisk-kemiska egenskaper, toxicitet och ekotoxicitet.

2 Det är nödvändigt att uppdatera förordning (EG) nr 440/2008 för att införa nya och uppdaterade testmetoder som nyligen har antagits av OECD, i syfte att ta hänsyn till tekniska framsteg och säkerställa minskning av antalet djur som används för försök, i enlighet med Europaparlamentets och rådets direktiv 2010/63/EU. Samråd har förts med berörda parter om detta utkast.

3 Anpassningen omfattar tjugo testmetoder: en ny metod för bestämning av fysikalisk-kemiska egenskaper, elva nya testmetoder och tre uppdaterade testmetoder för bedömning av ekotoxicitet samt fem nya testmetoder för att bedöma omvandling, spridning och fördelning i miljön.

4 Förordning (EG) nr 440/2008 bör därför ändras i enlighet med detta.

5 De åtgärder som föreskrivs i denna förordning är förenliga med yttrandet från den kommitté som inrättats i enlighet med artikel 133 i förordning (EG) nr 1907/2006.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

Bilagan till förordning (EG) nr 440/2008 ska ändras i enlighet med bilagan till den här förordningen.

Artikel 2

Denna förordning träder i kraft den tredje dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning.

1 EUT L 396, 30.12.2006, s. 1.

2 Kommissionens förordning (EG) nr 440/2008 av den 30 maj 2008 om testmetoder enligt Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach) (EUT L 142, 31.5.2008, s. 1).

3 Europaparlamentets och rådets direktiv 2010/63/EU av den 22 september 2010 om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål (EUT L 276, 20.10.2010, s. 33).

BILAGA

Bilagan till förordning (EG) nr 440/2008 ska ändras på följande sätt:

1 En anmärkning införs i början av bilagan, före del A:

2 Kapitel A.24 ska läggas till:

3 Kapitel C.3 ska ersättas med följande:

4 Kapitel C.11 ska ersättas med följande:

5 Kapitel C.26 ska ersättas med följande:

6 Följande kapitel C.31–C.46 ska läggas till:

1 Den övre gränsen sätts med tanke på behovet att åstadkomma en fullständig separationsfas efter att fördelningsjämvikten justerats och innan man tar prover för analytisk bestämning. Om lämpliga försiktighetsåtgärder vidtas kan den övre gränsen höjas till högre värden för Pow.

2 Rådets direktiv 91/271/EEG av den 21 maj 1991 om rening av avloppsvatten från tätbebyggelse. EGT L 135, 30.5.1991, s. 40.

3 Samma förfarande bör följas med referenskemikalien och ge kolvarna FR1-3

5 Rekommenderad storlek är 0,1–1 liter.

6 Användningen av gastäta silikonseptum rekommenderas. Vidare rekommenderas att lockens gastäthet, i synnerhet butylgummiseptum, provas eftersom flera kommersiellt tillgängliga septum inte är tillräckligt gastäta mot metan och vissa septum inte förblir täta när de genomborras med en nål under testbetingelserna. Gastäta överdragna septum rekommenderas och ska användas för flyktiga kemikalier (vissa kommersiella septum är relativt tunna, mindre än 0,5 cm, och förblir inte gastäta när de genomborras av en kanyl). Butylgummiseptum (ca 1 cm) rekommenderas om testämnena inte är flyktiga (dessa förblir normalt gastäta när de genomborras.) Före testet rekommenderas att septumen granskas noga med avseende på deras förmåga att förbli gastäta när de genomborras.

7 Mätinstrumentet bör användas och kalibreras regelbundet enligt tillverkarens anvisningar. Om en tryckmätare av föreskriven kvalitet används, t.ex. inkapslad med ett stålmembran, behövs ingen kalibrering i laboratoriet. Den bör kalibreras av ett auktoriserat institut vid rekommenderade intervaller. Noggrannheten i kalibreringen kan kontrolleras i laboratoriet med en enpunktsmätning vid 1 × 105 Pa mot en tryckmätare med en mekanisk display. När denna punkt mäts korrekt, kommer linjäriteten också att vara oförändrad. Om andra mätinstrument används (utan certifierad kalibrering av tillverkaren), rekommenderas regelbunden omvandling av mätvärdena över hela mätområdet (tillägg 2).

8 Detta gäller den försöksuppställning och de försöksbetingelser varvid de volymer gas som produceras – i blankprov och i kärl med 70–80 % tillväxthämning – kan uppskattas med en acceptabel felmarginal.

9 Luftningen av vattnet kan upprätthållas med hjälp av syrestenar. Det rekommenderas att syrestenarna fästs på nivåer som inte skapar onödig stress för grodynglen.

11 Vid 20 °C under det normala atmosfärtrycket motsvarar luftmättnadsvärdet i sötvatten 9,1 mg/l (60 % motsvarar 5,46 mg/l).

12 Kvicksilver(II)klorid (HgCl2) är ett mycket giftigt ämne som bör hanteras med lämpliga försiktighetsåtgärder. Vattenhaltigt avfall som innehåller denna kemikalie bör bortskaffas på lämpligt sätt. Det bör inte släppas ut i avloppssystemet.

13 Kvicksilver(II)klorid (HgCl2) är ett mycket giftigt ämne som bör hanteras med lämpliga försiktighetsåtgärder. Vattenhaltigt avfall som innehåller denna kemikalie bör bortskaffas på lämpligt sätt. Det bör inte släppas ut i avloppssystemet.

14 Rötslam är en blandning av sedimenterade faser av spillvatten och aktiverat slam som har inkuberats i en anaerob rötkammare vid ungefär 35 °C för att minska biomassan och problemen med dålig lukt samt för att förbättra slammets avvattningsförmåga. Det består av en förening av anaeroba fermenterande och metanogena bakterier som producerar koldioxid och metan (11).

15 Andel av n2

18 Den rekommenderade storleken är 0,1 liter till 1 liter.

19 Användningen av gastäta silikonseptum rekommenderas. Vidare rekommenderas att lockens gastäthet, i synnerhet butylgummiseptum, provas eftersom flera kommersiellt tillgängliga septum inte är tillräckligt gastäta mot metan och vissa septum inte förblir täta när de genomborras med en nål under testbetingelserna.

20 Anordningen bör användas och kalibreras regelbundet enligt tillverkarens anvisningar. Om en tryckmätare av föreskriven kvalitet används, t.ex. inkapslad med ett stålmembran, behövs ingen kalibrering i laboratoriet. Noggrannheten i kalibreringen kan kontrolleras i laboratoriet med en enpunktsmätning vid 1 × 105 Pa mot en tryckmätare med en mekanisk display. När denna punkt mäts korrekt, kommer linjäriteten också att vara oförändrad. Om andra mätinstrument används (utan certifierad kalibrering av tillverkaren), rekommenderas regelbunden omvandling av mätvärdena över hela mätområdet.

21 Detta bör omprövas om adsorptiva och olösliga referenskemikalier ingår.

22 Kolonnurlakningsstudier med bekämpningsmedel kan ge information om en testkemikalies rörlighet och dess omvandlingsprodukter och kan komplettera sorptionsstudier på hela partier.

23 Den mängd som ska tillsättas i de cylindriska jordkolonnerna kan beräknas med följande formel: M μg A kg ha 10 9 μg kg d 2 cm 2 π 10 8 cm 2 ha 4 där M tillsatt mängd per kolonn [μg] A appliceringsgrad [kg · ha– 1] D jordkolonnens diameter [m3] π 3,14

24 Enligt FAO:s och USDA:s system (14).

25 § Variablernas värden ska helst ligga inom de angivna intervallen. Om det är svårt att hitta lämpligt jordmaterial kan värden under det angivna minimivärdet godtas.

26 ‡ Jordar med mindre än 0,3 % organiskt kol kan störa det inbördes förhållandet mellan halten av organiskt material och adsorptionen. Det är därför tillrådligt att använda jordar med en minimihalt på 0,3 % organiskt kol.

27 # Jordar med mycket högt kolinnehåll (t.ex. > 10 %) kan eventuellt inte vara juridiskt godtagbara, t.ex. för registrering av bekämpningsmedel.

34 Detta simulerar en mycket hög nederbörd. Den genomsnittliga årliga nederbörden, t.ex. i Centraleuropa, är i storleksordningen 800–1000 mm.

35 Exempel på packningstäthet för störd jord är som följer: för sandjord 1,66 g · ml– 1 för lerig sandjord 1,58 g · ml– 1 för lerjord 1,17 g · ml– 1 för siltjord 1,11 · g ml– 1

36 Typiska lakvattensvolymer varierar från 230–260 ml, vilket motsvarar ungefär 92–104 % av den totala tillförda mängden artificiellt regn (251 ml) vid användning av jordkolonner med 4 cm diameter och 30 cm längd.

37 Mer än en viktig omvandlingsprodukt som kan bildas i jord kan också uppstå vid olika tidpunkter under en omvandlingsstudie. I sådana fall kan det vara nödvändigt att utföra urlakningsstudier med åldrade rester av olika ålder.

Tillägg

Beräkningsmetoder för POW

INLEDNING

1. Detta tillägg ger en kort introduktion till beräkningen av Pow. För ytterligare uppgifter hänvisas läsaren till läroböcker (1) (2).

2. Beräknade värden på Pow används för att bestämma vilken försöksmetod som ska användas: skakkolvmetoden för log Pow-värden mellan – 2 och 4 och HPLC-metoden för log Pow-värden mellan 0 och 6, valet av testförhållanden för HPLC (referensämnen, förhållandet metanol/vatten), kontroll av rimligheten för de värden som erhålls genom experimentella metoder, att tillhandahålla en uppskattning för fall där experimentella metoder inte kan användas.

Princip för beräkningsmetoderna

3. De beräkningsmetoder som föreslås här bygger på teoretisk fragmentering av molekylen i lämpliga understrukturer för vilka tillförlitliga log Pow-inkrementer är kända. Log Pow erhålls genom att summera fragmentvärdena och korrigeringsfaktorerna för intramolekylär växelverkan. Förteckningar över fragmentkonstanter och korrigeringsfaktorer finns tillgängliga (1) (2) (3) (4) (5) (6). Vissa av dem uppdateras regelbundet (3).

Tillförlitlighet för beräknade värden

4. I allmänhet minskar beräkningsmetodernas tillförlitlighet i takt med att komplexiteten hos de undersökta ämnena ökar. För enkla molekyler med låg molekylvikt och en eller två funktionella grupper kan man förvänta sig en avvikelse på 0,1–0,3 log Pow-enheter mellan resultaten av de olika fragmenteringsmetoderna och de uppmätta värdena. Felmarginalen beror på de använda fragmentkonstanternas tillförlitlighet, förmågan att känna igen intramolekylära växelverkningar (t.ex. vätebindningar) och den korrekta användningen av korrigeringsfaktorer. För joniserbara ämnen måste laddningen och graden av jonisering beaktas (10).

Fujita-Hansch π-metod

5. Konstanten för hydrofoba substituenter, π, som ursprungligen infördes av Fujita m.fl. (7), definieras som: πX = log Pow (PhX) – log Pow (PhH) där PhX är ett aromatiskt derivat och PhH modersubstansen. T.ex. πCl = log Pow (C6H5Cl) – log Pow (C6H6) = 2,84 – 2,13 = 0,71 π-metoden är huvudsakligen av intresse för aromatiska föreningar. π-värden för ett stort antal substituenter finns tillgängliga (4) (5).

Rekkers metod

6. Med Rekkers metod (8) beräknas log Pow-värdet på följande sätt: Log P ow ia if i j samspelstmer där ai är antalet gånger ett visst fragment förekommer i molekylen och fi är log Pow-inkrementet för fragmentet. Samspelstermerna kan uttryckas som en integral multipel av en enda konstant Cm (den s.k. magiska konstanten). Fragmentkonstanterna fi och Cm har fastställts på grundval av en tabell med 1054 experimentellt bestämda Pow-värden för 825 ämnen med hjälp av flerdimensionell regressionsanalys (6) (8). Fastställandet av samspelstermerna utförs i enlighet med fastställda regler (6) (8) (9).

Hansch-Leos metod

7. Med Hansch-Leos metod (4) beräknas log Pow-värdet på följande sätt: Log P ow ia if i jb jF j där fi är en fragmentkonstant, Fj en korrigeringsfaktor, och ai och bj är motsvarande förekomstfrekvenser. Förteckningarna över atom- och gruppfragmentvärden och korrigeringsfaktorerna Fj har tagits fram genom trial-and-error på grundval av experimentellt bestämda värden på Pow. Korrigeringsfaktorerna har delats in i flera olika klasser (1) (4). Programpaket har utvecklats som tar hänsyn till alla regler och korrigeringsfaktorer (3).

KOMBINERAD METOD

8. Beräkningen av log Pow för komplexa molekyler kan förbättras betydligt om molekylen delas upp i större delstrukturer för vilka tillförlitliga log Pow-värden finns tillgängliga, antingen i tabeller (3) (4) eller från utförda mätningar. Sådana fragment (t.ex. heterocykler, antrakinon, azobensen) kan sedan kombineras med Hanschs π-värden eller med Rekkers eller Leos fragmentkonstanter.

Anmärkningar

i) Beräkningsmetoderna är endast tillämpliga på helt eller delvis joniserade ämnen om de nödvändiga korrigeringsfaktorerna beaktas. ii) Om intramolekylära vätebindningar kan antas förekomma måste motsvarande korrigeringsfaktorer (cirka + 0,6 till + 1,0 log Pow-enheter) läggas till (1). Indikationer på närvaron av sådana bindningar kan erhållas från stereomodeller eller spektroskopiska data. iii) Om flera tautomeriska former är möjliga ska den mest sannolika formen användas som grund för beräkningen. iv) Revisioner av listor med fragmentkonstanter bör följas noggrant.

LITTERATUR OM BERÄKNINGSMETODER

(1) W. J. Lyman, W. F. Reehl och D.H. Rosenblatt (red.). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York (1982).

(2) W. J. Dunn, J. H. Block och R. S. Pearlman (red.). Partition Coefficient, Determination and Estimation, Pergamon Press, Elmsford (New York) och Oxford (1986).

(3) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 92711, USA, log P-databas och medicinsk-kemisk mjukvara (programmet CLOGP-3).

(4) C. Hansch och A. J. Leo. Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York (1979).

(5) Leo, C. Hansch och D. Elkins. (1971) Partition coefficients and their uses. Chemical Reviews. 71, 525.

(6) R. F. Rekker och H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14, 479.

(7) Toshio Fujita, Junkichi Iwasa och Corwin Hansch (1964). A New Substituent Constant, π, Derived from Partition Coefficients. J. Amer. Chem. Soc. 86, 5175.

(8) R. F. Rekker. The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Vol. 1, Elsevier, New York (1977).

(9) C. V. Eadsforth och P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

(10) R. A. Scherrer. ACS – Symposium Series 255, s. 225, American Chemical Sociery, Washington, D.C. (1984).

Tillägg 1

Definitioner

Följande definitioner och förkortningar används i denna testmetod:

dimensionslöst mått på en parameters variabilitet, definierat som förhållandet mellan standardavvikelsen och medelvärdet. Detta kan också uttryckas i procent. Variationskoefficientens medelvärde för den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten i kontrollreplikaten beräknas enligt följande:

1 beräkna variationskoefficienten (i procent) för den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten utifrån de dagliga sektionsvisa tillväxthastigheterna för respektive replikat,

2 beräkna medelvärdet för alla värden som erhållits i punkt 1 för att få fram den genomsnittliga variationskoefficienten för den dagliga sektionsvisa specifika tillväxthastigheten i kontrollreplikaten.

Tillägg 2

Rekommenderade stammar

Grönalger

Pseudokirchneriella subcapitata (äldre namn: Selenastrum capricornutum), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG

Desmodesmus subspicatus (äldre namn: Scenedesmus subspicatus) 86.81 SAG

Kiselalger

Navicula pelliculosa, UTEX 664

Cyanobakterier

Anabaena flos-aquae, UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A

Synechococcus leopoliensis, UTEX 625, CCAP 1405/1

Stammarnas ursprung

De rekommenderade stammarna finns att tillgå som monokulturer från följande samlingar (alfabetisk ordning):

ATCC: American Type Culture Collection 10801 University Boulevard Manassas, Virginia 20110-2209 USA

CCAP: Culture Collection of Algae and Protozoa Institute of Freshwater Ecology, Windermere Laboratory Far Sawrey, Amblerside Cumbria LA22 0LP STORBRITANNIEN

SAG: Sammlung von Algenkulturen Albrecht-von-Haller-Institut Universität Göttingen Nikolausberger Weg 18 37073 Göttingen TYSKLAND

UTEX Culture Collection of Algae Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology School of Biological Sciences University of Texas at Austin Austin, Texas 78712 USA

Form och övriga egenskaper hos rekommenderade arter

P. subcapitata | D. subspicatus | N. pelliculosa | A. flos-aquae | S. leopoliensis

Storlek (längd × bredd) (μm) | 8–14 × 2–3 | 7–15 × 3–12 | 7,1 × 3,7 | 4,5 × 3 | 6 × 1

Volym (μm3/cell) | 40–60 | 60–80 | 40–50 | 30–40 | 2,5

Torrvikt (mg/cell) | 2–3 × 10– 8 | 3–4 × 10– 8 | 3–4 × 10– 8 | 1–2 × 10– 8 | 2–3 × 10– 9

Tillväxthastighet (dygn– 1) | 1,5 –1,7 | 1,2–1,5 | 1,4 | 1,1–1,4 | 2,0–2,4

Särskilda rekommendationer om odling och hantering av rekommenderade testarter

Pseudokirchneriella subcapitata och Desmodesmus subspicatus

Dessa grönalger brukar vara lätta att hålla i olika odlingsmedier. Råd om lämpliga medier kan fås från de institutioner som ansvarar för algsamlingarna. Cellerna är vanligen enskilda, och celltätheten kan enkelt bestämmas med hjälp av elektronisk partikelräknare eller mikroskop.

Anabaena flos-aquae

Olika odlingsmedier kan användas för stamkulturen. Det är mycket viktigt att batchkulturen fortfarande befinner sig i logfas då den förnyas, eftersom den annars har svårt att återhämta sig.

Anabaena flos-aquae bildar aggregat bestående av hopnystade kedjor av celler. Aggregatens storlek kan variera beroende på odlingsförhållandena. Om biomassan bestäms genom räkning i mikroskop eller med hjälp av en elektronisk partikelräknare kan det vara nödvändigt att först bryta sönder aggregaten.

Sonikering av prov kan användas för att bryta sönder kedjor av celler och därigenom minska variabiliteten vid räkning. Längre sonikering än vad som krävs för att bryta sönder kedjorna i småfragment kan dock förstöra cellerna. Sonikeringens intensitet och varaktighet ska vara densamma för varje testlösning.

Räkna tillräckligt många fält på hemocytometern (minst 400 celler) för att kompensera för variabiliteten. På så vis ökar tillförlitligheten hos de mikroskopiska täthetsbestämningarna.

Den totala cellvolymen för Anabaena kan bestämmas med hjälp av en elektronisk partikelräknare. Först måste dock cellkedjorna brytas sönder genom försiktig sonikering. Anpassa sonikeringsenergin så att cellerna inte sprängs.

Använd vortexblandare eller liknande för att se till att den algsuspension som används för att ympa testkärlen är väl blandad och har homogen konsistens.

Testkärlen placeras i ett skakbord med rund- eller längsgående rörelse, hastighet ca 150 rpm. Ett alternativ är att man med jämna mellanrum skakar kärlen för att undvika att Anabaena bildar klumpar. Om klumpar ändå bildas måste man se till att de prov som tas för mätning av biomassa är representativa. Det kan vara nödvändigt att skaka kärlen kraftigt före provtagning för att klumparna ska lösas upp.

Synechococcus leopoliensis

Olika odlingsmedier kan användas för stamkulturen. Råd om lämpliga medier kan fås från de institutioner som ansvarar för algsamlingarna.

Synechococcus leopoliensis växer som enskilda, stavformiga celler. Cellerna är mycket små, vilket försvårar bestämning av biomassan genom räkning av celler i mikroskop. Elektroniska partikelräknare anpassade för partiklar ned till ung. 1 μm kan användas, och man kan även göra fluorimetriska mätningar in vitro.

Navicula pelliculosa

Olika odlingsmedier kan användas för stamkulturen. Råd om lämpliga medier kan fås från de institutioner som ansvarar för algsamlingarna. Observera att mediet måste innehålla silikat.

Navicula pelliculosa kan under vissa odlingsförhållanden bilda aggregat. Detta beror på att fett som producerats av algerna ibland ansamlas i en ytfilm till vilken de enskilda algcellerna lätt vidhäftas. När detta sker måste man se till att de prov som tas för bestämning av biomassa är representativa, t.ex. genom kraftig skakning i vortexblandare.

1 Uppmätt med elektronisk partikelräknare.

2 Beräknat på grundval av storleken.

3 Den vanligast observerade tillväxthastigheten i OECD-medium vid en ljusintensitet på ungefär 70 μE m– 2 s– 1 och en temperatur på 21 °C.

Tillägg 3

Odlingsmedier

Man kan välja mellan två odlingsmedier:

OECD-medium: originalmedium enligt OECD TG 201, samt enligt ISO 8692

AAP-medium enligt den amerikanska miljöskyddsmyndigheten (EPA), samt enligt ASTM.

Vid beredning av medierna ska kemikalier av reagenskvalitet eller p.a.-kvalitet användas, och vattnet ska vara avjonat.

Sammansättningen av AAP-medium (enl. EPA) och OECD TG 201-medium

Komponent | AAP | OECD

mg/l | mM | mg/l | mM

NaHCO3 | 15,0 | 0,179 | 50,0 | 0,595

NaNO3 | 25,5 | 0,300

NH4Cl | 15,0 | 0,280

MgCl2 · 6(H2O) | 12,16 | 0,0598 | 12,0 | 0,0590

CaCl2 · 2(H2O) | 4,41 | 0,0300 | 18,0 | 0,122

MgSO4 · 7(H2O) | 14,6 | 0,0592 | 15,0 | 0,0609

K2HPO4 | 1,044 | 0,00599

KH2PO4 | 1,60 | 0,00919

FeCl3 · 6(H2O) | 0,160 | 0,000591 | 0,0640 | 0,000237

Na2EDTA · 2(H2O) | 0,300 | 0,000806 | 0,100 | 0,000269 *

H3BO3 | 0,186 | 0,00300 | 0,185 | 0,00299

MnCl2 · 4(H2O) | 0,415 | 0,00201 | 0,415 | 0,00210

ZnCl2 | 0,00327 | 0,000024 | 0,00300 | 0,0000220

CoCl2 · 6(H2O) | 0,00143 | 0,000006 | 0,00150 | 0,00000630

Na2MoO4 · 2(H2O) | 0,00726 | 0,000030 | 0,00700 | 0,0000289

CuCl2 · 2(H2O) | 0,000012 | 0,00000007 | 0,00001 | 0,00000006

pH | 7,5 | 8,1

Det molara förhållandet mellan EDTA och järn ska vara något större än 1. På så vis förhindras utfällning av järn samtidigt som kelateringen av tungmetalljoner minimeras.

I testet med kiselalgen Navicula pelliculosa berikas båda medierna med Na2SiO3 · 9H2O så att koncentrationen av kisel (Si) blir 1,4 mg/l.

Mediets pH hålls i jämvikt genom karbonatsystemet i mediet och partialtrycket för CO2 i den omgivande luften. Ett ungefärligt förhållande mellan pH vid 25 °C och den molara koncentrationen av bikarbonat ges av formeln

pHeq = 11,30 + log[HCO3]

Med 15 mg NaHCO3/l är pHeq = 7,5 (AAP-medium enl. EPA), och med 50 mg NaHCO3/l är pHeq = 8,1 (OECD-medium).

Testmediernas grundämnessammansättning

Grundämne | AAP | OECD

mg/l | mg/l

C | 2,144 | 7,148

N | 4,202 | 3,927

P | 0,186 | 0,285

K | 0,469 | 0,459

Na | 11,044 | 13,704

Ca | 1,202 | 4,905

Mg | 2,909 | 2,913

Fe | 0,033 | 0,017

Mn | 0,115 | 0,115

Beredning av OECD-medium

Näringsämne | Koncentration i stamlösningen

NH4Cl | 1,5 g/l

MgCl2 · 6H2O | 1,2 g/l

CaCl2 · 2H2O | 1,8 g/l

MgSO4 · 7H2O | 1,5 g/l

KH2PO4 | 0,16 g/l

FeCl3 · 6H2O | 64 mg/l

Na2EDTA · 2H2O | 100 mg/l

H3BO3 | 185 mg/l

MnCl2 · 4H2O | 415 mg/l

ZnCl2 | 3 mg/l

CoCl2 · 6H2O | 1,5 mg/l

CuCl2 · 2H2O | 0,01 mg/l

Na2MoO4 · 2H2O | 7 mg/l

NaHCO3 | 50 g/l

Na2SiO3 · 9H2O

Sterilisera stamlösningarna genom membranfiltrering (genomsnittlig pordiameter 0,2 μm) eller autoklavering (120 °C, 15 min). Lösningarna förvaras i mörker vid 4 °C.

Stamlösningarna 2 och 4 autoklaveras inte, utan steriliseras genom membranfiltrering.

Odlingsmediet bereds genom att man tillsätter lämpliga volymer av stamlösningarna 1–4 till vatten.

Till 500 ml steriliserat vatten tillsätts:

Späd till 1000 ml med steriliserat vatten.

Vänta tills mediet befinner sig i jämvikt med den omgivande luften med avseende på CO2. Vid behov kan processen påskyndas genom att mediet bubblas med steril, filtrerad luft i några timmar.

Beredning av AAP-medium (enl. EPA)

1. Tillsätt 1 ml av var och en av stamlösningarna i 2.1–2.7 till ung. 900 ml avjonat eller destillerat vatten och späd till 1 liter.

2. Stamlösningar med makronäringsämnen bereds genom att kemikalierna nedan löses i 500 ml avjonat eller destillerat vatten. Reagensen 2.1, 2.2, 2.3 och 2.4 kan kombineras till en stamlösning. 2.1 NaNO3 12,750 g 2.2 MgCl2 · 6H2O 6,082 g 2.3 CaCl2 · 2H2O 2,205 g 2.4 Stamlösning med mikronäringsämnen (se 3) 2.5 MgSO4 · 7H2O 7,350 g 2.6 K2HPO4 0,522 g 2.7 NaHCO3 7,500 g 2.8 Na2SiO3 · 9H2O Se anm. 1. Anm. 1: Används bara för kiselalger. Kemikalien kan tillsättas direkt (202,4 mg) eller via en stamlösning. Slutkoncentrationen av kisel (Si) i mediet ska i båda fallen vara 20 mg/l.

3. Stamlösningen med mikronäringsämnen bereds genom att kemikalierna nedan löses i 500 ml avjonat eller destillerat vatten. 3.1 H3BO3 92,760 mg 3.2 MnCl2 · 4H2O 207,690 mg 3.3 ZnCl2 1,635 mg 3.4 FeCl3 · 6H2O 79,880 mg 3.5 CoCl2 · 6H2O 0,714 mg 3.6 Na2MoO4 · 2H2O 3,630 mg 3.7 CuCl2 · 2H2O 0,006 mg 3.8 Na2EDTA · 2H2O 150,000 mg [dinatrium(etylendinitril)tetraacetat] 3.9 Na2SeO4 · 5H2O 0,005 mg. Se anm. 2. Anm. 2: Används bara för stamkulturer av kiselalger.

4. Justera pH till 7,5 ± 0,1 med 0,1 N eller 1,0 N NaOH eller HCl.

5. Om man använder sig av en elektronisk partikelräknare ska mediet filtreras över till ett sterilt kärl genom ett membranfilter med en pordiameter på 0,22 μm. Om partikelräknare inte används ska filtrets pordiameter i stället vara 0,45 μm.

6. Mediet lagras i mörker vid ung. 4 °C tills det används.

Tillägg 4

Exempel på en metod för algodling

Allmänna påpekanden

Syftet med odling enligt följande metod är att få fram algkulturer för toxicitetstester.

Man måste vidta lämpliga åtgärder för att förhindra att algkulturerna kontamineras med bakterier. Utgångsmaterialet ska bestå av monokulturer, och helst axeniska sådana.

Alla moment ska utföras under sterila förhållanden för att undvika kontaminering med bakterier eller andra alger.

Utrustning och material

Se under testmetod: Utrustning

Odling av algkulturer

Beredning av näringslösningar (näringsmedier):

Alla närsalter i mediet bereds som koncentrerade stamlösningar och lagras i mörker vid låg temperatur. Lösningarna steriliseras genom filtrering eller autoklavering.

Mediet bereds genom att man tillsätter angiven mängd stamlösning till sterilt destillerat vatten. Kontaminering med mikroorganismer måste undvikas. För fasta medier tillsätts 0,8 % agar.

Stamkultur:

Stamkulturerna är små algkulturer som regelbundet överförs till färskt medium och som används som utgångstestmaterial. Om kulturerna inte används regelbundet ska de strykas ut på böjda agarrör. Dessa överförs till färskt medium minst en gång varannan månad.

Stamkulturerna odlas i E-kolvar med lämpligt medium (volym ca 100 ml). Om algerna inkuberas vid 20 °C i kontinuerligt ljus måste överföringar göras en gång i veckan.

Vid detta moment överför man med hjälp av en steril pipett en viss mängd gammal kultur till en kolv med färskt medium så att initialkoncentrationen för snabbväxande arter är ca 100 gånger lägre än i den gamla kulturen.

Tillväxttakten för en viss art kan bestämmas utifrån tillväxtkurvan. Med hjälp av detta värde kan man sedan räkna fram vid vilken celltäthet kulturen ska överföras till nytt medium. Detta måste göras innan kulturen når deklinationsfasen.

Förkultur:

Avsikten med förkulturen är att få en mängd alger som är lämpliga för ympning av testkulturer. Förkulturen inkuberas under testbetingelser och används medan den ännu växer exponentiellt, vanligen efter en inkuberingsperiod på 2–4 dagar. Algkulturer som innehåller deformerade eller avvikande celler kastas bort.

Tillägg 5

Analys Av Data Med Icke-Linjär Regression

Allmänna överväganden

Responsen i algtester och andra tester som gäller mikrobiell tillväxt (tillväxt av biomassa) är per definition en kontinuerlig, eller metrisk, variabel. Det rör sig om hastigheten hos en process i de fall man mäter tillväxthastighet, och integralen av motsvarande kurva om man i stället mäter biomassa. Båda variablerna jämförs sedan med motsvarande genomsnittsrespons för icke-exponerade kontrollreplikat som uppvisar maximal respons under de rådande förhållandena – med ljus och temperatur som viktigaste faktorer i algtestet. Systemet kan vara uppdelat eller homogent, och biomassan kan anses utgöra en helhet där man inte behöver ta hänsyn till enskilda celler. Variansfördelningen för responsen i ett sådant system beror uteslutande på experimentella faktorer (där felen vanligen är lognormalfördelade eller normalfördelade). Detta ska jämföras med typiska responser i biologiska tester med dikotoma data där toleransen (som vanligen är binomialfördelad) hos enskilda organismer ofta antas vara det dominerande elementet i variansen. Responsen i kontrollerna är i detta fall noll eller har samma värde som bakgrundsnivån.

I det enklaste fallet minskar den normaliserade eller relativa responsen r monotont från värdet 1 (ingen tillväxthämning) till 0 (100 % tillväxthämning). Man bör vara medveten om att alla responser innehåller fel, och att uppenbar negativ hämning vid beräkningen uteslutande anses bero på slumpmässiga fel.

Regressionsanalys

Modeller

Syftet med en regressionsanalys är att kvantitativt beskriva dos-respons-kurvan i form av en matematisk regressionsfunktion, Y = f (C) eller – vanligare – F (Z), där Z = log C. Använd på motsatt sätt kan funktionen C = f– 1 (Y) utnyttjas för beräkning av ECx-värden, t.ex. EC50, EC10 och EC20, samt motsvarande 95-procentiga konfidensgränser. Ett flertal enkla matematiska funktioner har visat sig vara lämpliga för att beskriva förhållandet mellan koncentration och respons vid bestämning av tillväxthämning hos alger. Dessa funktioner innefattar t.ex. den logistiska ekvationen, den icke-symmetriska Weibull-ekvationen samt funktionen för lognormalfördelning. De är alla sigmoida kurvor som asymptotiskt närmar sig värdet noll för C → 0 och värdet ett då C → oändligheten.

Ett nyligen framlagt alternativ till asymptotiska modeller är modeller som bygger på kontinuerliga tröskelfunktioner (t.ex. Kooijman-modellen för tillväxthämning avseende populationer, se Kooijman m.fl. 1996). Modellen bygger på antagandet att det inte förekommer några effekter under ett visst tröskelvärde EC0+ som bestäms genom extrapolation av dos-respons-kurvan till den punkt där den korsar koncentrationsaxeln. Man använder sig då av en enkel kontinuerlig funktion som inte är differentierbar i startpunkten.

Observera att analysen kan bestå av en enkel minimering av residualkvadratsummor (om man antar att variansen är konstant) eller av viktade kvadrater, om man kompenserar för variansens heterogenitet.

Förfarande

Förfarandet är i korthet följande: Välj en lämplig funktion, Y = f(C), och anpassa den till data genom icke-linjär regression. För att man ska kunna få ut så mycket information som möjligt från mätdata bör man använda mätvärden från varje enskild kolv i stället för medelvärden för samtliga replikat. Om variansen å andra sidan är hög visar erfarenheten att medelvärden för replikaten troligen kan ge en matematisk uppskattning som är mer tillförlitlig och mindre påverkad av slumpmässiga fel i data än en metod där man behåller varje enskild datapunkt.

Plotta den anpassade kurvan och erhållna mätdata, och kontrollera att kurvans anpassning är godtagbar. Analys av residualer kan vara ett särskilt användbart verktyg för detta ändamål. Om den valda funktionen för anpassning av dos-respons-kurvan ger en otillfredsställande beskrivning av hela kurvan eller en väsentlig del av denna, t.ex. responsen vid låga koncentrationer, bör man välja en annan typ av kurvanpassning som inte är symmetrisk, t.ex. Weibull-funktionen. Negativ hämning kan ge problem då man använder sig av t.ex. funktionen för lognormalfördelning. Också i detta fall bör man välja en alternativ regressionsfunktion. Det är inte lämpligt att sådana negativa värden tilldelas värdet noll eller ett lågt positivt värde eftersom detta rubbar felfördelningen. Det kan vara befogat att göra separata anpassningar för olika delar av kurvan. Exempelvis kan värdet på EClow x uppskattas från den del av kurvan där tillväxthämningen är låg. Beräkna från den anpassade ekvationen (genom omvänd uppskattning, C = f– 1 (Y)) karaktäristiska punktskattningar för ECx-värden. I rapporten ska åtminstone EC50 samt en eller två uppskattningar av EClow x tas med. Den praktiska erfarenheten har visat att algtestet vanligen medger en rimligt noggrann uppskattning vid 10 % tillväxthämning, förutsatt att det finns tillräckligt många datapunkter. Undantaget är de fall då tillväxtstimulering skett vid låga koncentrationer av testkemikalien. Uppskattningar av EC20 brukar ha betydligt högre precision än uppskattningar av EC10, eftersom EC20 vanligen befinner sig på den approximativt linjära delen av den centrala dos-respons-kurvan. Ibland kan EC10-värden vara svåra att tolka på grund av tillväxtstimulering. Även om man vanligen får fram EC10 med tillräckligt hög noggrannhet bör EC20 också alltid rapporteras.

Viktningsfaktorer

Eftersom den experimentella variansen vanligen inte är konstant och normalt sett innehåller en proportionell komponent bör man rutinmässigt göra en viktad regression. Viktningsfaktorerna vid en sådan analys antas vanligen vara omvänt proportionella mot variansen:

Wi = 1/Var(ri)

Många regressionsprogram har en funktion för viktad regressionsanalys där viktningsfaktorerna tas från en tabell. Det är lämpligt att man normaliserar viktningsfaktorerna genom att multiplicera dem med n/Σ wi (där n är antalet datapunkter) så att summan av dem blir ett.

Normalisering av responser

Normalisering med medelvärdet för kontrollernas responser innebär vissa principiella problem och leder också till en ganska komplicerad variansstruktur. Om man delar responsvärdena med medelvärdet för kontrollernas responser för att få fram den procentuella tillväxthämningen inför man samtidigt ett nytt fel på grund av det fel som är kopplat till medelvärdet för kontrollerna. Om detta fel inte är att betrakta som försumbart måste viktningsfaktorerna för regression och konfidensgränser korrigeras för kovariansen med kontrollen (Draper och Smith, 1981). För att den totala variansen för den relativa responsen ska kunna minimeras är det viktigt att det uppskattade medelvärdet för kontrollernas respons har en hög precision. Variansen uttrycks på följande sätt:

(Nedsänkt i hänför sig till koncentrationsnivån i, och nedsänkt 0 till kontrollerna.)

Yi = Relativ respons = ri/r0 = 1 – I = f(Ci)

med variansen Var(Yi) = Var( ri/r0) ≅ (∂Yi / ∂ ri)2 · Var(ri) + ((∂ Yi/ ∂ r0)2 · Var(r0)

och eftersom (∂ Yi/ ∂ ri) = 1/r0 och (∂ Y i/ ∂ r0) = ri/r02

med normalt fördelade data och replikaten mi och m0: Var(ri ) = σ2/mi

blir den totala variansen för den relativa responsen Yi således

Var(Yi) = σ2/(r02 · mi) + ri2 · σ2/r04 · m0

Felet för medelvärdet för kontrollerna är omvänt proportionellt mot kvadratroten av genomsnittsvärdet för antalet kontrollreplikat. Det kan ibland vara befogat att ta med historiska data för att kraftigt minska felet. En alternativ metod går ut på att man inte normaliserar data eller anpassar de absoluta responserna – inbegripet responsvärden för kontroller – utan i stället tar med responsvärden för kontroller som en extra parameter som anpassas genom icke-linjär regression. Om man använder sig av en regressionsformel av standardtyp med två parametrar kräver metoden anpassning av tre parametrar, vilket innebär att det krävs fler datapunkter än vid icke-linjär regression av data som normaliserats med hjälp av en förvald kontrollrespons.

Omvända konfidensintervall

Beräkningen av konfidensintervall vid icke-linjär regression genom omvänd uppskattning är ganska komplex och förekommer inte som standardfunktion i normala statistikprogrampaket. Ungefärliga konfidensgränser kan erhållas med hjälp av standardprogram för icke-linjär regression med omparametrisering (Bruce och Versteeg, 1992), vilket innebär att den matematiska ekvationen skrivs om med önskade punktskattningar, t.ex. med EC10- och EC50-värden som de parametrar som ska uppskattas. (Låt funktionen vara I = f (α, β, koncentration) och använd definitionsrelationerna f (α, β, EC10) = 0,1 och f (α, β, EC50) = 0,5 för att ersätta f (α, β, koncentration) med en likvärdig funktion g (EC10, EC50, koncentration.)

En mer direkt beräkning (Andersen m.fl., 1998) kan göras genom att man behåller den ursprungliga ekvationen och använder sig av en Taylorexpansion runt medelvärdena för ri och r0.

Metoder med bootstrapping har blivit populära på senare tid. De går ut på att man uppskattar en empirisk variansfördelning med hjälp av erhållna mätdata i kombination med återkommande omsampling som styrs av en slumptalsgenerator.

LITTERATUR

Kooijman, S. A. L. M., Hanstveit, A. O. och Nyholm, N. (1996). No-effect concentrations in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625–1632.

Draper, N. R. och Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, andra upplagan. Wiley, New York.

Bruce, R. D. och Versteeg, D. J. (1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Ecotoxicity Data. Environ. Toxicol. Chem. 11, 1485–1494.

Andersen, J. S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. och Nyholm, N. (1998). Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405–420.

Tillägg 1

Definitioner

Följande definitioner gäller för denna testmetod.

Tillägg 2

Figur 1 Exempel på mätenhet

Teckenförklaring

1 aktiverat slam 2 syntetiskt medium 3 testkemikalie 4 luft 5 blandningskärl | 6 magnetomrörare 7 mätcell för syre 8 syreelektrod 9 mätinstrument för syre 10 registreringsinstrument

Tillägg 3

Figur 2: Exempel på mätenhet vid användning av BOD-kolv

Teckenförklaring

Tillägg 4

Figur 3: Exempel på hämningskurvor

Teckenförklaring

Tillägg 1

Definitioner

Följande definitioner och förkortningar används i denna testmetod:

Tillägg 2

Beskrivning av Lemna spp.

Den vattenväxt som i allmänt språkbruk kallas andmat – Lemna spp. – tillhör familjen Lemnaceae, i vilken det ingår ett antal arter med världsvid utbredning. Dessa tillhör fyra släkten. Deras olika utseenden och taxonomi har beskrivits ingående (1) (2). Lemna gibba och L. minor är vanliga i tempererade zoner och används ofta i toxicitetstester. Bägge arterna lever i vatten med flytande eller nedsänkt skivlik stam (frond). Från mitten av den undre ytan på varje frond utgår en hårfin rot. Lemna spp. blommar sällan; plantorna förökar sig i stället vegetativt genom att bilda nya fronder (3). I jämförelse med äldre plantor tenderar de yngre att vara blekare, ha kortare rötter och bestå av två till tre fronder av olika storlek. Egenskaperna hos Lemna – liten storlek, enkel uppbyggnad, vegetativ förökning och kort generationstid – gör plantor av detta släkte mycket lämpade för laboratorietester (4) (5).

Eftersom känsligheten för toxisk påverkan sannolikt varierar mellan arterna, godtas enbart jämförelser av känsligheten inom en och samma art.

Exempel på Lemna-arter som har använts vid test: Hänvisningar, arter

Lemna aequinoctialis: Eklund, B. (1996). The use of the red alga Ceramium strictum and the duckweed Lemna aequinoctialis in aquatic ecotoxicological bioassays. Licentiatavhandling 1996:2. Institutionen för systemekologi, Stockholms universitet.

Lemna major: Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of Lemna major as a function of intensity and duration of light. J. Phys. Chem., 29, 935–941.

Lemna minor: US EPA – United States Environmental Protection Agency. (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., Public draft. EPA 712-C-96-156, s. 8.

Lemna gibba: ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test with Lemna gibba G3. E 1415-91 (förnyat godkännande 1998), s. 733–742.

Lemna paucicostata: Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981). Lemna (duckweed) as an indicator of water pollution. I. The sensitivity of Lemna paucicostata to heavy metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10, 1959–1969.

Lemna perpusilla: Clark, J. R. m.fl. (1981). Accumulation and depuration of metals by duckweed (Lemna perpusilla). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5, 87–96.

Lemna trisulca: Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12, 481–483.

Lemna valdiviana: Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19, 2102–2111.

Lemna-arter för test kan erhållas från följande institutioner:

University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria

Department of Botany, University of Toronto

Toronto, Ontario, KANADA, M5S 3 B2

Tfn: +1-416-978-3641

Fax: +1-416-978-5878

e-post: jacreman@botany.utoronto.ca

North Carolina State University

Forestry Dept

Duckweed Culture Collection

Campus Box 8002

Raleigh, NC 27695–8002

USA

Tfn: 001 (919) 515-7572

astomp@unity.ncsu.edu

Institutionen för tillämpad miljövetenskap (ITM), Stockholms universitet

SE-106 91

Stockholm

SVERIGE

Tfn: + 46 8 674 7240

Fax +46 8 674 7636

Umweltbundesamt (UBA)

FG III 3.4

Schichauweg 58

12307 Berlin

TYSKLAND

e-post: lemna@uba.de

LITTERATUR

(1) Hillman, W.S. (1961). The Lemnaceae or duckweeds: A review of the descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27, 221–287.

(2) Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed (Lemnaceae). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, Schweiz.

(3) Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utilization of duckweeds (Lemnaceae family). ISBN 82-991150-0-0. Norges lantbruksvetenskapliga forskningsråd, Universitetet i Oslo.

(4) Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11, 1–14.

(5) Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environmental Research, 52, 7–22.

Tillägg 3

Behandling av stamkulturer

Stamkulturer kan förvaras vid låg temperatur (4–10 °C) under lång tid utan att de behöver startas på nytt. Odlingsmediet för Lemna kan vara samma som det som används i testen, men för stamkulturer kan andra näringsrika medier användas.

Med jämna mellanrum flyttas ett bestämt antal unga, ljusgröna plantor över aseptiskt till nya odlingskärl med färskt medium. Under de kalla betingelser som här rekommenderas kan subodling utföras i upp till tre månader långa intervaller.

Använd kemiskt rena (syratvättade) och sterila odlingskärl av glas. Hanteringen ska ske med aseptiska metoder. Om stamkulturen kontamineras av t.ex. alger eller svampar måste man vidta åtgärder för att avlägsna de kontaminerande organismerna. För alger och de flesta andra kontaminerande organismer kan detta åstadkommas genom ytsterilisering. Ett prov tas av det kontaminerade växtmaterialet och rötterna skärs av. Materialet skakas om kraftigt i rent vatten och hålls sedan nedsänkt i en lösning med 0,5 volymprocent natriumhypoklorit i mellan 30 sekunder och 5 minuter. Växtmaterialet sköljs sedan med sterilt vatten och flyttas över satsvis till odlingskärl med färskt odlingsmedium. Många fronder dör av denna behandling, särskilt om exponeringstiderna är långa, men en del av de överlevande fronderna bör vara fria från kontamination. Dessa kan sedan användas för att ympa nya kulturer.

Tillägg 4

Media

Olika odlingsmedier bör användas för L. minor och L. gibba. För L. minor bör ett medium enligt modifierad svensk standard (SIS) användas, och för L. gibba bör 20X-AAP användas. Sammansättningarna av respektive medium visas i nedanstående tabell. Vid beredning av medierna ska kemikalier av reagenskvalitet eller p.a.-kvalitet användas, och vattnet ska vara avjonat.

Odlingsmedium för Lemna enligt svensk standard (SIS)

Sterilisera stamlösningarna I–V i autoklav (120 °C, 15 minuter) eller genom membranfiltrering (porstorlek ca 0,2 μm).

Sterilisera stamlösning VI (och i tillämpliga fall VII) endast genom membranfiltrering (ej autoklavering).

Förvara de sterila stamlösningarna kallt och mörkt. Kassera stamlösningarna I–V efter sex månader. Stamlösning VI (och i tillämpliga fall VII) kan lagras i en månad.

Stam-lösning nr | Ämne | Koncentration i stamlösning (g/l) | Koncentration i testmedium (mg/ߦl) | Testmedium

Grund-ämne | Koncentration (mg/ߦl)

I | NaNO3 | 8,50 | 85 | Na; N | 32; 14

KH2PO4 | 1,34 | 13,4 | K; P | 6,0; 2,4

II | MgSO4 · 7H2O | 15 | 75 | Mg; S | 7,4; 9,8

III | CaCl2 · 2H2O | 7,2 | 36 | Ca; Cl | 17,5

IV | Na2CO3 | 4,0 | 20 | C | 2.3

V | H3BO3 | 1,0 | 1,00 | B | 0,17

MnCl2 · 4H2O | 0,20 | 0,20 | Mn | 0,056

Na2MoO4 · 2H2O | 0,010 | 0,010 | Mo | 0,0040

ZnSO4 · 7H2O | 0,050 | 0,050 | Zn | 0,011

CuSO4 · 5H2O | 0,0050 | 0,0050 | Cu | 0,0013

Co(NO3)2 · 6H2O | 0,010 | 0,010 | Co | 0,0020

VI | FeCl3 · 6H2O | 0,17 | 0,84 | Fe | 0,17

Na2-EDTA 2H2O | 0,28 | 1,4 | — | —

VII | MOPS (buffert) | 490 | 490 | — | —

Tillsätt följande mängder stamlösningar till 900 ml avjonat vatten för beredning av 1 liter SIS-medium:

10 ml stamlösning I

5 ml stamlösning II

5 ml stamlösning III

5 ml stamlösning IV

1 ml stamlösning V

5 ml stamlösning VI

1 ml stamlösning VII (i tillämpliga fall)

Anmärkning: Ytterligare stamlösning VII (MOPS-buffert) kan behövas för vissa testkemikalier (se punkt 11).

Justera pH till 6,5 ± 0,2 med 0,1 eller 1 mol HCl eller NaOH (beroende på utgångsvärdet). Tillsätt avjonat vatten så att volymen blir 1 liter.

Odlingsmedium 20X-AAP

Bered stamlösningar med sterilt destillerat eller avjonat vatten.

Förvara de sterila stamlösningarna kallt och mörkt. Under dessa förhållanden kan de lagras i minst 6–8 veckor.

Bered fem näringsstamlösningar (A1, A2, A3, B och C) med kemikalier av reagenskvalitet för 20X-AAP odlingsmedium. Tillsätt 20 ml av varje lösning i ca 850 ml avjonat vatten för beredning av odlingsmediet. Justera pH till 7,5 ± 0,1 med 0,1 eller 1 mol HCl eller NaOH (beroende på utgångsvärdet). Tillsätt avjonat vatten så att volymen blir 1 liter. Filtrera sedan mediet genom ett membranfilter med porstorlek på ca 0,2 μm ner i en steril behållare.

Bered odlingsmediet 1–2 dagar före testets genomförande så att pH hinner stabiliseras. Mät pH före testet och justera vid behov genom tillsats av 0,1 eller 1 mol NaOH eller HCl (beroende på utgångsvärdet).

Stam-lösning nr | Ämne | Koncentration i stamlösningen (g/ߦl) | Koncentration i testmediet (mg/ߦl) | Testmedium

Grund-ämne | Koncentration (mg/ߦl)

A1 | NaNO3 | 26 | 510 | Na;N | 190;84

MgCl2 · 6H2O | 12 | 240 | Mg | 58,08

CaCl2 · 2H2O | 4,4 | 90 | Ca | 24,04

A2 | MgSO4 · 7H2O | 15 | 290 | S | 38,22

A3 | K2HPO4 · 3H2O | 1,4 | 30 | K;P | 9,4;3,7

B | H3BO3 | 0,19 | 3,7 | B | 0,65

MnCl2 · 4H2O | 0,42 | 8,3 | Mn | 2,3

FeCl3 · 6H2O | 0,16 | 3,2 | Fe | 0,66

Na2EDTA · 2H2O | 0,30 | 6,0 | — | —

ZnCl2 | 3,3 mg/l | 66 μg/l | Zn | 31 μg/l

CoCl2 · 6H2O | 1,4 mg/l | 29 μg/l | Co | 7,1 μg/l

Na2MoO4 · 2H2O | 7,3 mg/l | 145 μg/l | Mo | 58 μg/l

CuCl2 · 2H2O | 0,012 mg/l | 0,24 μg/l | Cu | 0,080 μg/l

C | NaHCO3 | 15 | 300 | Na;C | 220; 43

Steinbergs medium (enligt ISO 20079)

Koncentrationer och stamlösningar

Ett modifierat Steinbergs medium används i ISO 20079 uteslutande för Lemna minor (eftersom enbart denna art är tillåten i denna standard). Test har dock visat att goda resultat kan uppnås även med Lemna gibba.

Vid beredning av medierna ska kemikalier av reagenskvalitet eller p.a.-kvalitet användas, och vattnet ska vara avjonat.

Bered näringsmediet från stamlösningar eller från ett medium med 10 gånger högre koncentration än testmediet så att mediet får högsta möjliga koncentration utan utfällning.

Stamlösningarna 2 och 3 kan slås samman, liksom 4–7 (beakta då de fastställda koncentrationerna).

Sterilisera stamlösningarna i autoklav (121 °C, 20 minuter) eller gör en sterilfiltrering med porstorlek 0,2 μm, så kan de lagras längre. Stamlösning 8 behandlas genom sterilfiltrering med porstorlek 0,2 μm.

Komponent | Näringsmedium

Makroelement | Molmassa | mg/l | mmol/l

KNO3 | 101,12 | 350,00 | 3,46

Ca(NO3)2 · 4H2O | 236,15 | 295,00 | 1,25

KH2PO4 | 136,09 | 90,00 | 0,66

K2HPO4 | 174,18 | 12,60 | 0,072

MgSO4 · 7H2O | 246,37 | 100,00 | 0,41

Mikroelement | Molmassa | μg/l | μmol/l

H3BO3 | 61,83 | 120,00 | 1,94

ZnSO4 · 7H2O | 287,43 | 180,00 | 0,63

Na2MoO4 · 2H2O | 241,92 | 44,00 | 0,18

MnCl2 · 4H2O | 197,84 | 180,00 | 0,91

FeCl3 · 6H2O | 270,21 | 760,00 | 2,81

EDTA-dinatriumdihydrat | 372,24 | 1500,00 | 4,03

1. Makroelement (koncentrerat 50 ggr) | g/l

KNO3 | 17,50

KH2PO4 | 4,5

K2HPO4 | 0,63

MgSO4 · 7H2O | 5,00

Ca(NO3)2 · 4H2O | 14,75

2. Mikroelement (koncentrerat 1000 ggr) | mg/l

H3BO3 | 120,0

ZnSO4 · 7H2O | 180,0

Na2MoO4 · 2H2O | 44,0

MnCl2 · 4H2O | 180,0

FeCl3 · 6H2O | 760,00

EDTA-dinatriumdihydrat | 1500,00

Beredning av slutkoncentrationen för ett modifierat Steinbergs medium

Tillsätt 20 ml av stamlösningarna 1, 2 och 3 (tabell 2) i ca 900 ml avjonat vatten för att undvika utfällning.

Tillsätt 1,0 ml av stamlösningarna 4, 5, 6, 7 och 8 (tabell 3).

pH ska vara 5,5 ± 0,2 (justera genom tillsats av minsta möjliga volym NaOH-lösning eller HCl).

Justera volymen med vatten till 1000 ml.

Om stamlösningarna är steriliserade och lämpligt vatten används behövs ingen ytterligare sterilisering. Om slutmediet steriliseras ska stamlösning 8 tillsättas efter autoklavering (121 °C, 20 minuter).

Beredning av modifierat Steinbergmedium (koncentrerat 10 ggr) för temporär lagring

Tillsätt 20 ml av stamlösningarna 1, 2 och 3 (tabell 2) i ca 30 ml vatten för att undvika utfällning.

Tillsätt 1,0 ml av stamlösningarna 4, 5, 6, 7 och 8 (tabell 3). Justera volymen med vatten till 100 ml.

pH (vid slutkoncentrationen) ska vara 5,5 ± 0,2.

1 Om inget annat anges

Tillägg 1

Definitioner

1 Slutlig beredning: den sammansatta produkt som innehåller den verksamma kemikalien (det verksamma ämnet) och som säljs i handeln.

Tillägg 2

Förteckning över arter som historiskt sett har använts för växttester

Familj | Art | Svenskt namn

Apiaceae (Umbelliferae) | Daucus carota | Morot

Asteraceae (Compositae) | Helianthus annuus | Solros

Asteraceae (Compositae) | Lactuca sativa | Sallat

Brassicaceae (Cruciferae) | Sinapis alba | Vitsenap

Brassicaceae (Cruciferae) | Brassica campestris var. chinensis | Salladskål

Brassicaceae (Cruciferae) | Brassica napus | Raps

Brassicaceae (Cruciferae) | Brassica oleracea var. capitata | Vitkål

Brassicaceae (Cruciferae) | Brassica rapa | Rova

Brassicaceae (Cruciferae) | Lepidium sativum | Kryddkrasse

Brassicaceae (Cruciferae) | Raphanus sativus | Rädisa

Chenopodiaceae | Beta vulgaris | Sockerbeta

Cucurbitaceae | Cucumis sativus | Gurka

Fabaceae (Leguminosae) | Glycine max (G. soja) | Sojaböna

Fabaceae (Leguminosae) | Phaseolus aureus | Mungböna

Fabaceae (Leguminosae) | Phaseolus vulgaris | Böna

Fabaceae (Leguminosae) | Pisum sativum | Ärtor

Fabaceae (Leguminosae) | Trigonella foenum-graecum | Bockhornsklöver

Fabaceae (Leguminosae) | Lotus corniculatus | Käringtand

Fabaceae (Leguminosae) | Trifolium pratense | Rödklöver

Fabaceae (Leguminosae) | Vicia sativa | Vicker

Linaceae | Linum usitatissimum | Lin

Polygonaceae | Fagopyrum esculentum | Bovete

Solanaceae | Solanum Lycopersicon | Tomat

Liliaceae (Amarylladaceae) | Allium cepa | Lök

Poaceae (Gramineae) | Avena sativa | Havre

Poaceae (Gramineae) | Hordeum vulgare | Korn

Poaceae (Gramineae) | Lolium perenne | Engelskt rajgräs

Poaceae (Gramineae) | Oryza sativa | Ris

Poaceae (Gramineae) | Secale cereale | Råg

Poaceae (Gramineae) | Sorghum bicolor | Durra

Poaceae (Gramineae) | Triticum aestivum | Vete

Poaceae (Gramineae) | Zea mays | Majs

Tillägg 3

Förteckning över potentiellt användbara arter som inte är grödor

OECD:s potentiellt användbara arter för testning av toxicitet

Anmärkning: Följande tabell innehåller uppgifter om 52 arter som inte är grödor (hänvisningar ges inom parentes för varje post). Grobarhetssiffrorna kommer från publicerade källor och är bara tänkta som allmän vägledning. Den enskilda erfarenheten kan variera beroende på den källa fröna kommer ifrån och andra faktorer.

APIACEAE Torilis japónica (rödkörvel) | А, В störda områden, häckar, betesmarker (16, 19) | 1,7–1,9 (14, 19) | L = M (14) | 0 (1, 19) | 5 (50 %) (19) | kall stratifiering (7, 14, 18, 19) mognande evt. nödvändigt (19) grobarheten hämmas av mörker (1, 19) inga särskilda behandlingar (5) | EFTER (5)

ASTERACEAE Bellis perennis (tusensköna) | Ρ gräsmark, åkermark, gräsmattor (16, 19) | 0,09–0,17 (4, 19) | L = M (14) | 0 (4) | 3 (50 %) (19) 11 (100 %) (18) | grobarheten påverkas ej av strålning (18, 19) inga särskilda behandlingar (4, 14) | EFTER (4) | A, D, F | 7

Centaurea cyanus (blåklint) | A fält, vägkanter, öppen miljö (16) | 4,1–4,9 (4, 14) | L = M (14) | 0–3 (2, 4, 14) | 14–21 (100 %) (14) | Inga särskilda behandlingar (2, 4) | EFTER (2,4) | A, D, E, F | 7

Centaurea nigra (svartklint) | Ρ fält, vägkanter, öppen miljö (16, 19) | 2,4–2,6 (14, 19) | L = M (14) | 0 (19) | 3 (50 %) (19) 4 (97 %) (18) | mognande evt. nödvändigt (18, 19) grobarheten hämmas av mörker (19) inga särskilda behandlingar (5, 14, 26) | EFTER (5, 22, 26) | A

Inula helenium (ålandsrot) | Ρ fuktiga, störda områden (16) | 1–1,3 (4, 14, 29) | 0 (4, 29) | inga särskilda behandlingar (4) | EFTER (4) | A, F

Leontodon hispidus (sommarfibbla) | Ρ fält, vägkanter, störda områden (16, 19) | 0,85–1,2 (14, 19) | L = M (14) | 0 (19) | 4 (50 %) (19) 7 (80 %) (18) | grobarheten hämmas av mörker (17, 18, 19) inga särskilda behandlingar (5, 23) | EFTER (5, 22, 23)

Rudbeckia hirta (sträv rudbeckia) | Β, Ρ störda områden (16) | 0,3 (4, 14) | L = M (14) | 0 (4, 33) | < 10 (100 %) (33) | inga särskilda behandlingar (4, 14, 33) | EFTER (4, 33) | C, D, E, F

Solidago canadensis (kanadensiskt gullris) | Ρ betesmark, öppna områden (16) | 0,06–0,08 (4, 14) | L = M (11) | 0 (4) | 14–21 (11) | blanda med lika delar sand och blötlägg i 500ppm gibberellinsyra i 24 timmar (11) inga särskilda behandlingar (4) | EFTER (4) | E, F

Xanthium pensylvanicum (gullfrö) | A fält, öppen miljö (16) | 25–61 (14, 29) | 0 (1) 5 (29) | grobarheten kan begränsas av mörker (1) blötlägg i varmt vatten i 12 timmar (29) | FÖRE & EFTER (31) | A

Xanthium strumarium (mörkt gullfrö) | A fält, öppen miljö (16) | 67,4 (14) | L = M (14) | 10–20 (6, 21) | inga särskilda behandlingar (6, 14, 21) | FÖRE & EFTER (6, 21, 28, 31) | A

BRASSICACEAE Cardamine pratensis (ängsbräsma) | Ρ fält, vägkanter, gräsmattor(16, 19) | 0,6 (14, 19) | L = M (14) | 0 (19) | 5 (50 %) (19) 15 (98 %) (18) | grobarheten hämmas av mörker (18, 19) inga särskilda behandlingar (5, 14, 22) | EFTER (5, 22) | F

CARYOPHYLLACEAE Lychnis flos-cuculi (gökblomster) | Ρ (16) | 0,21 (14) | L = M (14) | < 14 (100 %) (14, 25) | mognande evt. nödvändigt (18) inga särskilda behandlingar (5, 14, 15, 22 och 26) | EFTER (5, 15, 22–26) | F

CHENOPODIACEAE Chenopodium album (svinmålla) | A åkerkanter, störda områden (16, 19) | 0,7–1,5 (14, 19, 34) | L = M (14) | 0 (1, 19) | 2 (50 %) (19) | behandlingen varierar beroende på frönas färg (19) torrlagring under vintervila (19) grobarheten hämmas av mörker (1, 18, 19) kall stratifiering (18) inga särskilda behandlingar (14, 34) | FÖRE & EFTER (28, 31, 34) | A | 32

CLUSIACEAE Hypericum perforatum (johannesört) | Ρ fält, åkermark, öppen miljö (16, 19) | 0,1–0,23 (14, 19) | L = M (14) | 0 (1, 19) | 3 (19) 11 (90 %) (18) | grobarheten hämmas av mörker (1, 18, 19) inga särskilda behandlingar (5, 14, 15, 25, 27) | EFTER (5, 15, 25, 27) | A, E, F

CONVOLVULACEAE Ipomoea hederacea (murgrönsvinda) | A vägkanter, öppen miljö, veteåkrar (16) | 28,2 (14) | L > M (6, 10) | 10–20 (6, 10, 21) | 4 (100 %) (10) | grobarheten påverkas inte av strålning (1) inga särskilda behandlingar (6, 21) | FÖRE & EFTER (6, 12, 21, 28) | A

CYPERACEAE Cyperus rotundus (runt cypergräs) | Ρ åkermark, betesmark, vägkanter (16, 30) | 0,2 (14) | L = M (14) | 0 (1) 10–20 (6, 10). | 12 (91 %) (10) | grobarheten hämmas av mörker (1) inga särskilda behandlingar (6, 10, 14) | FÖRE & EFTER (6, 28, 31) | B | 7

Sesbania exaltata (svenskt namn saknas) | A alluvial jord (16) | 11–13 (9, 14) | L > M (9) | 10–20 (9, 21) | blötlägg fröna i vatten i 24 timmar (9) grobarheten påverkas inte av strålning (1) inga särskilda behandlingar (21) | FÖRE & EFTER (9, 21, 28, 31) | A

Trifolium pratense (rödklöver) | Ρ fält, vägkanter, åkermark (16, 19) | 1,4–1,7 (14, 19) | L = M (14) | 1 (50 %) (19) | scarifiering (14, 18) mognande evt. nödvändigt (19) grobarheten påverkas inte av strålning (1, 19) inga särskilda behandlingar (5) | EFTER (5) | A, E, F

LAMIACEAE Leonurus cardiaca (hjärtstilla) | Ρ öppna områden (16) | 0,75–1,0 (4, 14) | L = M (14) | 0 (4) | inga särskilda behandlingar (4, 14) | EFTER (4) | F

Mentha spicata (grönmynta) | Ρ fuktiga områden (16) | 2,21 (4) | 0 (4) | inga särskilda behandlingar (4) | EFTER (4) | F

Nepeta cataria (kattmynta) | Ρ störda områden (16) | 0,54 (4, 14) | L = M (14) | 0 (4) | inga särskilda behandlingar (2, 4, 14) | EFTER (2, 4) | F

Prunella vulgaris (brunört) | Ρ åkermark, gräsbevuxna områden, störda områden (16, 19) | 0,58–1,2 4, 14, 19 | L = M (14) | 0 4, 19 | 5 (50 %) (19) 7 (91 %) (18) | grobarheten hämmas av mörker (18, 19) större grobarhet med större frön (1) inga särskilda behandlingar (4, 14, 22) | EFTER (4, 22) | A, F

Stachys officinalis (humlesuga) | Ρ gräsmark, åkerkanter (19) | 14–18 (14, 19) | L = M (14) | 7 (50 %) (19) | inga särskilda behandlingar (5, 14, 22) | EFTER (5, 22) | F

MALVACEAE Abutilón theophrasti (lindmalva) | A fält, öppen miljö (16) | 8,8 (14) | L = M (14) | 10–20 (6, 10, 21) | 4 (84 %) (10) | scarifiering (14) inga särskilda behandlingar (5, 10, 21) | FÖRE & EFTER (6, 22, 28, 31) | A, F

Sida spinosa (taggmalva) | A fält, vägkanter (16) | 3,8 (14) | L = M (14) | 10–20 6, 21 | scarifiering (14) grobarheten påverkas inte av strålning (1) inga särskilda behandlingar (6, 21) | FÖRE & EFTER 6, 21, 28, 31 | A, F

PAPAVERACEAE Papaver rhoeas (kornvallmo) | A fält, åkermark, störda områden (16, 19) | 0,1–0,3 4, 14, 19, 29 | L = M (14) | 0 (4, 29) | 4 (50 %) (19) | kall stratifiering & scarifiering (1, 19, 32) inga särskilda behandlingar (4, 14, 29) | EFTER (4) | A, D, E, F, G

POACEAE Agrostis tenuis (rödven) | gräsmattor, betesmark (16) | 0,07 (14) | L > M (Ю) | 20 (10) | 10 (62 %) (10) | grobarheten hämmas av mörker (1, 17–19) inga särskilda behandlingar (10) | EFTER (10) | A, E

Alopecurus myosuroides (renkavle) | A fält, öppen miljö (16) | 0,9–1,6 (29, 34) | L = M (14) | 2 (29) | < 24 (30 %) (34) | scarifiering (14) behandla med 101 mg/l KNO3 (14) varm stratifiering (1) grobarheten hämmas av mörker (1) inga särskilda behandlingar (34) | FÖRE & EFTER (28, 34) | A | 32

Avena fatua (flyghavre) | A odlade områden, öppen miljö (16) | 7–37,5 (14, 30) | L = M (14) L > M (6) | 10–20 (6, 10). | 3 (70 %) (18) | scarifiering (7, 32) mörker hämmar grobarheten (1) kall stratifiering (1, 18) inga särskilda behandlingar (6, 10, 14) | FÖRE & EFTER (6, 10, 28, 31) | A

Bromus tectorum (taklosta) | A fält, vägkanter, åkermark (16) | 0,45–2,28 (14, 29) | L = M (14) | 3 (29) | mognadsperiod (1, 7, 32) grobarheten hämmas av ljus (1) inga särskilda behandlingar (14) | FÖRE & EFTER (28, 31) | A

Cynosurus cristatus (kamäxing) | P fält, vägkanter, öppen miljö (16, 19) | 0,5–0,7 (14, 19, 29) | L = M (14) | 0 (29) | 3 (50 %) (19) | grobarheten påverkas inte av strålning (19) inga särskilda behandlingar (14, 29) | EFTER (5) | A

Digitaria sanguinalis (blodhirs) | A fält, gräsmattor, öppen miljö (16) | 0,52–0,6 (14, 30) | L = M (14) | 10-20 (21) | 7 (75 %) 14 (94 %) (7) | scarifiering, kall stratifiering, & mognande (1, 7, 14, 32) behandlas med 101 mg/l KNO3 (14) grobarheten hämmas av mörker (1) inga särskilda behandlingar (21) | FÖRE & EFTER (18, 25, 31) | A

Echinochloa crus-galli (hönshirs) | A (16) | 1,5 (14) | L = M (14) L > M (3) | 10–20 (7, 21) | scarifiering (7, 32) grobarheten påverkas inte av strålning (1) inga särskilda behandlingar (3, 14, 21) | FÖRE & EFTER (3, 21, 28, 31) | A

Elymus canadensis (kanadaelm) | P strandnära, störda områden (16) | 4–5 (14, 30) | L = M (11) | 1 (11) | 14–28 (11) | inga särskilda behandlingar (2, 11) | EFTER (2) | C, D, E

Festuca pratensis (ängssvingel) | P fält, fuktiga områden (16, 19) | 1,53–2,2 (16, 19) | L = M (14) L > M (10) | 20 (10) | 9 (74 %) (10) 2 (50 %) (19) | inga särskilda behandlingar (10, 19) | EFTER (10) | A | 7

Phieum pratense (timotej) | P betesmark, åkermark, störda områden (16, 19) | 0,45 (14, 19) | L > M (10, 14) | 0–10 (10, 19) | 2 (74 %) (10) 8 (50 %) (19) | grobarheten hämmas av mörker (19) grobarheten påverkas inte av strålning (17) inga särskilda behandlingar (10, 14, 17, 19) | EFTER (10) | A, E

POLYGONACEAE Polygonum convolvulus (åkerbinda) | A öppen miljö, vägkanter (16) | 5–8 (4, 14, 29) | L = M (20) | 0–2 (4, 29) | Kall stratifiering i 4–8 veckor (1, 2, 4, 20, 29) grobarheten påverkas inte av strålning (1) | FÖRE & EFTER 1, 2, 20, 28, 31 | A | 32

Polygonum lapathifolium (pilört) | A fuktig jord (16) | 1,8–2,5 (14) | L > M (6) | 5 (94 %) (18) | Grobarheten påverkas inte av strålning (1) grobarheten hämmas av mörker (18) kall stratifiering (1) inga särskilda behandlingar (5) | FÖRE & EFTER (6) | A, E

Polygonum pennsylvanicum (svenskt namn saknas) | A fält, öppen miljö (16) | 3,6–7 (14, 29) | 2 (29) | kall stratifiering i 4 v. vid 0–5 °C (1, 29) grobarheten hämmas av mörker (1) | FÖRE (31) | A, E

Polygonum persicaria (åkerpilört) | A störda områden, åkermark (16, 19) | 2,1–2,3 (14, 19) | L > M (13) | 0 (19) | < 14 (13) 2 (50 %) (19) | scarifiering, kall stratifiering, behandling med gibberellinsyra (14) kall stratifiering, mognande (17–19) grobarheten hämmas av mörker (19) inga särskilda behandlingar (13) | EFTER (13) | A | 32

Rumex crispus (krusskräppa) | P åkermark, vägkanter, öppna områden (16, 19) | 1,3–1,5 (4, 14, 19) | L = M (14, 33) | 0 (4, 19, 33) | 3 (50 %) (19) 6 (100 %) (33) | grobarheten hämmas av mörker (18, 19) mognande evt. nödvändigt (18) inga särskilda behandlingar (4, 14, 33) | EFTER (4, 33) | A, E | 32

PRIMULACEAE Anagallis arvensis (rödmire) | A åkermark, öppna områden, störda områden (16, 19) | 0,4–0,5 (4, 14, 19) | L = M (14) | 1 (50 %) (19) | kall stratifiering, behandling med gibberellinsyra (1,14, 18, 19, 32) ljus krävs för groning (1) inga särskilda behandlingar (2, 4) | EFTER (2,4) | A, F

RANUNCULACEAE Ranunculus acris (smörblomma) | Ρ åkermark, vägkanter, öppna områden (16, 19) | 1,5–2 (14, 19, 29) | L = M (14) | 1 (29) | 41–56 (19, 29) | inga särskilda behandlingar (5, 14, 22, 24–26) | EFTER (5, 22, 24–26) | 32

ROSACEAE Geum urbanum (nejlikrot) | Ρ häckar, fuktiga områden (16, 19) | 0,8–1,5 (14, 19) | L = M (14) | 0 (19) | 5 (50 %) (19) 16 (79 %) (18) | grobarheten hämmas av mörker (18, 19) varm stratifiering (1) inga särskilda behandlingar (5, 14, 22, 25, 26) | EFTER (5, 22, 25, 26) | A

RUBIACEAE Galium aparine (snärjmåra) | A åkermark, fuktiga områden, störda områden (16, 19) | 7–9 (14, 19) | L = M (14) | 5 (50 %) (19) 6 (100 %) (18) | kall stratifiering (1, 18, 19) grobarheten påverkas inte av strålning (18, 19) ljus hämmar grobarheten (1) inga särskilda behandlingar (6, 14) | FÖRE & EFTER (6, 28) | A | 32

Galium mollugo (stormåra) | Ρ häckvallar, öppna områden (8) | 7 (29) | L = M (14) | 2 (29) | inga särskilda behandlingar (5, 14, 22, 24, 26, 29) | EFTER (5, 22, 24, 26) | A

SCROPHULARIACEAE Digitalis purpurea (fingerborgsblomma) | Β, P häckar, öppna områden (16, 19) | 0,1–0,6 (4, 14, 19) | L = M (14) | 0 4, 19 | 6 (50 %) (19) 8 (99 %) (18) | grobarheten hämmas av mörker (1, 17 och 19) inga särskilda behandlingar (4, 22 och 26) | EFTER (4, 22–26) | D, F, G

Veronica persica (trädgårdsveronika) | A åkermark, öppna områden, störda områden (16, 19) | 0,5–0,6 (14, 19) | L = M (14) | 0 (19) | 3 (19) 5 (96 %) (18) | grobarheten hämmas av mörker (18, 19) kall stratifiering (18) inga särskilda behandlingar (14) | FÖRE & EFTER (28) | A | 32

Fröleverantörer som anges i tabellen

Leverantörs-ID | Leverantörsuppgifter

A | Herbiseed New Farm, Mire Lane, West End, Twyford RG10 0NJ ENGLAND +44 (0) 1189 349 464 www.herbiseed.com

B | Tropilab Inc. 8240 Ulmerton Road, Largo, FL 33771-3948 USA (727) 344 – 4050 www.tropilab.com

C | Pterophylla – Native Plants & Seeds #316 Regional Road 60, RR#1, Walsingham, ON N0E 1X0 KANADA (519) 586 – 3985

D | Applewood Seed Co. 5380 Vivian St., Arvada, CO 80002 USA (303) 431 – 7333 www.applewoodseed.com

E | Ernst Conservation Seeds 9006 Mercer Pike, Meadville, PA 16335 USA (800) 873 – 3321 www.ernstseed.com

F | Chiltern Seeds Bortree Stile, Ulverston, Cumbria LA12 7PB ENGLAND + 44 1229 581137 www.chilternseeds.co.uk

G | Thompson & Morgan P.O. Box 1051, Fort Erie, ON L2A 6C7 KANADA (800) 274 – 7333 www.thompson-morgan.com

HÄNVISNINGAR

(1) Baskin, C. C. och Baskin, J. M. (1998). Seeds. Academic Press, Toronto

(2) Blackburn, L. G. och Boutin, C. (2003). Subtle effects of herbicide use in the context of genetically modified crops: a case study with glyphosate (Round-Up®). Ecotoxicology, 12, 271–285.

(3) Boutin, C., Lee, H-B., Peart, T., Batchelor, P. S och Maguire, R. J. (2000). Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Environmental Toxicology & Chemistry, 19:10, 2532–2541.

(4) Boutin, C., Elmegaard, N. och Kjaer, C. (2004). Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: implications for risk assessment. Ecotoxicology, 13, 349–369.

(5) Breeze, V., Thomas, G. och Butler, R. (1992). Use of a model and toxicity data to predict the risks to some wild plant species from drift of four herbicides. Annals of Applied Biology, 121, 669–677.

(6) Brown, R. A. och Farmer, D. (1991). Track-sprayer and glasshouse techniques for terrestrial plant bioassays with pesticides. I: Plants for toxicity assessment, vol. 2. ASTM STP 1115, J. W. Gorsuch, W. R. Lower, W. Wang och M. A. Lewis (red.). American Society for Testing & Materials, Philadelphia. s. 197–208.

(7) Buhler, D. D. och Hoffman, M. L. (1999). Anderson's guide to practical methods of propagating weeds and other plants. Weed Science Society of America, Lawrence, K.

(8) Clapham, P. A., Tutin, T. G. och Warburg, E .F. (1981). Excursion flora of the British Isles, tredje upplagan. Cambridge University Press, Cambridge

(9) Clay, P. A. och Griffin, J. L. (2000). Weed seed production and seedling emergence response to late-season glyphosate applications. Weed Science, 48, 481–486.

(10) Cole, J. F. H. och Canning, L. (1993). Rationale for the choice of species in the regulatory testing of the effects of pesticides on terrestrial non-target plants. BCPC – Weeds. s. 151–156.

(11) Fiely, M. (Ernst Conservation Seeds). (2004). Pers. med. (www.ernstseed.com)

(12) Fletcher, J. S., Johnson, F. L. och McFarlane, J. C. (1990). Influence of greenhouse versus field testing and taxonomic differences on plant sensitivity to chemical treatment. Environmental Toxicology & Chemistry, 9, 769–776.

(13) Fletcher, J. S., Pfleeger, T. G., Ratsch, H. C. och Hayes, R. (1996). Potential impact of low levels of chlorsulfuron and other herbicides on growth and yield of nontarget plants. Environmental Toxicology & Chemistry, 15:7, 1189–1196.

(14) Flynn, S., Turner, R. M., och Dickie, J. B. (2004). Seed Information Database (utgåva 6.0, oktober 2004) Royal Botanic Gardens, Kew (www.rbgkew.org.uk/data/sid)

(15) Franzaring, J., Kempenaar, C. och van der Eerden, L. J. M. (2001). Effects of vapours of chlorpropham and ethofumesate on wild plant species. Environmental Pollution, 114, 21–28.

(16) Gleason, H.A. och Cronquist, A. (1991). Manual of vascular plants of northeastern United States and adjacent Canada, andra upplagan. New York Botanical Garden, Bronx, NY

(17) Grime, J. P. (1981). The role of seed dormancy in vegetation dynamics. Annals of Applied Biology, 98, 555–558.

(18) Grime, J. P., Mason, G., Curtis, A. V., Rodman, J., Band, S. R., Mowforth, M. A. G., Neal, A. M. och Shaw, S. (1981). A comparative study of germination characteristics in a local flora. Journal of Ecology, 69, 1017–1059.

(19) Grime, J. P., Hodgson, J. G. och Hunt, R. (1988). Comparative plant ecology: a functional approach to common British species. Unwin Hyman Ltd., London

(20) Kjaer, C. (1994). Sublethal effects of chlorsulfuron on black bindweed (Polygonum convolvulus L.). Weed Research, 34, 453–459.

(21) Klingaman, T. E., King, C. A. och Oliver, L. R. (1992). Effect of application rate, weed species, and weed stage of growth on imazethapyr activity. Weed Science, 40, 227–232.

(22) Marrs, R. H., Williams, C. T., Frost, A. J. och Plant, R. A. (1989). Assessment of the effects of herbicide spray drift on a range of plant species of conservation interest. Environmental Pollution, 59, 71–86.

(23) Marrs, R. H., Frost, A. J. och Plant, R.A. (1991). Effects of herbicide spray drift on selected species of nature conservation interest: the effects of plant age and surrounding vegetation structure. Environmental Pollution, 69, 223–235.

(24) Marrs, R. H., Frost, A. J. och Plant, R.A. (1991). Effects of mecoprop drift on some plant species of conservation interest when grown in standardized mixtures in microcosms. Environmental Pollution, 73, 25–42.

(25) Marrs, R. H., Frost, A. J., Plant, R. A. och Lunnis, P. (1993). Determination of buffer zones to protect seedlings of non-target plants from the effects of glyphosate spray drift. Agriculture, Ecosystems, & Environment, 45, 283–293.

(26) Marrs, R. H. och Frost, A. J. (1997). A microcosm approach to detection of the effects of herbicide spray drift in plant communities. Journal of Environmental Management, 50, 369–388.

(27) Marshall, E. J. P. och Bernie, J. E. (1985). Herbicide effects on field margin flora. BCPC – Weeds. s. 1021–1028.

(28) McKelvey, R. A., Wright, J. P. och Honegger, J. L. (2002). A comparison of crop and non-crop plants as sensitive species for regulatory testing. Pest Management Science, 58, 1161–1174.

(29) Morton, S. (Herbiseed). (2004). Pers. med. (http://www.herbiseed.com)

(30) USDA, NRCS. (2004). The Plants Database, version 3.5. (http://plants.usda.gov). National Plant Data Centre, Baton Rouge, LA 70874-4490 USA

(31) USEPA. (1999). One-Liner Database. [U.S. E.P.A./Office of Pesticide Programs/Environmental Fate and Effects Division/Environmental Epidemiology Branch].

(32) Webster, R. H. (1979). Technical Report No. 56: Growing weeds from seeds and other propagules for experimental purposes. Agricultural Research Council Weed Research Organization, Oxford.

(33) White, A. L. och Boutin, C. (National Wildlife Research Centre, Environment Canada). (2004). Pers. med.

(34) Zwerger, P. och Pestemer, W. (2000). Testing the phytotoxic effects of herbicides on higher terrestrial non-target plants using a plant life-cycle test. Z. PflKrankh. Pflschutz: Sonderh., 17, 711–718.

1 A = Annueller, В = Bienner, Ρ = Perenner.

2 Hänvisningarna 11,14 och 33 gäller andelen ljus (L) och mörker (M) som krävs för att framkalla groning. Referenserna 3, 6, 9, 10, 13, 20 gäller odlingsförhållandena i växthus.

3 0 mm betyder att fröna såddes på markytan eller att fröna behöver ljus för att gro.

4 Siffrorna står för det antal dagar under vilka en viss procentandel av fröna grodde enligt den källa det hänvisas till, t.ex. 3 dagar (50 %) groning (hänvisning 19).

5 Uppgifter om mognandets och/eller stratifieringens varaktighet finns inte alltid att tillgå. Med undantag för krav som rör kylbehandling anges inte temperaturförhållandena eftersom man har begränsad kontroll över temperaturen vid tester i växthus. De flesta frön kommer att gro under de normala temperaturvariationerna i växthus.

6 Betecknar att arten användes i ett toxicitetstest med herbicider antingen före (FÖRE) och/eller efter (EFTER) groning.

7 Här ges exempel på kommersiella fröleverantörer.

8 Här anges två alternativa källor som har använts.

Tillägg 4

Exempel på lämpliga odlingsbetingelser för vissa arter av grödor

Följande betingelser har befunnits lämpliga för tio arter av grödor, och de kan användas som vägledning för tester i odlingskammare med vissa andra arter:

Koncentration av koldioxid: 350 ± 50 ppm.

Relativ luftfuktighet 70 ± 5 % under ljusperioder och 90 ± 5 % under mörkerperioder.

Temperatur: 25 ± 3 °C under dagen, 20 ± 3 °C under natten.

Fotoperiod: 16 h ljus/8 h mörker. Ljuset ska ha en genomsnittlig våglängd på 400–700 nm.

Ljus: luminans 350 ± 50 μE/m2/s, uppmätt högst upp i krontaket.

Grödorna är följande:

tomat (Solanum lycopersicon),

gurka (Cucumis sativus),

trädgårdssallat (Lactuca sativa),

sojaböna (Glycine max),

kål (Brassica oleracea var. capitata),

morot (Daucus carota),

havre (Avena sativa),

engelskt rajgräs (Lolium perenne),

sockermajs (Zea mays),

lök (Allium cepa).

Tillägg 1

Definitioner

I denna testmetod gäller följande definitioner:

Tillägg 2

Fastställande av den maximala vattenhållningskapaciteten

Bestämning av den syntetiska jordens vattenhållningskapacitet

Följande metod har visat sig vara lämplig. Den beskrivs i bilaga C till ISO DIS 11268-2.

Samla in en fastställd kvantitet (t.ex. 5 g) testjordsubstrat med hjälp av en lämplig anordning (jordborr med rör osv.). Täck botten av röret med en bit filterpapper och fyll det med vatten. Placera det därefter på en ställning i ett vattenbad. Röret bör gradvis nedsänkas i vattnet tills vattenytan är ovanför jordytan. Det bör därefter lämnas i vattnet i cirka 3 timmar. Eftersom allt vatten som absorberas av jordens kapillärer inte kan hållas kvar bör jordprovet dräneras i 2 timmar genom att röret placeras på en bädd av mycket fuktig finmald kvartssand i ett slutet kärl (för att förhindra uttorkning). Provet bör sedan torkas till en konstant vikt vid 105 °C och vägas. Vattenhållningskapaciteten (WHC) ska beräknas enligt följande:

där

HÄNVISNINGAR:

ISO (Internationella standardiseringsorganisationen) (1999). Markundersökningar – Föroreningars effekt på daggmaskar (Eisenia fetida). Del 2: Bestämning av effekter på reproduktion, nr 11268-2. ISO, Genève.

Tillägg 3

Bestämning av jordens ph-värde

Följande metod för bestämning av pH-värdet i ett jordprov bygger på beskrivningen i ISO 10390 (Markundersökningar – Bestämning av pH).

En bestämd mängd jord torkas i rumstemperatur i minst 12 timmar. En suspension av jorden (som innehåller minst 5 gram jord) bereds därefter i fem gånger sin volym med antingen 1 M kaliumklorid (KCl) av analyskvalitet eller 0,01 M kalciumkloridlösning (CaCl2) av analyskvalitet. Suspensionen skakas därefter omsorgsfullt i fem minuter. Efter skakning får suspensionen stå och klarna i minst 2 timmar men högst 24 timmar. Vätskefasens pH mäts sedan med en pH-mätare som före varje mätning kalibrerats med lämpliga buffertlösningar (t.ex. pH 4,0 och 7,0).

HÄNVISNINGAR:

ISO (Internationella standardiseringsorganisationen) (1994). Markundersökningar – Bestämning av pH, nr 10390. ISO, Genève.

Tillägg 4

Odlingsförhållanden för Enchytraeus sp.

Småringmaskar av arten Enchytraeus albidus (liksom andra Enchytraeus-arter) kan odlas i stora plastlådor (t.ex. 30 × 60 × 10 cm) fyllda med en blandning av syntetisk jord och naturlig, okontaminerad trädgårdsjord i förhållandet 1:1. Kompostmaterial bör undvikas eftersom det kan innehålla giftiga kemikalier såsom tungmetaller. Fauna bör avlägsnas från jorden före användning (t.ex. genom djupfrysning). Ett substrat som består endast av syntetisk jord kan också användas men reproduktionstakten kan vara lägre än den som kan uppnås med ett blandat jordsubstrat. Det substrat som används för odling bör ha pH 6,0 ± 0,5.

Kulturen förvaras mörkt vid en temperatur på 15–20 ± 2 °C. Temperaturen får inte överstiga 23 °C. Jorden ska hållas fuktig men får inte bli våt. Fukthalten är lämplig om det sipprar fram små vattendroppar mellan fingrarna när jorden pressas försiktigt i handen. Man måste undvika att anoxiska förhållanden utvecklas genom att se till att odlingsbehållarnas lock möjliggör tillräckligt gasutbyte med atmosfären. Jorden luckras försiktigt varje vecka för att underlätta luftning.

Maskarna kan utfodras med havreflingor. Havreflingorna bör förvaras i slutna kärl och autoklaveras eller hettas upp före användning för att undvika angrepp av mjölkvalster (t.ex. Glyzyphagus sp., Astigmata, Acarina) eller rovkvalster (t.ex. Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina). Efter värmebehandlingen bör flingorna malas så att de enkelt kan spridas på jordytan. Havreflingorna kan då och då kompletteras med vitaminer, mjölk och torskleverolja. Andra lämpliga foderkällor är bagerijäst och fiskfodret TetraMin.

Utfodring sker ungefär två gånger i veckan. En lämplig mängd havreflingor strös på jordytan eller blandas omsorgsfullt ner i substratet när jorden luckras upp för att underlätta luftning. Den absoluta mängden foder som ges beror på antalet maskar i substratet. Mängden foder bör ökas om allt äts upp inom en dag efter utfodring. Omvänt gäller att om fodret ligger kvar på markytan vid den andra utfodringen (en vecka senare) bör mängden foder minskas. Foder som är angripet av svamp avlägsnas och ersätts. Efter tre månader överförs maskarna till ett nyberett substrat.

Odlingsförhållandena anses vara tillfredsställande om maskarna: (a) inte försöker ta sig upp ur jordsubstratet, (b) rör sig snabbt genom jorden, (c) har en glansig yta utan vidhäftande jordpartiklar, (d) har en mer eller mindre vitaktig färg, (e) är av varierande ålder i odlingarna och (f) förökar sig kontinuerligt.

Tillägg 5

Testförfarande med andra Enchytraeus-arter

Val av art

Andra arter än E. albidus kan användas, men testförfarandet och giltighetskriterierna bör anpassas i enlighet med detta. Eftersom många Enchytraeus-arter är lätt tillgängliga och kan hållas på ett tillfredsställande sätt i laboratoriemiljö, är det viktigaste kriteriet för urval av andra arter än E. albidus artens ekologiska betydelse och dessutom likvärdig känslighet. Det kan också finnas formella skäl för ett byte av arter. I länder där E. albidus inte förekommer och inte kan importeras (t.ex. på grund av karantäntvång) är det till exempel nödvändigt att använda en annan Enchytraeus-art.

Exempel på lämpliga alternativa arter

Enchytraeus crypticus (Westheide & Graefe 1992): Under de senaste åren har denna art ofta använts i ekotoxikologiska studier eftersom den är lätt att odla och testa. Den är dock liten, och detta gör hanteringen svårare jämfört med E. albidus (särskilt i de skeden som föregår kontrastfärgningen). E. crypticus existens på fältet har inte med säkerhet kunnat bekräftas, eftersom den endast har beskrivits i daggmaskodlingar. Dess ekologiska krav är därför inte kända.

Enchytraeus buchholzi (Vejdovsky 1879): Detta namn omfattar förmodligen en grupp närbesläktade arter som är svåra att särskilja morfologiskt. Dess användning för testning rekommenderas inte förrän man kan fastställa arttillhörigheten för de exemplar som används i testet. E. buchholzi brukar återfinnas på ängsmark och i störda områden såsom vägkanter.

Enchytraeus luxuriosus: Denna art var ursprungligen känd som E. minutus, men har nyligen beskrivits (1). Den upptäcktes av U. Graefe (Hamburg) på en äng nära St. Peter-Ording (Schleswig-Holstein, Tyskland). E. luxuriosus är ungefär hälften så stor som E. albidus men är större än övriga arter som diskuteras här och kan därför vara ett bra alternativ till E. albidus.

Enchytraeus bulbosus (Nielsen & Christensen 1963): Denna art har hittills rapporterats från tyska och spanska mineraljordar, där den är allmän men vanligtvis inte rikt förekommande. I jämförelse med andra små arter av detta släkte är den relativt lätt att identifiera. Ingenting är känt om dess beteende i laboratorieförsök eller dess känslighet för kemikalier. Den har dock visat sig vara lätt att odla (E. Belotti, personlig kommunikation).

Uppfödningsförhållanden

Alla Enchytraeus-arterna kan odlas i samma substrat som används för E. albidus. Deras ringa storlek innebär att odlingskärlen kan vara mindre och att samma foder kan användas men med justerad portionsstorlek. Livscykeln för dessa arter är kortare än för E. albidus och utfodringen bör ske oftare.

Testbetingelser

Testbetingelserna är i allmänhet desamma som de som gäller för E. albidus, med följande undantag:

storleken på testkärlet kan (men behöver inte) vara mindre,

reproduktionstestets varaktighet kan (men behöver inte) vara kortare, dvs. fyra i stället för sex veckor, men det preliminära testets varaktighet bör inte förändras,

mot bakgrund av juvenilernas ringa storlek rekommenderas kontrastfärgning å det bestämdaste för fastställande av antalet,

det kriterium för testresultatets giltighet som utgörs av antalet juveniler per testkärl i kontrollen bör ändras till 50.

HÄNVISNINGAR

(1) Schmelz, R. M. och Collado, R. (1999). Enchytraeus luxuriosus sp.nov., a new terrestrial oligochaete species (Enchytraeidae, Clitellata, Annelida). Carolinea 57, 93–100.

Tillägg 6

Detaljerad beskrivning av extraktionstekniker

Kontrastfärgning med färgämnet Rose Bengal

Denna metod, som ursprungligen togs fram för limnologiska ändamål (1), föreslogs från början för bestämning av antalet juveniler i reproduktionstestet för småringmaskar av W. de Coen (Gents universitet, Belgien). Oberoende av detta utvecklades en modifierad version (Rose Bengal blandas med formaldehyd i stället för etanol) av RIVM Bilthoven (2) (3).

I slutet av det definitiva testet (dvs. efter sex veckor), överförs jorden i testkärlen till en grund behållare. Ett Bellaplast-kärl eller ett framkallningskärl med räfflad botten är användbart för detta ändamål, eftersom revbenen begränsar maskarnas rörelser inom undersökningsområdet. Juvenilerna fixeras med etanol (ca 5 ml per replikat). Kärlen fylls därefter med ett vattenskikt på 1–2 cm. Några droppar (200–300 μl) av färgämnet Rose Bengal (1 % lösning i etanol) tillsätts (0,5 % eosin är ett alternativ) och de två beståndsdelarna blandas noggrant. Efter 12 timmar kommer maskarna att ha färgats röda och bör vara lätta att räkna eftersom de ligger på substratets yta. Alternativt kan substrat/alkohol-blandningen tvättas genom en 0,250 mm sikt innan maskarna räknas. Genom detta förfarande kommer kaoliniten, torven och en del av sanden att sköljas bort och de rödaktiga maskarna blir lättare att se och räkna. Linser med belysning (linsstorlek minst 100 x 75 mm med en förstoringsfaktor på 2 till 3x) underlättar också räkningen.

Kontrastfärgningen minskar den tid det tar att räkna maskarna till några minuter per kärl och som vägledning bör det ta högst två dagar för en person att bedöma alla kärlen från ett test.

Våtextraktion

Våtextraktionen bör inledas omedelbart testets slut. Jorden från varje kärl placeras i plastsiktar med en maskstorlek på ca 1 mm. Siktarna placeras sedan över plastskålar utan att vidröra botten. Skålarna fylls noggrant med vatten tills proven i siktarna befinner sig helt under vattenytan. För att säkerställa en extraktionsgrad på mer än 90 % av de befintliga maskarna bör en extraktionsperiod på 3 dagar vid 20 ± 2 °C användas. I slutet av extraktionsperioden avlägsnas siktarna och vattnet (bortsett från en liten mängd) hälls långsamt av, utan att störa sedimentet i skålarnas botten. Plastskålarna skakas sedan lätt för att suspendera sedimentet i det överliggande vattnet. Vattnet hälls i en petriskål, och när jordpartiklarna har sjunkit till botten kan småringmaskarna identifieras, avlägsnas och räknas genom användning av ett stereomikroskop och en mjuk stålpincett.

Flotation

En metod som bygger på flotation har beskrivits i en not av R. Kuperman (4). Efter det att innehållet i kärlet har fixerats med etanol dränks jorden med Ludox (AM-30 kolloidal kiseldioxid, 30 viktprocent suspension i vatten) upp till 10 till 15 mm över jordytan. Efter grundlig blandning av jorden med flotationsmedlet i 2–3 minuter kan juveniler som flyter på ytan lätt räknas.

HÄNVISNINGAR

(1) Korinkova, J. och Sigmund, J. (1968). The colouring of bottom-fauna samples before sorting, Vestnik Ceskoslovensko Spolecnosti Zoologicke 32, 300–305.

(2) Dirven-Van Breemen, E., Baerselmann, R. och Notenboom, J. (1994). Onderzoek naar de Geschiktheid van de Potwormsoorten Enchytraeus albidus en Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Annelida) in Bodemecotoxicologisch Onderzoek. RIVM Rapport nr 719102025. 46 s.

(3) Posthuma, L., Baerselmann, R., Van Veen, R. P. M. och Dirven-Van Breemen, E. M. (1997). Single and joint toxic effects of copper and zinc on reproduction of Enchytraeus crypticus in relation to sorption of metals in soils. Ecotox. Envir. Safety 38, s. 108–121.

(4) Phillips, C. T., Checkai, R. T. och Kuperman, R. G. (1998). An alternative to the O'Connor Method for Extracting Enchytraeids from Soil. SETAC:s 19:e årsmöte, Charlotte, USA. Abstract Book No. PMP069, s. 157.

Tillägg 7

Översikt över de statistiska dataanalyserna (bestämning av NOEC)

Uteslut kontroll utan lösningsmedel

Är båda control- lerna lika? U-test

Är båda control- lerna lika? T-Test

Bonferronis U-test

Jonckheere-Terpstras test

Shirleys test

Dunns test

Kontrollerna kan läggas samman

Ytterligare lösningsmedelskontroll?

Statistisk testning rekommenderas ej

Minst fyra replikat per behandling?

Går ej

Omvandla data

Data:

Homogen variation?

Normalfördelning?

Nej

Dunnetts test

Williams test

Uteslut kontroll utan lösningsmedel

Kontrollerna kan läggas samman

Start

Icke-parametriska tester

Parametriska tester

Tillägg 1

Definitioner

Följande definitioner gäller för denna testmetod:

Tillägg 2

Fastställande av jordens maximala vattenhållningskapacitet

Följande metod för att bestämma jordens maximala vattenhållningskapacitet har visat sig vara lämplig. Den beskrivs i bilaga C till ISO DIS 11268-2 (1).

där

HÄNVISNINGAR:

(1) ISO (Internationella standardiseringsorganisationen) (1999). Markundersökningar – Föroreningars effekt på daggmaskar (Eisenia fetida). Del 2: Bestämning av effekter på reproduktion, nr 11268-2. ISO, Genève.

Tillägg 3

Bestämning av jordens pH-värde

Följande metod för bestämning av pH-värdet i jord bygger på beskrivningen i ISO DIS 10390: Markundersökningar – Bestämning av pH (1).

En bestämd mängd jord torkas i rumstemperatur i minst 12 timmar. En suspension av jorden (som innehåller minst 5 gram jord) bereds därefter i fem gånger dess volym med antingen 1 M kaliumkloridlösning (KCl) av analyskvalitet eller 0,01 M kalciumkloridlösning (CaCl2) av analyskvalitet. Suspensionen skakas därefter omsorgsfullt i fem minuter och får sedan stå och klarna i minst 2 timmar men högst 24 timmar. Vätskefasens pH mäts sedan med en pH-mätare som har kalibrerats före varje mätning med hjälp av ett antal lämpliga buffertlösningar (t.ex. pH 4,0 och 7,0).

HÄNVISNINGAR:

(1) ISO (Internationella standardiseringsorganisationen) (1994). Markundersökningar – Bestämning av pH, nr 10390. ISO, Genève.

Tillägg 4

Odling av Eisenia fetida och Eisenia andrei

Maskarna bör helst födas upp i en klimatkammare vid en temperatur på 20 ± 2 °C. Vid denna temperatur och med tillräckligt mycket foder blir maskarna könsmogna vid 2–3 månaders ålder.

Båda arterna kan odlas i ett stort antal olika typer av animaliskt avfall. Som odlingsmedium rekommenderas en 50/50-blandning av häst- eller boskapsgödsel och torv. Kontroller ska göras för att se till att de nötkreatur eller hästar från vilka gödseln kommer inte genomgår medicinering eller behandling med kemikalier, t.ex. tillväxtbefrämjande medel, nematicider eller liknande veterinärmedicinska produkter, som kan påverka maskarna under testet. Det rekommenderas att man själv samlar in gödseln, eftersom erfarenheten har visat att kommersiellt tillgänglig gödsel som används som trädgårdsgödsel kan påverka maskarna negativt. Mediet bör ha ett pH på cirka 6–7 (reglerat med kalciumkarbonat), låg jonisk konduktivitet (lägre än 6 mS/cm eller en salthalt på under 0,5 %), och bör inte ha för hög halt av ammoniak eller animaliskt urin. Substratet bör vara fuktigt men inte för vått. Odlingslådor med en storlek på 10–50 liter är lämpliga.

För att få maskar med standardålder och storlek (vikt), är det bäst att inleda odlingen med kokonger. När kulturen har etablerats underhålls den genom att man placerar adulta daggmaskar i en avelslåda med färskt substrat i mellan 14 och 28 dagar för att möjliggöra produktion av ytterligare kokonger. Adulterna avlägsnas sedan, och de juveniler som produceras ur kokongerna används som utgångsmaterial för nästa kultur. Maskarna utfodras kontinuerligt med animaliskt avfall och överförs då och då till ett färskt substrat. Erfarenheten har visat att lufttorkad finmald ko- eller hästgödsel eller havremjöl är ett lämpligt foder. Det bör säkerställas att de nötkreatur eller hästar från vilka gödseln kommer inte genomgår medicinering eller behandling med kemikalier, såsom tillväxtbefrämjande medel, som kan påverka maskarna under testet. De daggmaskar som kläcks ur kokongerna används för testning när de är mellan 2 och 12 månader gamla och betraktas som adulta.

Maskarna anses vara friska om de rör sig genom substratet, inte försöker lämna substratet och förökar sig kontinuerligt. Om maskarna rör sig mycket långsamt och har en gul bakre del tyder det på att substratet har utarmats. I detta fall rekommenderas tillhandahållande av färskt substrat och/eller minskad djurtäthet.

Tillägg 5

Metoder för räkning av juvenila maskar som kläcks ur kokongerna

Det är mycket tidskrävande att sortera maskarna från jordsubstratet för hand. Två alternativa metoder rekommenderas därför:

a Testbehållarna placeras i ett vattenbad med en temperatur initialt på 40 °C men som stiger till 60 °C. Efter cirka 20 minuter har de juvenila maskarna i regel tagit sig upp på substratets yta och kan då lätt avlägsnas och räknas.

b Testjorden kan tvättas genom en sikt med den metod som utvecklats av van Gestel m.fl. (1) under förutsättning att den torv och stallgödsel eller havremjöl som tillförs jorden har mals ner till ett fint pulver. Två 0,5 mm siktar (diameter 30 cm) placeras ovanpå varandra. Innehållet i en testbehållare tvättas genom siktarna med ett kraftigt flöde av kranvatten, vilket gör att ungmaskarna och kokongerna främst blir kvar på den övre sikten. Det är viktigt att notera att hela den övre siktens yta bör hållas våt under detta moment så att de juvenila maskarna flyter på ett tunt skikt med vatten, vilket därmed hindrar dem från att krypa ner genom siktens maskor. De bästa resultaten uppnås när ett duschmunstycke används.

När allt jordsubstrat har tvättats genom sikten, kan juvenilerna och kokongerna sköljas från den övre sikten ner i en skål. Innehållet i skålen får sedan stå så att tomma kokonger flyter upp till vattenytan och fulla kokonger och ungmaskar sjunker till botten. Vattnet kan sedan hällas bort och ungmaskarna och kokongerna flyttas till en petriskål som innehåller lite vatten. Maskarna kan avlägsnas för att räknas med en nål eller en pincett.

Erfarenheten har visat att metod (a) passar bättre till extraktion av ungmaskar som kan tvättas genom en 0,5 mm sikt.

Effektiviteten av den metod som används för att avlägsna maskarna (och vid behov kokongerna) från jordsubstratet bör alltid fastställas. Om juvenilerna samlas in med hjälp av sortering för hand rekommenderas att man genomför proceduren två gånger på alla prov.

HÄNVISNINGAR:

(1) Van Gestel, C. A. M., W. A. van Dis, E. M. van Breemen, P. M. Sparenburg (1988). Comparison of two methods determining the viability of cocoons produced in earthworm toxicity experiments. Pedobiologia 32, 367–371.

Tillägg 6

Översikt över de statistiska dataanalyserna (bestämning av NOEC)

Uteslut kontroll utan lösningsmedel

Är båda control- lerna lika? U-test

Är båda control- lerna lika? T-Test

Bonferronis U-test

Jonckheere-Terpstras test

Shirleys test

Dunns test

Kontrollerna kan läggas samman

Ytterligare lösningsmedelskontroll?

Statistisk testning rekommenderas ej

Minst fyra replikat per behandling?

Går ej

Omvandla data

Data:

Homogen variation?

Normalfördelning?

Nej

Dunnetts test

Williams test

Uteslut kontroll utan lösningsmedel

Kontrollerna kan läggas samman

Start

Icke-parametriska tester

Parametriska tester

Tillägg 1

Exempel på utrustning för mätning av biogasproduktion via gastrycket

Teckenförklaring:

Testkärl i en miljö med temperaturen 35 ± 2 °C

Tillägg 2

Omvandling av tryckmätningarna

Avläsningarna från tryckmätaren kan relateras till gasvolymerna genom en standardkurva och utifrån denna kan man beräkna den volym gas som produceras per g torrvikt slam per 48 timmar. Detta aktivitetsindex används som ett av kriterierna för att bedöma testresultatens giltighet. Kalibreringskurvan framställs genom att man injicerar kända volymer gas vid 35 ± 2 °C i injektionsflaskor som innehåller samma mängd vatten som reaktionsblandningen, VR.

Fördela alikvoter på VR ml vatten som bibehålls vid 35 ± 2 °C i fem injektionsflaskor. Tillslut flaskorna och placera dem i vattenbad vid 35 ± 2 °C i 1 timme så att jämvikt uppnås.

Slå på tryckmätaren, låt den stabiliseras och justera till noll.

För in kanylen genom förseglingen på en av flaskorna, öppna ventilen tills tryckmätaren visar noll och stäng ventilen.

Upprepa detta förfarande med de återstående flaskorna.

Injicera 1 ml luft vid 35 ± 2 °C i varje flaska. För in nålen (på mätaren) genom förseglingen på en av flaskorna och låt tryckavläsningen stabiliseras. Registrera trycket, öppna ventilen tills trycket mäter noll och stäng därefter ventilen.

Upprepa detta förfarande med de återstående flaskorna.

Upprepa hela förfarandet med 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 8 ml, 10 ml, 12 ml, 16 ml, 20 ml respektive 50 ml luft.

Rita en omvandlingskurva över trycket (Pa) mot den insprutade gasvolymen (ml). Mätresultaten från instrumentet är linjära i intervallet mellan 0 Pa till 70000 Pa, och 0 ml till 50 ml gasproduktion.

Tillägg 3

Identifierade faktorer som kan leda till felaktiga resultat

(a) Kvaliteten på flaskornas korkar

Olika typer av septum för injektionsflaskorna finns kommersiellt tillgängliga, men många av dem, t.ex. butylgummi, förlorar sin täthet när de genomborras av en nål under betingelserna i detta test. Ibland sjunker trycket mycket långsamt när kanylen har införts genom septumet. Användning av gastäta septum rekommenderas för att undvika läckor (punkt 12 b).

(b) Fukt i kanylen

Fukt ansamlas ibland i kanylen och dithörande slangar, och detta visar sig i form av ett litet undertryck vid mätning. Avlägsna kanylen för att korrigera detta, skaka slangarna, torka med mjukt papper och sätt i en ny kanyl (punkterna 12 c och 35).

(c) Kontaminering med syre

Anaeroba metoder är känsliga för fel som härrör från kontaminering med syre, vilket kan leda till lägre gasproduktion. I denna metod bör denna möjlighet minimeras genom användningen av uteslutande anaeroba tekniker, inbegripet användning av en handskbox.

(d) Grovt substrat i slammet

Den anaeroba gasproduktionen och slammets känslighet påverkas av substrat som överförs med inokulatet till testflaskorna. Rötslam från privata anaeroba rötkammare innehåller ofta igenkännbart material som hår och växtrester av cellulosa, som brukar göra det svårt att ta representativa prover. Genom siktning av slammet kan grova olösliga material avlägsnas, vilket gör det mer sannolikt att de prov som tas är representativa (punkt 16).

(e) Flyktiga testkemikalier

Flyktiga testkemikalier kommer att släppas ut i gasutrymmet i testflaskorna. Detta kan leda till förlust av en del av testmaterialet från systemet under avluftning efter tryckmätningarna, vilket ger felaktigt höga EC50-värden. Genom ett lämpligt val av andelen gasutrymme jämfört med vätskevolymen och genom att inte släppa ut trycket efter tryckmätningarna kan felet minskas (10).

(f) Gasproduktionens icke-linjäritet

Om den plott som visar den genomsnittliga sammanlagda gasproduktionen mot inkuberingstiden inte är ungefärligen linjär under en 48-timmarsperiod, kan testets noggrannhet sänkas. För att lösa detta problem kan det vara tillrådligt att använda rötslam från en annan källa och/eller öka koncentrationen i testsubstrat-näringslösningen, jästextraktet och glukosen (punkt 29).

Tillägg 4

Tillämplighet på miljöprover med låg koncentration av biomassa – anaerob gyttja, sediment etc.

INLEDNING

I allmänhet är den särskilda mikrobiella aktiviteten (volym gas som produceras per gram torrsubstans) i naturligt förekommande anaerob gyttja, sediment, jord etc. mycket lägre än i anaerobt slam som härrör från avloppsvatten. På grund av detta kan vissa experimentella förhållanden behöva ändras när den hämmande effekten av kemikalier på dessa mindre aktiva prover ska mätas. För dessa mindre aktiva prover kan någon av följande allmänna åtgärder vidtas:

a Utför ett modifierat preliminärt test (punkt 25) med det outspädda provet med gyttja, jord etc. vid 35 ± 2 °C eller vid temperaturen på insamlingsplatsen för provet för att erhålla en mer noggrann simulering (som i del 1 i ISO 13641).

b Genomför testet med utspätt (1:100) rötkammarslam för att simulera den låga aktivitet som förväntas från miljöprovet, men håll temperaturen vid 35 ± 2 °C (som i del 2 i ISO 13641).

Alternativ (a) kan utföras med hjälp av den metod som beskrivs här (motsvarande del 1 i ISO 13641), men det är viktigt att göra ett preliminärt test (punkt 25) för att fastställa de optimala förhållandena, såvida inte dessa redan är kända från tidigare tester. Gyttjan eller sedimentet bör blandas ordentligt, t.ex. i en blandare, och, om så krävs, spädas med en liten andel avluftat utspädningsvatten (punkt 14) så att den är tillräckligt rörlig för att kunna överföras med en pipett med bred spets eller en mätcylinder. Om man anser att näringsämnen eventuellt saknas, kan gyttjeprovet centrifugeras (under anaeroba förhållanden) och återsuspenderas i ett oorganiskt medium innehållande jästextrakt (A.11).

Alternativ (b). Detta efterliknar rimligen den låga aktiviteten i miljöproverna men saknar den höga koncentration av suspenderade fasta ämnen som finns i dessa prov. Den roll som dessa fasta ämnen spelar för hämningen är inte känd, men det är möjligt att reaktioner mellan testkemikalierna och beståndsdelarna i gyttjan, liksom adsorption av testkemikalien till de fasta ämnena, skulle kunna leda till en sänkning av testkemikaliens toxicitet.

Temperatur är en annan viktig faktor: För en strikt simulering bör testerna göras vid den temperatur som uppmäts på insamlingsplatsen, eftersom olika grupper av metanproducerande bakteriekonsortier är kända för att vara aktiva inom olika temperaturintervaller, nämligen termofiler (ung. 30–35 °C), mesofiler (20–25 °C) och psykrofiler (< 20 °C), vilket kan göra att olika hämningsmönster uppvisas.

Varaktighet. I det allmänna testet, del 1, med outspätt slam producerades tillräckligt med gas på två till fyra dagar, medan det i del 2 med slam utspätt 1:100 producerades otillräckliga mängder gas eller ingen gas alls under denna period i ringtestet. I sin beskrivning av det senare testet anger Madsen m.fl. (1996) att man ska sätta av minst sju dagar för detta.

Testning med låg koncentration av biomassa (alternativ b)

Följande ändringar bör göras för att komplettera eller ersätta vissa befintliga punkter och stycken i huvudtexten.

Lägg till i punkt 6: Princip för testmetoden

Denna teknik kan användas med anaerobt slam utspätt 1:100, delvis för att simulera den låga aktiviteten i gyttja och sediment. Inkuberingstemperaturen kan antingen vara 35 °C eller temperaturen på den plats där provet samlades in. Eftersom bakterieaktiviteten är mycket lägre än i outspätt slam bör inkuberingstiden förlängas till minst sju dagar.

Lägg till i punkt 12 a:

inkubatorn ska kunna fungera ner till en temperatur på 15 °C.

Lägg till en extra reagens efter punkt 13:

Fosforsyra (H3PO4), 85 % i vikt i vatten.

Lägg till följande i slutet av punkt 16:

Använd en slutkoncentration på 0,20 ± 0,05 g/l total torrsubstans i testet.

Punkt 17. Testsubstrat

Detta substrat ska inte användas, utan ersätts med jästextrakt (se punkterna 17, A.11, A.12 och A.13).

Det behövs ett oorganiskt medium, inklusive spårämnen, för utspädning av anaerobt slam, och för enkelhetens skull tillsätts det organiska substratet, jästextrakt, till detta medium.

Lägg till efter punkt 17:

(a) Oorganiskt testmedium, med jästextrakt.

Detta bereds från ett testmedium med tio gånger så hög koncentration (punkterna 17 b och A.12) med en spårelementlösning (punkterna 17 c och A.13). Använd nyanskaffad natriumsulfidnonahydrat (punkterna 17 b och A.12) eller tvätta och torka den före användning för att säkerställa att den har tillräcklig hämningskapacitet. Om testet utförs utan användning av en handskbox (punkt 12 j) bör koncentrationen av natriumsulfid i stamlösningen ökas till 2 g/l (från 1 g/l). Natriumsulfid kan också tillsättas från en lämplig stamlösning genom de förslutna testflaskornas septum, eftersom detta förfarande minskar risken för oxidering, för att erhålla en slutkoncentration på 0,2 g/l. Alternativt kan titan(III)citrat (punkt 17 b) användas. Tillsätt det genom de förslutna testflaskornas septum tills en koncentration på mellan 0,8 mmol/l och 1,0 mmol/l erhålls. Titan(III)citrat är ett mycket effektivt och lågtoxiskt reduktionsmedel som bereds på följande sätt: Lös 2,94 g trinatriumcitratdihydrat i 50 ml syrefritt utspädningsvatten (punkt 14) (vilket ger en 200 mmol/l lösning) och tillsätt 5 ml titan(III)kloridlösning (15 g/100 ml utspädningsvatten). Neutralisera till pH 7 ± 0,5 med natriumkarbonat och fördela i en lämplig injektionsflaska under en ström av kvävgas. Koncentrationen av titan(III)citrat i denna stamlösning är 164 mmol/l. Använd testmediet omedelbart eller förvara vid 4 °C i högst en dag.

(b) Tiofalt koncentrerat testmedium, berett med följande: vattenfritt kaliumdivätefosfat (KH2PO4) 2,7 g dinatriumvätefosfat (Na2HPO4) 4,4 g (eller 11,2 g dodekahydrat) ammoniumklorid (NH4CI) 5,3 g kalciumkloriddihydrat (CaCl2 · 2H2O) 0,75 g magnesiumkloridhexahydrat (MgCl2 · 6H2O) 1,0 g järn(II)kloridtetrahydrat (FeCl2 · 4H2O) 0,2 g resazurin (redoxindikator) 0,01 g natriumsulfidnonahydrat (Na2S · 9H2O) 1,0 g (eller titan(III)citrat) slutlig koncentration 0,8–1,0 mmol/l spårelementlösning (se punkterna 17 c och A.13) 10,0 ml jästextrakt 100 g Lös i utspädningsvatten (punkt 14) och späd till 1000 ml

(c) Spårelementlösning som beretts med följande: mangan(II)kloridtetrahydrat (MnCl2 · 4H2O) 0,5 g ortoborsyra (H3BO3) 0,05 g zinkklorid (ZnCl2) 0,05 g koppar(II)klorid (CuCl2) 0,03 g natriummolybdatdihydrat (Na2MoO4 · 2H2O) 0,01 g kobolt(II)kloridhexahydrat (CoCl2 · 6H2O) 1,0 g nickel(II)kloridhexahydrat (NiCl2 · 6H2O) 0,1 g dinatriumselenit (Na2SeO3) 0,05 g Lös i utspädningsvatten (punkt 14) och späd till 1000 ml

Punkt 25: Preliminärt test

Det är viktigt att ett preliminärt test utförs så som beskrivs i punkt 24, förutom att koncentrationen fasta ämnen i slammet bör vara en hundradel av det som anges, dvs. 0,1 g/l, 0,2 g/l och 0,4 g/l. Inkuberingstiden bör vara minst sju dagar.

Anmärkning: I ringtestet (5) var gasutrymmet alldeles för stort med 75 % av den totala volymen. Det bör i stället ligga inom det rekommenderade intervallet på 10–40 %. Det relevanta kriteriet är att den volym gas som produceras vid omkring 80 % hämning bör vara mätbar med godtagbar precision (t.ex. ± 5 % till ± 10 %).

Punkterna 26 till 30: Tillsättning av testämne, inokulat och substrat.

Dessa tillsatser görs på samma sätt som beskrivs i dessa punkter, men substratlösningen (punkt 17) ersätts av testmediet plus jästextraktsubstrat (A.11).

Den slutliga koncentrationen av slammets torrsubstans minskas dessutom från 2–4 g/l till 0,2 ± 0,05 g/l (A.9). Två exempel på tillsättning av beståndsdelar i testblandningen ges i tabell A.1, som ersätter tabellen i punkt 29.

Punkt 33: Inkubering av flaskorna

På grund av den förväntat lägre gasproduktionshastigheten pågår inkuberingen i minst sju dagar.

Punkt 34: Tryckmätningar

Samma förfarande för att mäta trycket i gasutrymmet i flaskorna ska användas som i beskrivningen i punkt 34 om mängderna i gasfasen måste mätas. Om de totala mängderna för CO2 plus CH4 ska mätas sänks pH-värdet i vätskefasen till ca pH 2 genom injektion av H3PO4 i varje relevant flaska och mätning av trycket efter 30 minuters omskakning vid testtemperaturen. Emellertid kan mer information om kvaliteten på inokulatet erhållas genom mätning av trycket i varje flaska före och efter surgörning. När till exempel produktionshastigheten för CO2 är mycket högre än den för metan kan känsligheten hos jäsningsbakterierna ändras, och/eller främst metanbildande bakterier påverkas av testkemikalien.

Punkt 36: Mätning av pH-värdet

Om H3PO4 ska användas måste en del extra flaskor, i vilka H3PO4 inte tillsätts, inrättas särskilt för pH-mätning.

HÄNVISNING:

Madsen, T., Rasmussen, H. B och Nilsson, L. (1996), Methods for screening anaerobic biodegradability and toxicity of organic chemicals. Projekt nr 336, Vandkvalitetsinstituttet, danska miljöstyrelsen, Köpenhamn.

Reaktionsblandning, beståndsdelar | Exempel 1 | Exempel 2 | Normal tillsatsordning

Det beredda inokulatets koncentration (g/l) | 0,42 | 2,1 | —

Det tillsatta inokulatets volym (ml) | 45 | 9 | 4

Inokulatets koncentration i testflaskorna (g/l) | 0,20 | 0,20 | —

Det tillsatta testmediets volym (ml) | 9 | 9 | 2

Det tillsatta utspädningsvattnets volym (ml) | 36 | 72 | 3

Jästextraktets koncentration i testflaskorna (g/l) | 9,7 | 9,7 | —

Volym för stamlösningen med testkemikalie (ml) | 3 | 3 | 1

Total vätskevolym (ml) | 93 | 93 | —

Tillägg 5

Definitioner

I denna testmetod gäller följande definitioner:

Tillägg 1

Definitioner

I denna testmetod gäller följande definitioner:

Tillägg 2

Det rekommenderade rekonstituerade vattnets sammansättning (hämtat från kapitel C.1 i denna bilaga (1))

(a) Kalciumkloridlösning Lös upp 11,76 g CaCl2 · 2 H2O i avjonat vatten och späd till 1 liter med avjonat vatten.

(b) Magnesiumsulfatlösning Lös upp 4,93 g MgSO4 · 7 H2O i avjonat vatten och späd till 1 liter med avjonat vatten.

(d) Kaliumkloridlösning Lös upp 0,23 g KCl i avjonat vatten och späd till 1 liter med avjonat vatten.

Alla kemikalier ska vara av analyskvalitet.

Konduktiviteten i det destillerade eller avjonade vattnet bör inte överstiga 10 μScm– 1.

25 ml av var och en av lösningarna (a) till (d) blandas och den totala volymen späds till 1 liter med avjonat vatten. Summan av kalcium- och magnesiumjonerna i dessa lösningar är 2,5 mmol/l.

Förhållandet mellan Ca- och Mg-joner är 4:1 och mellan Na- och K-joner 10:1. Syrakapaciteten KS4.3 i denna lösning är 0,8 mmol/l.

Lufta utspädningsvattnet tills syremättnad uppnås, och lagra det sedan i ungefär två dagar utan ytterligare luftning före användning.

HÄNVISNING

(1) Kapitel C.1 i denna bilaga: Test avseende akut toxicitet för fisk.

Tillägg 3

De fysikalisk-kemiska egenskaperna hos godtagbart utspädningsvatten

Komponent | Koncentrationer

Partiklar | < 20 mg/l

Halt av organiskt kol | < 2 μg/l

Ojoniserad ammoniak | < 1 μg/l

Resterande mängd klor | < 10 μg/l

Total mängd bekämpningsmedel som innehåller organiska fosforföreningar | < 50 ng/l

Total mängd bekämpningsmedel som innehåller organiska klorföreningar plus polyklorerade bifenyler | < 50 ng/l

Total mängd organiskt klor | < 25 ng/l

HÄNVISNING

(1) OECD (1992). Guidelines for Testing of Chemicals No. 210. Fish, Early-life Stage Toxicity Test. OECD, Paris.

Tillägg 4

Rekommenderat syntetiskt sediment – vägledning om beredning och lagring

Sedimentets beståndsdelar

Beståndsdel | Egenskaper | % av sedimentets torrvikt

Torv | Vitmosstorv (Sphagnum), nedbrytningsgrad: medium, lufttorkad, inga synliga plantrester, finmald (partikelstorlek ≤ 0,5 mm) | 5 ± 0,5

Kvartssand | Kornstorlek: ≤ 2 mm, men > 50 % av partiklarna bör vara av storleken 50–200 μm | 75–76

Kaolinlera | Kaolinithalt ≥ 30 % | 20 ± 1

Foderkälla | t.ex. nässelpulver (Folia urticae) från blad av Urtica ciodica (brännässla), finmalet (partikelstorlek ≤ 0,5 mm), av apotekskvalitet för livsmedelsbruk, som tillsats till torrt sediment | 0,4–0,5

Organiskt kol | Justeras genom tillsats av torv och sand | 2 ± 0,5

Kalciumkarbonat | CaCO3, pulvriserat, kemiskt rent, som tillsats till torrt sediment | 0,05–1

Avjonat vatten | Konduktivitet ≤ 10 μS/cm, som tillsats till torrt sediment | 30–50

Anmärkning: Om man förväntar sig förhöjda ammoniakkoncentrationer, t.ex. om testkemikalien är känd för att hämma nitrifikationen, kan det vara lämpligt att ersätta 50 % av det kväverika nässelpulvret med cellulosa (t.ex. alfacellulosapulver, kemiskt rent, partikelstorlek ≤ 0,5 mm, (1) (2)).

Beredning

Torven lufttorkas och mals ner till ett fint pulver. En suspension med den erforderliga mängden torvpulver i avjonat vatten bereds med hjälp av en högpresterande homogeniseringsapparat. Suspensionens pH justeras till 5,5 ± 0,5 med CaCO3. Suspensionen konditioneras i minst två dagar under skonsam omrörning vid 20 ± 2 °C för att stabilisera pH-värdet och etablera en stabil mikrobiell komponent, varefter pH uppmäts på nytt och bör då vara 6,0 ± 0,5. Torvsuspensionen blandas sedan med de övriga beståndsdelarna (sand och kaolinlera) och avjonat vatten till ett homogent sediment med en vattenhalt som ger kring 30–50 % av sedimentets torrvikt. Den slutliga blandningens pH mäts på nytt och justeras vid behov till 6,5–7,5 med CaCO3. Om man förväntar sig utveckling av ammoniak kan det vara lämpligt att hålla pH-värdet i sedimentet under 7,0 (t.ex. mellan 6,0 och 6,5). Prover tas av sedimentet för att bestämma torrvikten och halten av organiskt kol. Om man förväntar sig utveckling av ammoniak kan det syntetiska sedimentet konditioneras i sju dagar under samma betingelser som råder i det efterföljande testet (t.ex. ett förhållande mellan sediment och vatten på 1:4, med samma höjd på sedimentskiktet som i testkärlen) innan det spikas med testkemikalien, dvs. man bör fylla på med vatten, som bör vara luftat. I slutet av konditioneringsperioden avlägsnas det överliggande vattnet och kasseras. Därefter blandas den spikade kvartssanden med sedimentet för varje behandlingsnivå, och sedimentet fördelas sedan i replikattestkärlen, som fylls på med testvatten. Kärlen inkuberas därefter under samma betingelser som råder i det efterföljande testet. Det är nu stabiliseringsperioden inleds. Det överliggande vattnet bör luftas.

Den valda foderkällan bör tillsättas före eller under spikningen av sedimentet med testkemikalien. Inledningsvis kan den blandas med torvsuspensionen (se ovan). Man kan dock undvika onödig försämring av foderkällan före tillsatsen av testorganismerna – t.ex. vid långa stabiliseringsperioder – genom att man påbörjar exponeringen så snart som möjligt efter fodertillsatsen. För att se till att fodret spikas med testkemikalien bör foderkällan blandas med sedimentet senast samma dag som sedimentet spikas med testkemikalien.

Förvaring

Det syntetiska sedimentets torra beståndsdelar kan lagras i ett torrt och svalt utrymme eller vid rumstemperatur. Det beredda sedimentet som spikats med testkemikalien ska omedelbart användas i testet. Prover av spikat sediment kan förvaras under de förhållanden som rekommenderas för testkemikalien i fråga fram till analysen.

HÄNVISNINGAR

(1) Egeler, Ph., Meller, M., Schallnaß, H. J. och Gilberg, D. (2005). Validation of a sediment toxicity test with the endobenthic aquatic oligochaete Lumbriculus variegatus by an international ring test. I samarbete med R. Nagel och B. Karaoglan. Rapport till den federala tyska miljöskyddsmyndigheten (Umweltbundesamt, Berlin), R&D nr: 202 67 429.

(2) Liebig, M., Meller, M. och Egeler, P. (2004). Sedimenttoxizitätstests mit aquatischen Oligochaeten – Einfluss verschiedener Futterquellen im künstlichen Sediment auf Reproduktion und Biomasse von Lumbriculus variegatus. Proceedings 5/2004: Statusseminar Sedimentkontakttests. 24–25 mars 2004. BfG (Bundesanstalt für Gewässerkunde), Koblenz, Tyskland, s. 107–119.

Tillägg 5

Odlingsmetoder för Lumbriculus variegatus

Lumbriculus variegatus (Müller) (Lumbriculidae, Oligochaeta) lever i sötvattenssediment och används ofta i ekotoxikologisk testning. Den kan lätt odlas under laboratorieförhållanden. En sammanfattning av odlingsmetoderna ges nedan.

Odlingsmetoder

Odlingsbetingelser för Lumbriculus variegatus beskrivs i detalj i Phipps m.fl. (1993) (1), Brunson m.fl. (1998) (2), ASTM (2000) (3), den amerikanska miljöskyddsmyndigheten (EPA) (2000) (4). En kort sammanfattning av dessa betingelser ges nedan. En stor fördel med L. variegatus är dess snabba reproduktionstakt, vilket leder till en snabbt ökande biomassa i laboratorieodlade populationer (t.ex. (1), (3), (4), (5)).

Maskarna kan odlas i stora akvarier (57–80 liter) vid 23 °C med en fotoperiod på 16 L:8 M (100–1000 lux). Man använder då naturligt vatten som förnyas dagligen (45–50 liter per akvarium). Substratet bereds genom att oblekta bruna pappersservetter klipps till remsor som sedan blandas med odlingsvatten i några sekunder, vilket leder till att man får små bitar av papperssubstrat. Detta substrat kan sedan omedelbart användas i odlingsakvarierna för Lumbriculus genom att botten av behållaren täcks, eller lagras frysta i avjonat vatten för senare användning. Det nya substratet i akvariet räcker i allmänhet i cirka två månader.

Varje maskodling inleds med 500–1000 maskar som utfodras tre gånger per vecka under förnyelse- eller genomflödesförhållanden med en 10 ml lösning innehållande 6 g yngelfoder för foreller. Statiska eller semistatiska odlingar bör utfodras mindre ofta för att förebygga tillväxt av bakterier och svampar.

Under dessa förhållanden kommer antalet individer i odlingen i allmänhet att fördubblas på cirka 10–14 dagar.

Alternativt kan Lumbriculus variegatus också odlas i ett system med ett skikt av kvartssand som används som syntetiskt sediment (1–2 cm djupt) och rekonstituerat vatten. Behållare av glas eller rostfritt stål med en höjd på 12–20 cm kan användas som odlingskärl. Vattnet ska luftas försiktigt (t.ex. två bubblor per sekund) med en pasteurpipett placerad ca 2 cm ovanför sedimentets yta. För att undvika ackumulering t.ex. av ammoniak bör det överliggande vattnet bytas med hjälp av ett genomflödessystem, eller manuellt minst en gång i veckan. Oligochaeterna kan hållas vid rumstemperatur med en fotoperiod på 16 h ljus (ljusintensitet 100–1000 lux) och 8 h mörker. I den semistatiska odlingen (förnyelse av vattnet en gång per vecka) utfodras maskarna med TetraMin två gånger per vecka (t.ex. 0,6–0,8 mg per cm2 sedimentyta), vilket kan appliceras som en suspension med 50 mg TetraMin per ml avjonat vatten.

Lumbriculus variegatus kan avlägsnas från odlingarna t.ex. genom överföring av substrat med hjälp av ett finmaskat nät, eller med hjälp av en flampolerad glaspipett med bred spets (ca 5 mm i diameter), till en separat bägare. Om man också överför substrat till denna bägare låter man bägaren som innehåller maskar och substrat stå över natten under genomflödesförhållanden, vilket gör att substratet avlägsnas från bägaren medan maskarna blir kvar på kärlets botten. Maskarna kan sedan överföras till nyligen beredda odlingsakvarier eller bearbetas ytterligare för testet enligt beskrivning i (3) och (4), eller nedan.

Något som bör beaktas kritiskt vid användning av L. variegatus i sediment är dess reproduktionssätt (fragmentering (architomy) eller regenerering (morphallaxis), t.ex. (6)). Resultatet av denna asexuella förökning är två delar som inte intar någon föda förrän den främre eller bakre delen regenererats (t.ex. (7), (8)). Detta innebär att L. variegatus inte exponeras kontinuerligt via intag av förorenat sediment.

Därför bör en synkronisering utföras för att minimera okontrollerad reproduktion och regenerering, som båda leder till stora variationer i testresultaten. Denna variation kan inträffa om vissa individer, som har genomgått delning och därmed inte intar någon föda under en viss tid, i mindre grad exponeras för testkemikalien än andra individer som inte genomgår delning under testet (9), (10), (11). Maskarna bör delas på konstgjord väg 10 till 14 dagar före början av exponeringen (synkronisering). Stora (adulta) maskar, som helst inte visar några tecken på nyligen genomgången regenerering (morphallaxis) bör väljas ut för synkronisering. Dessa maskar kan placeras på ett objektglas med en droppe odlingsvatten och skäras av på den mittersta kroppsregionen med en skalpell. Man bör se till att de bakre ändarna är av liknande storlek. Man bör sedan låta de bakre ändarna återbilda nya huvuden i ett kulturkärl som innehåller samma substrat som används i kulturen och rekonstituerat vatten tills exponeringen inleds. Tecknet på att regenereringen av nya främre delar pågår är att de synkroniserade maskarna gräver sig igenom i substratet (närvaron av återbildade huvuddelar kan bekräftas genom att ett representativt delprov granskas i ett binokulärt mikroskop). Testorganismerna kan därefter förväntas befinna sig i ett liknande fysiologiskt tillstånd. Detta innebär att när de synkroniserade maskarna reproducerar sig genom regenerering (morphallaxis) under testets gång exponeras praktiskt taget alla djur i lika hög grad för det spikade sedimentet. De synkroniserade maskarna bör utfodras så snart de börjar gräva sig genom substratet, eller sju dagar efter delningen. Utfodringen bör vara jämförbar med den i de vanliga odlingarna, men det är tillrådligt att ge de synkroniserade maskarna samma foder som ska användas i testet. Maskarna bör hållas i samma temperatur som i testet, dvs. 20 ± 2 °C. Efter regenerering under 10–14 dagar bör intakta hela maskar som aktivt simmar eller kryper efter lätt mekanisk retning användas för testet. Skador eller autotomi bör undvikas, t.ex. genom att man använder pipetter med flampolerade kanter eller tandläkarsonder av rostfritt stål vid hanteringen av maskarna.

Källor för startkulturer för Lumbriculus variegatus (adresserna i USA har tagits från (4))

ECT Oekotoxikologie GmbH Böttgerstr. 2–14 D- 65439 Flörsheim/Main TYSKLAND | Bayer Crop Science AG Development – Ecotoxicology Alfred-Nobel-Str. 50 D-40789 Monheim TYSKLAND

University of Joensuu Laboratory of Aquatic Toxicology Dept. of Biology Yliopistokatu 7, P.O. Box 111 FI-80101 Joensuu FINLAND | Technische Universität Dresden Institut für Hydrobiologie Fakultät für Forst-, Geo- und Hydrowissenschaften Mommsenstr. 13 D-01062 Dresden TYSKLAND

C.N.R.- I.R.S.A. Italian National Research Council Water Research Institute Via Mornera 25 I- 20047 Brugherio MI

U.S. Environmental Protection Agency Mid-Continent Ecological Division 6201 Congdon Boulevard Duluth, MN 55804 | Michigan State University Department of Fisheries and Wildlife No. 13 Natural Resources Building East Lansing, MI 48824-1222

U.S. Environmental Protection Agency Environmental Monitoring System Laboratory 26 W. Martin Luther Dr. Cincinnati, OH 45244 | Wright State University Institute for Environmental Quality Dayton, OH 45435

Columbia Environmental Research Center U.S. Geological Survey 4200 New Haven Road Columbia, MO 65201 | Great Lakes Environmental Research Laboratorium, NOAA 2205 Commonwealth Boulevard Ann Arbor, MI 48105-1593

HÄNVISNINGAR

(1) Phipps, G. L., Ankley, G. T., Benoit, D. A. och Mattson, V. R. (1994). Use of the aquatic Oligochaete Lumbriculus variegatus for assessing the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants. Environ.Toxicol. Chem. 12, 269–279.

(2) Brunson, E. L., Canfield, T. J., Ingersoll, C. J. och Kemble, N. E. (1998). Assessing the bioaccumulation of contaminants from sediments of the Upper Mississippi river using field-collected oligochaetes and laboratory-exposed Lumbriculus variegatus. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 35, 191–201.

(3) ASTM International (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates, E 1688-00a. I ASTM International 2004 Annual Book of Standards. Vol. 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA.

(4) U.S. EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Andra upplagan. EPA 600/R-99/064, amerikanska miljöskyddsmyndigheten (EPA), Duluth, MN, mars 2000.

(5) Kukkonen, J. och Landrum, P. F. (1994). Toxicokinetics and toxicity of sediment-associated Pyrene to Lumbriculus variegatus (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 13, 1457–1468.

(6) Drewes, C. D. och Fourtner, C. R. (1990). Morphallaxis in an aquatic oligochaete, Lumbriculus variegatus: Reorganisation of escape reflexes in regenerating body fragments. Develop. Biol. 138: 94–103.

(7) Leppänen, M. T. och Kukkonen, J. V. K. (1998a). Relationship between reproduction, sediment type and feeding activity of Lumbriculus variegatus (Müller): Implications for sediment toxicity testing. Environ. Toxicol. Chem. 17, 2196–2202.

(8) Leppänen, M. T. och Kukkonen, J. V. K. (1998b). Factors affecting feeding rate, reproduction and growth of an oligochaete Lumbriculus variegatus (Müller). Hydrobiologia 377, 183–194.

(9) Brust, K., O. Licht, V. Hultsch, D. Jungmann och R. Nagel (2001). Effects of Terbutryn on Aufwuchs and Lumbriculus variegatus in Artificial Indoor Streams. Environ. Toxicol. Chemistry, vol. 20, s. 2000–2007.

(10) Oetken, M., K.-U. Ludwichowski och R. Nagel (2000). Sediment tests with Lumbriculus variegatus and Chironomus riparius and 3,4-dichloroaniline (3,4-DCA) within the scope of EG-AltstoffV. På uppdrag av den federala tyska miljöskyddsmyndigheten (Umweltbundesamt, Berlin), FKZ 360 12 001, mars 2000.

(11) Leppänen, M. T. och Kukkonen, J. V. K. (1998). Relative importance of ingested sediment and porewater as bioaccumulation routes for pyrene to oligochaete (Lumbriculus variegatus, Müller). Environ. Sci. Toxicol. 32, 1503–1508.

Tillägg 6

Sammanfattning av ringtestresultaten Sedimenttoxicitetstest med Lumbriculus variegatus

antal maskar i kontrollerna (genomsnitt) | SD | CV (%) | n | antal maskar i kontrollerna med lösn. medel (genomsnitt) | SD | CV (%) | n

32,3 | 7,37 | 22,80 | 3 | 39,0 | 3,61 | 9,25 | 3

40,8 | 6,55 | 16,05 | 6 | 36,0 | 5,29 | 14,70 | 3

41,5 | 3,54 | 8,52 | 2 | 38,5 | 7,05 | 18,31 | 4

16,3 | 5,99 | 36,67 | 6 | 30,8 | 6,70 | 21,80 | 4

24,3 | 10,69 | 43,94 | 3 | 26,3 | 3,06 | 11,60 | 3

28,5 | 8,29 | 29,08 | 4 | 30,7 | 1,15 | 3,77 | 3

28,3 | 3,72 | 13,14 | 6 | 28,8 | 2,56 | 8,89 | 6

25,3 | 5,51 | 21,74 | 3 | 27,7 | 1,53 | 5,52 | 3

23,8 | 2,99 | 12,57 | 4 | 21,3 | 1,71 | 8,04 | 4

36,8 | 8,80 | 23,88 | 6 | 35,0 | 4,20 | 11,99 | 6

33,0 | 3,58 | 10,84 | 6 | 33,5 | 1,73 | 5,17 | 4

20,7 | 2,73 | 13,22 | 6 | 15,0 | 6,68 | 44,56 | 4

42,0 | 7,07 | 16,84 | 6 | 43,7 | 0,58 | 1,32 | 3

18,2 | 3,60 | 19,82 | 6 | 21,7 | 4,04 | 18,65 | 3

32,0 | 3,95 | 12,34 | 6 | 31,3 | 4,79 | 15,32 | 4

interlaborativt medelvärde | 29,59 | 20,10 | 30,61 | 13,26

SD | 8,32 | 10,03 | 7,57 | 10,48

n | 15 | 15

min | 16,3 | 15,0

max | 42,0 | 43,7

CV (%) | 28,1 | 24,7

maskarnas torrvikt totalt per replikat (kontroller) | SD | CV (%) | n | maskarnas torrvikt totalt per replikat (kontroller med lösningsmedel) | SD | CV (%) | n

24,72 | 6,31 | 25,51 | 3 | 27,35 | 4,08 | 14,93 | 3

30,17 | 2,04 | 6,75 | 6 | 33,83 | 10,40 | 30,73 | 3

23,65 | 3,61 | 15,25 | 2 | 28,78 | 4,68 | 16,28 | 4

12,92 | 6,83 | 52,91 | 6 | 24,90 | 6,84 | 27,47 | 4

21,31 | 4,17 | 19,57 | 3 | 25,87 | 5,30 | 20,49 | 3

22,99 | 4,86 | 21,16 | 4 | 24,64 | 5,09 | 20,67 | 3

18,91 | 1,91 | 10,09 | 6 | 19,89 | 1,77 | 8,89 | 6

24,13 | 1,63 | 6,75 | 3 | 25,83 | 2,17 | 8,41 | 3

22,15 | 3,18 | 14,34 | 4 | 22,80 | 2,60 | 11,40 | 4

35,20 | 8,12 | 23,07 | 6 | 31,42 | 8,45 | 26,90 | 6

41,28 | 5,79 | 14,02 | 6 | 41,42 | 4,37 | 10,55 | 4

15,17 | 5,78 | 38,09 | 6 | 10,50 | 3,42 | 32,53 | 4

35,69 | 8,55 | 23,94 | 6 | 38,22 | 1,23 | 3,21 | 3

19,57 | 5,21 | 26,65 | 6 | 28,58 | 6,23 | 21,81 | 3

29,40 | 2,16 | 7,34 | 6 | 31,15 | 2,70 | 8,67 | 4

interlaborativt medelvärde | 25,15 | 20,36 | 27,68 | 17,53

SD | 7,87 | 12,56 | 7,41 | 9,10

n | 15 | 15

min | 12,9 | 10,5

max | 41,3 | 41,4

CV (%) | 31,3 | 26,8

biologisk parameter | inter-laborativt medelvärde (mg/kg) | min | max | inter-laborativ faktor | SD | CV (%) | geo-metriskt medel-värde (mg/kg)

totalt antal maskar | EC50 | 23,0 | 4,0 | 37,9 | 9,4 | 10,7 | 46,3 | 19,9

NOEC | 9,9 | 2,1 | 22,7 | 10,7 | 7,2 | 72,3 | 7,6

LOEC | 27,9 | 4,7 | 66,7 | 14,2 | 19,4 | 69,4 | 20,9

MDD (%) | 22,5 | 7,1 | 39,1

maskarnas torrvikt totalt | EC50 | 20,4 | 7,3 | 39,9 | 5,5 | 9,1 | 44,5 | 18,2

NOEC | 9,3 | 2,1 | 20,0 | 9,4 | 6,6 | 70,4 | 7,4

LOEC | 25,7 | 2,1 | 50,0 | 23,5 | 16,8 | 65,5 | 19,4

MDD (%) | 24,8 | 10,9 | 44,7

dödlighet/överlevnad | LC50 | 25,3 | 6,5 | 37,2 | 5,7 | 9,4 | 37,4 | 23,1

NOEC | 16,5 | 2,1 | 40,0 | 18,8 | 10,3 | 62,4 | 12,8

LOEC | 39,1 | 4,7 | 66,7 | 14,2 | 18,1 | 46,2 | 32,6

reproduktion (ökning av antalet maskar per replikat) | EC50 | 20,0 | 6,7 | 28,9 | 4,3 | 7,6 | 37,9 | 18,3

NOEC | 7,9 | 2,1 | 20,0 | 9,4 | 5,2 | 66,0 | 6,4

LOEC | 22,5 | 2,1 | 50,0 | 23,5 | 15,4 | 68,6 | 16,0

MDD (%) | 29,7 | 13,9 | 47,9

tillväxt (ökning av biomassan per replikat) | EC50 | 15,3 | 5,7 | 29,9 | 5,2 | 7,1 | 46,5 | 13,7

NOEC | 8,7 | 2,1 | 20,0 | 9,4 | 6,0 | 68,1 | 6,9

LOEC | 24,0 | 2,1 | 50,0 | 23,5 | 15,7 | 65,5 | 17,3

MDD (%) | 32,2 | 13,6 | 65,2

HÄNVISNING

Egeler, Ph., Meller, M., Schallnaß, H. J. och Gilberg, D. (2005). Validation of a sediment toxicity test with the endobenthic aquatic oligochaete Lumbriculus variegatus by an international ring test. I samarbete med R. Nagel och B. Karaoglan. Rapport till den federala tyska miljöskyddsmyndigheten (Umweltbundesamt, Berlin), R&D nr: 202 67 429.

Tillägg 1

Definitioner

Följande definitioner gäller för denna testmetod (i detta test uttrycks alla effektkoncentrationer som testkemikaliens vikt per torrvikt testjord):

Tillägg 2

Fastställande av jordens maximala vattenhållningskapacitet

Följande metod för att bestämma jordens maximala vattenhållningskapacitet anses vara lämplig. Den beskrivs i bilaga C till ISO DIS 11268-2 (Markundersökningar – Föroreningars effekt på daggmaskar (Eisenia fetida) – Del 2: Bestämning av effekter på reproduktion (23)).

Samla in en fastställd kvantitet (t.ex. 5 g) testjordsubstrat med hjälp av en lämplig anordning (jordborr med rör osv.). Täck botten med en bit filterpapper genomdränkt med vatten och placera det därefter på en ställning i ett vattenbad. Röret bör gradvis nedsänkas i vattnet tills vattenytan är ovanför jordytan. Det bör därefter lämnas i vattnet i cirka 3 timmar. Eftersom allt vatten som absorberas av jordens kapillärer inte kan hållas kvar bör jordprovet dräneras i 2 timmar genom att röret placeras på en bädd av mycket fuktig finmald kvartssand i ett slutet kärl (för att förhindra uttorkning). Provet bör sedan torkas till en konstant vikt vid 105 °C och vägas. Vattenhållningskapaciteten (WHC) beräknas enligt följande:

där

Tillägg 3

Bestämning av jordens ph-värde

Följande metod för bestämning av pH-värdet i jord bygger på beskrivningen i ISO DIS 10390: Markundersökningar – Bestämning av pH (16).

Tillägg 4

Uppfödning av Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer, foderkvalster och synkronisering av odlingen

Uppfödning av Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer:

Kulturer kan hållas i plastkärl eller glasburkar fyllda med en blandning av gips och kolpulver i förhållandet 9:1. Gipset kan hållas fuktigt genom att man vid behov tillsätter några droppar destillerat eller avjonat vatten. Uppfödningstemperaturen är optimal mellan 20 ± 2 °C. Ljus-/mörkerförhållandena är inte relevanta för denna art. Bytesdjuren kan vara kvalster av arterna Tyrophagus putrescentiae eller Caloglyphus sp. (foderkvalster bör hanteras med försiktighet eftersom de kan orsaka allergier hos människor), men rundmaskar, småringmaskar och hoppstjärtar är också lämpliga bytesdjur. Deras ursprung bör anges. Utvecklingen av en population kan börja med en enda hona eftersom hanar utvecklas ur obefruktade ägg. Generationerna är till stor del överlappande. En hona kan leva i över 100 dagar och lägga ungefär 100 ägg under sin livstid. Den maximala äggläggningstakten uppnås mellan 10 och 40 dagar efter att honorna nått adult stadium och uppgår till 2,2 ägg per hona och dygn. Utvecklingstiden från ägg till adult hona är ungefär 20 dagar vid 20 °C. Mer än en kultur bör hållas innan testet påbörjas.

Uppfödning av Tyrophagus putrescentiae:

Kvalstren hålls i ett glaskärl fyllt med finmalt bryggerijästpulver. Kärlet bör placeras i en plastspann fylld med KNO3-lösning för att undvika att kvalstren tar sig ut. Foderkvalstren placeras på pulvrets yta. De blandas sedan noggrant med pulvret (som måste ersättas två gånger i veckan) med hjälp av en spatel.

Synkronisering av kulturen:

Exemplar som används i testet bör ha ungefär samma ålder (ca 7 dagar efter att det adulta stadiet inletts). Vid en uppfödningstemperatur på 20 °C uppnås detta på följande sätt:

Överför honorna till ett rent uppfödningskärl och tillsätt tillräckligt med foder.

Låt honorna lägga ägg i 2–3 dagar och avlägsna dem sedan.

Använd adulta honor för testning mellan den 28:e och 35:e dagen efter att moderdjuren placerats i rena uppfödningskärl.

Adulta honor lätt kan skiljas från hanar och andra utvecklingsstadier genom deras större storlek, svällande form och bruna ryggsköld (hanarna är tunnare och platta). Juvenilerna är vita till gräddfärgade. Utvecklingen av kvalstren vid 20 °C följer ungefär det mönster som beskrivs nedan (figur): ägg (5 dagar), larv (2 dagar), protonymf (5 dagar), deutonymf (7 dagar), honornas förstadium till äggläggning (2 dagar). Därefter är kvalstren adulta.

Figur Utveckling av Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer vid 20 °C (avlägsnande = honor som används i testet)

20 days

35d

Removal

28d

Adult

Deutonymph

Protonymph

Larva

Egg

egglaying

De adulta försöksdjuren avlägsnas från den synkroniserade kulturen och tillförs testkärlen mellan den 28:e och 35:e dagen efter att moderdjuren har börjat lägga ägg (dvs. 7–14 dagar efter att de nått adult stadium). Detta garanterar att försöksdjuren redan har genomgått förstadiet till äggläggningen och har parat sig med hanar som också befinner sig i odlingskärlen. Iakttagelser i laboratoriekulturer visar att honor parar sig omedelbart eller kort efter att de har nått adult stadium om det finns hanar närvarande (Ruf, Vaninnen, egen observation). Perioden på sju dagar har valts för att underlätta integrationen i laboratorierutinerna och för att fungera som en buffert för den utvecklingsmässiga variabiliteten bland enskilda kvalster. Äggläggningen bör inledas med minst samma antal honor som senare krävs i testet (om t.ex. 400 honor behövs i testet bör minst 400 honor tillåtas att lägga ägg i två till tre dagar. Minst 1200 ägg bör vara utgångspunkten för den synkroniserade populationen (förhållande mellan könen ca 0,5, dödlighet ca 0,2). För att undvika kannibalism är det lämpligare att hålla högst 20–30 äggläggande honor i ett kärl.

Tillägg 5

Extraktionsmetoder

För mikroartropoder är värmeextraktion en lämplig metod för att skilja individer från jorden/substratet (se figur nedan). Metoden bygger på organismernas aktivitet, varför endast exemplar som rör sig kommer att kunna registreras. Principen för värmeextraktion är att gradvis försämra villkoren i provet för organismerna så att de lämnar substratet och faller ner i en fixeringsvätska (t.ex. etanol). Viktiga omständigheter är extraktionens varaktighet och skillnaden mellan goda till måttliga till dåliga villkor för organismerna. Extraktionens varaktighet i ekotoxikologiska test måste vara så kort som möjligt, eftersom en populationsökning under tiden då extraktionen pågår skulle förvränga resultaten. Å andra sidan måste temperatur- och fuktbetingelserna i provet alltid befinna sig inom ett intervall som gör det möjligt för kvalstren att röra på sig. Uppvärmning av ett jordprov leder till uttorkning av substratet. Om uttorkningen sker alltför snabbt kan en del kvalster också torka ut innan de hinner fly.

Därför föreslås följande förfarande (24) (25):

Utrustning: tullgrentratt eller jämförbara metoder, t.ex. McFadyen (uppvärmning ovanifrån, provet placeras över en tratt)

Uppvärmning: 25 °C i 12 timmar, 35 °C i 12 timmar, 45 °C i 24 timmar (totalt 48 timmar). Temperaturen bör mätas i substratet.

Fixeringsvätska: 70 % etanol

Detaljuppgifter: Ta glasbägaren som använts för testet. Avlägsna locket och linda en bit nät eller väv runt öppningen. Väven bör ha en maskstorlek på 1,0–1,5 mm. Fäst väven med ett gummiband. Vänd försiktigt bägaren upp och ner och placera den i extraktionsanordningen. Väven hindrar substratet från att falla ner i fixeringsvätskan men gör det möjligt för kvalstren att lämna provet. Påbörja uppvärmningen efter att alla bägare har placerats i extraktionsanordningen. Avsluta extraktionen efter 48 timmar. Avlägsna bägarna med fixeringsvätska och räkna kvalstren med hjälp av ett dissektionsmikroskop.

Den valda metodens extraktionseffektivitet måste ha bevisats en eller två gånger per år med hjälp av kärl som innehåller ett känt antal juveniler och adulter som hålls i obehandlade testsubstrat. Effektiviteten bör i genomsnitt vara ≥ 90 % totalt för alla utvecklingsstadier.

Extraktionsanordning av tullgrentyp

Heat source

Vial of alcohol

Wire mesh barrier

Sample goes here

Hur man förbereder testbägaren efter att testet avslutats men före extraktionen

Test vessel

Elastic band

Mesh/fabric

Test substrate with mites

Tillägg 6

Identifiering av Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer

Underklass/ordning/underordning: | Familj: | Släkte/undersläkte/art:

Kvalster/Parasitiformes/Gamasida | Laelapidae | Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer

Auktorsnamn och datum: | Fil. dr. F. Faraji (MITOX), 23 januari 2007

Hänvisningar: | Karg, W. (1994). Die freilebenden Gamasina (Gamasides), Raubmilben. Tierwelt Deutschlands 59, andra reviderade upplagan: 1–523. Hughes, A. M. (1976). The mites of stored food and houses. Brittiska jordbruks-, fiskeri- och livsmedelsdepartementet, Technical Bulletin 9: 400 s. Krantz, G. W. (1978). A manual of Acarology. Oregon State University Book Stores, Inc., 509 s.

Utmärkande kännetecken: | Tectum med rundad fintandad kant; hypostomfåror med minst sex tänder; kaudala och dorsala borst på Z4 ej särskilt långa; borstformiga dorsala borst; den genitala skölden normal, ej särskilt förstorad och når ej den anala skölden; bakre halvan av ryggskölden saknar parvisa borst; ben II och IV med något tjocka makroborst; dorsala borst Z5 ca två gånger längre än J5; fast digitus på chelicererna med 12–14 tänder och rörligt digitus med två tänder; kroppen (idiosoma) 520–685 μm lång. Hypoaspis miles används också inom biologisk bekämpning och kan förväxlas med H. aculeifer. Den största skillnaden är: H. miles tillhör undersläktet Cosmolaelaps och har knivliknande ryggborst medan H. aculeifer tillhör undersläktet Geolaelaps och har borstformiga ryggborst.

Hypoaspis aculeifer, ryggsköld med karakteristiska borst

Hypoaspis aculeifer

Originalteckningar av F. Faraji

Hypoaspis miles efter Hughes, 1976

Hypoaspis aculeifer efter Hughes, 1976

Ben IV (hona)

Ben II (hona)

100 μm

Tillägg 7

Grundläggande information om biologin hos Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer

Hypoaspis aculeifer tillhör familjen Lealapidae, ordningen kvalster (acari), klassen spindeldjur (arachnida), fylum leddjur (arthropoda). De lever i alla typer av jord och livnär sig på andra kvalster, rundmaskar, småringmaskar och hoppstjärtar (26). Om födobrist uppstår övergår de till kannibalism (27). Rovkvalstren består av kropp (idiosoma) och huvudsköld (gnathosoma). Kroppen (idiosoma) saknar tydlig differentiering mellan prosoma (huvudet) och opisthosoma (buken). Huvudskölden innehåller mundelar såsom palper och chelicerer. Chelicererna är tredelade och försedda med tänder av olika former. Hanarna använder sina chelicerer delvis för intag av föda, men huvudsakligen för att överföra spermatoforer till honorna. En ryggsköld täcker nästan hela kroppen (idiosoma). En stor del av honornas kropp utgörs av reproduktionsorganen, som är särskilt framträdande strax innan äggläggningen. På buksidan återfinns två sköldar, den bakre och den genitala skölden. Alla ben har borst och taggar. Borsten används för att förankra kvalstren när de rör sig i jord eller ovanpå jordytan. Det första benparet används främst som antenner. Det andra benparet används inte bara för förflyttning utan även för att hålla fast bytesdjuren. Taggarna på det fjärde benparet kan fungera både som skydd och som framdrivande motor (28). Hanarna är 0,55–0,65 mm långa och väger 10–15 μg. Honorna är 0,8–0,9 mm långa och väger 50–60 μg (8) (28) (figur 1).

Figur 1 hona, hane, protonymf och larv av H. aculeifer.

Vid 23 °C blir kvalstren könsmogna efter 16 dagar (honor) respektive 18 dagar (hanar) (6). Honorna överför sperman via könsöppningar (solenostom) till ovarierna. I ovarierna lagras och mognar sperman. Befruktningen sker endast efter att spermierna har mognat i ovarierna. De befruktade eller obefruktade äggen läggs i klumpar eller enskilt, helst i springor eller hål. Honor som parat sig kan få avkomma av båda könen, men ägg från oparade honor ger endast upphov till hanar. Under utvecklingen till adulter genomgår kvalstren fyra utvecklingsstadier (ägg–larv, larv–protonymf, protonymf–deutonymf, deutonymf–adult).

Äggen är mjölkvita, genomskinliga, elliptiska och cirka 0,37 mm långa med ett fast ytterhölje. Larverna är mellan 0,42 och 0,45 mm långa (8). De har endast tre par ben. I huvudregionen utvecklas palper och chelicerer. Chelicererna, som har ett fåtal småtänder, används vid kläckningen. Efter den första skalömsningen, 1–2 dagar efter kläckningen, utvecklas protonymferna. De är också vita, storleken är 0,45–0,62 mm (8) och de har fyra benpar. Chelicererna har nu alla sina tänder. Från och med detta stadium börjar kvalstren söka efter föda. Bytesdjurens yttre hinna genomborras då med chelicererna och ett matsmältningssekret sprutas in i bytesdjuren. Den delvis smälta födan kan sedan sugas upp av kvalstret. Chelicererna kan också användas till att riva loss större foderpartiklar från foderklumpar (28). Efter ytterligare en skalömsning utvecklas deutonymferna. De är 0,60–0,80 mm (8) i storlek och gula till ljusbruna i färgen. Från och med denna fas kan honorna differentieras från hanarna. Efter ytterligare en hudömsning, under vilken djuren är inaktiva och den bruna skölden utvecklas (efter cirka 14 dagar), har kvalstren nått adult stadium (28) (29) (30). Deras livslängd är mellan 48 och 100 dagar vid 25 °C (27).

Tillägg 8

Sammanfattning och tidsplan för de viktigaste åtgärderna som ska vidtas för att utföra Hypoaspis-testet

Tid (dagar) testets början = dag 0 | Åtgärd/uppgift

Dag – 35 till – 28 | Flytta honor från stamkulturerna till rengjorda kärl för att inleda synkroniseringen Två dagar senare: honorna avlägsnas Två eller tre gånger i veckan: ge djuren tillräckligt med foder

Dag – 5 (+/– 2) | Bered den syntetiska jorden

Dag – 4 (+/– 2) | Bestäm den syntetiska jordens vattenhållningskapacitet (WHC) Låt torka över natten Följande dag: väg proverna och beräkna vattenhållningskapaciteten

Dag – 4 (+/– 2) | Förhandsfukta den syntetiska jorden för att uppnå 20–30 % av vattenhållningskapaciteten

Dag 0 | Inled testet: tillsätt testkemikalien till den syntetiska jorden Inför tio honor i varje replikat Väg varje replikat Inrätta abiotiska kontroller för fukthalten och pH-värdet, två replikat per testkärl Låt fuktkontrollerna torka över natten Följande dag: väg fuktkontrollerna Följande dag: mät pH-värdet i de uttorkade abiotiska kontrollerna

Dag 3, 6, 9, 12 (ungefär) | Förse varje replikat med en tillräcklig mängd bytesorganismer Väg varje replikat och tillsätt därefter förångat vatten

Dag 14 | Avsluta testet, anordna extraktion med alla replikat plus extraktionseffektivitetskontroller Låt vattenhaltkontrollerna torka över natten Följande dag: väg vattenhaltkontrollerna Följande dag: mät pH-värdet i de uttorkade kontrollerna

Dag 16 | Avsluta extraktionen

Dag 16 + | Registrera antalet adulter och juveniler i det extraherade materialet Rapportera resultaten i malltabeller Rapportera testförfarandet på testprotokollblanketter

Tillägg 1

Förkortningar och definitioner

Tillägg 2

Försöksbetingelser för endokrint screeningtest på fisk

1. Rekommenderade arter | Knölskallelöja (Pimephales promelas) | Japansk risfisk (Oryzias latipes) | Sebrafisk (Danio rerio)

2. Testtyp | Genomflödestest | Genomflödestest | Genomflödestest

3. Vattentemperatur | 25 ± 2 °C | 25 ± 2 °C | 26 ± 2 °C

4. Belysningstyp | Fluorescerande lampor (brett spektrum) | Fluorescerande lampor (brett spektrum) | Fluorescerande lampor (brett spektrum)

5. Ljusintensitet | 10–20 μE/m2/s, 540–1000 lux, eller 50–100 ft-c (omgivande ljusnivåer i laboratoriet) | 10–20 μE/m2/s, 540–1000 lux, eller 50–100 ft-c (omgivande ljusnivåer i laboratoriet) | 10–20 μE/m2/s, 540–1000 lux, eller 50–100 ft-c (omgivande ljusnivåer i laboratoriet)

6. Fotoperiod (övergångar mellan gryning och skymning är frivilliga, men anses dock inte vara nödvändiga) | 16 timmar ljus, 8 timmar mörker | 12–16 timmar ljus, 12–8 timmar mörker | 12–16 timmar ljus, 12–8 timmar mörker

7. Fisktäthet | < 5 g/l | < 5 g/l | < 5 g/l

8. Testbehållarens storlek | Minst 10 l | Minst 2 l | Minst 5 l

9. Testlösningens volym | Minst 8 l | Minst 1,5 l | Minst 4 l

10. Volymutbyte av testlösningar | Minst 6 per dag | Minst 5 per dag | Minst 5 per dag

11. Testorganismernas ålder | Se punkt 20 | Se punkt 20 | Se punkt 20

12. Ungefärlig färskvikt för en vuxen fisk (g) | Honor: 1,5 ± 20 % Hanar: 2,5 ± 20 % | Honor: 0,35 ± 20 % Hanar: 0,35 ± 20 % | Honor: 0,65 ± 20 % Hanar: 0,4 ± 20 %

13. Antal fiskar per testkärl | 6 (2 hanar och 4 honor) | 10 (5 hanar och 5 honor) | 10 (5 hanar och 5 honor)

14. Antal behandlingar | = 3 (plus lämpliga kontroller) | = 3 (plus lämpliga kontroller) | = 3 (plus lämpliga kontroller)

15. Antal kärl per behandling | Minst 4 | Minst 2 | Minst 2

16. Antal fiskar per testkoncentration | 16 vuxna honor och 8 hanar (4 honor och 2 hanar i varje replikatkärl) | 10 vuxna honor och 10 hanar (5 honor och 5 hanar i varje replikatkärl) | 10 vuxna honor och 10 hanar (5 honor och 5 hanar i varje replikatkärl)

17. Utfodring | Levande eller frysta vuxna eller nauplier av Artemia två eller tre gånger dagligen (ad libitum), kommersiellt tillgängligt foder eller en blandning av dessa | Artemia-nauplier två eller tre gånger dagligen (ad libitum), kommersiellt tillgängligt foder eller en blandning av dessa | Artemia-nauplier två eller tre gånger dagligen (ad libitum), kommersiellt tillgängligt foder eller en blandning av dessa

18. Luftning | Ingen såvida inte halten löst syre sjunker under 60 % luftmättnad | Ingen såvida inte halten löst syre sjunker under 60 % luftmättnad | Ingen såvida inte halten löst syre sjunker under 60 % luftmättnad

19. Utspädningsvatten | Rent yt- eller brunnsvatten, rekonstituerat vatten eller avklorerat kranvatten | Rent yt- eller brunnsvatten, rekonstituerat vatten eller avklorerat kranvatten | Rent yt- eller brunnsvatten, rekonstituerat vatten eller avklorerat kranvatten

20. Förexponeringsperiod | 7 dagar rekommenderas | 7 dagar rekommenderas | 7 dagar rekommenderas

21. Den kemiska exponeringens varaktighet | 21 dagar | 21 dagar | 21 dagar

22. Biologiska endpoints | överlevnad beteende sekundära könskaraktärer VTG | överlevnad beteende sekundära könskaraktärer VTG | överlevnad beteende VTG

23. Testets godkännandekriterier | Löst syre > 60 % av luftmättnadsvärdet, medeltemperatur 25 ± 2 °C, 90 % överlevnad i kontrollerna, uppmätta testkoncentrationer inom 20 % av medelvärdet för de uppmätta värdena per behandlingsnivå. | Löst syre > 60 % av luftmättnadsvärdet, medeltemperatur 24 ± 2 °C, 90 % överlevnad i kontrollerna, uppmätta testkoncentrationer inom 20 % av medelvärdet för de uppmätta värdena per behandlingsnivå. | Löst syre > 60 % av luftmättnadsvärdet, medeltemperatur 26 ± 2 °C, 90 % överlevnad i kontrollerna, uppmätta testkoncentrationer inom 20 % av medelvärdet för de uppmätta värdena per behandlingsnivå.

Tillägg 3

Några kemiska egenskaper för godtagbart utspädningsvatten

Komponent | Koncentrationer

Partiklar | < 20 mg/l

Halt av organiskt kol | < 2 mg/l

Ojoniserad ammoniak | < 1 μg/l

Resterande mängd klor | < 10 μg/l

Total mängd bekämpningsmedel som innehåller organiska fosforföreningar | < 50 ng/l

Total mängd bekämpningsmedel som innehåller organiska klorföreningar samt polyklorerade bifenyler | < 50 ng/l

Total mängd organiskt klor | < 25 ng/l

Tillägg 4A

Leksubstrat för sebrafisk

På gallret fästs ett leksubstrat. Det ger fiskarna en struktur som de kan simma in i. Konstgjorda akvarieväxter av grön plast är till exempel lämpliga (Obs! man bör beakta möjligheten att testkemikalien adsorberas till plastmaterialet). Plastmaterialet bör lakas ut i en tillräcklig volym med varmt vatten under tillräckligt lång tid för att säkerställa att inga kemikalier läcker ut i testvattnet. Vid användning av material av glas bör man se till att fiskarna varken skadas eller blir trängda under sina intensiva rörelser.

Avståndet mellan skålen och glasrutorna bör vara minst 3 cm för att säkerställa att fiskarna inte leker utanför skålen. Den rom som läggs i skålen faller ner genom gallret och kan samlas in 45–60 minuter efter att belysningen tänts. De genomskinliga äggen är inte vidhäftande och kan lätt räknas i transversellt ljus. Om man använder fem honor per kärl kan äggantal på under 20 per dag räknas som ett lågt, upp till 100 som ett genomsnittligt och mer än 100 som ett högt antal. Lekskålen bör tas bort, äggen samlas in och lekskålen återinföras i testkärlet antingen så sent som möjligt på kvällen eller mycket tidigt på morgonen. Tiden fram till återinförandet inte bör överstiga en timme. I annat fall kan leksubstratet som trigger framkalla individuell parning och lek på ovanliga tider. Om situationen kräver ett senare införande av lekskålen bör detta göras tidigast nio timmar efter att belysningen har tänts. Vid denna sena tidpunkt på dagen framkallas inte lekbeteendet längre.

Tillägg 4B

Leksubstrat för knölskallelöja

Två eller tre kombinerade lekplattor och -skålar av keramik/plast/glas eller rostfritt stål placeras i varje testbehållare (t.ex. en 80 mm lång grå halvcirkelformad ränna i en 130 mm lång skål med uppvikt kant) (se bilden). Korrekt härdad PVC eller keramiska plattor har visat sig vara lämpliga som leksubstrat (Thorpe et al, 2007).

Det rekommenderas att plattorna är nötta för att förbättra vidhäftningen. Skålen bör också avskärmas för att förhindra fiskarna från komma åt de lagda äggen såvida inte äggens vidhäftningsförmåga har påvisats för det leksubstrat som används.

Basen är utformad för att samla upp alla ägg som inte fastnar på plattans yta och därför annars skulle falla till akvariets botten (eller de ägg som läggs direkt på den platta plastbasen). Alla leksubstrat bör lakas ur i utspädningsvatten under minst tolv timmar före användning.

HÄNVISNINGAR

Thorpe, K. L, Benstead, R., Hutchinson, T.H och Tyler C. R. (2007). An optimised experimental test procedure for measuring chemical effects on reproduction in the fathead minnow, Pimephales promelas. Aquatic Toxicology 81, 90–98.

Tillägg 5A

Bedömning av sekundära könskaraktärer hos knölskallelöja för påvisande av vissa endokrint aktiva kemikalier

Översikt

Potentiellt viktiga kännetecken för det fysiska utseendet hos vuxna knölskallelöjor i tester av hormonstörande ämnen omfattar kroppsfärgen (dvs. ljus/mörk), färgmönster (dvs. förekomst eller avsaknad av vertikala strimmor), kroppsformen (dvs. formen på huvudet och det pektorala området, uttänjd buk), och särskilda sekundära könskaraktärer (dvs. parningstuberklernas antal och storlek, storleken på nackvalken och äggläggningsröret).

Parningstuberklerna återfinns på huvudet (nackvalken) på reproduktivt aktiva hanar av knölskallelöja, och sitter normalt i ett bilateralt symmetriskt mönster (Jensen m.fl., 2001). Kontrollhonor och unga hanar och honor utvecklar inte några tuberkler (Jensen m.fl., 2001). Det kan förekomma upp till åtta enskilda tuberkler runt ögonen och mellan hanarnas luktgropar. Det flesta och största tuberklerna är belägna i två parallella linjer omedelbart under luktgroparna och ovanför munnen. Många fiskar har grupper av tuberkler under underkäken. De som sitter närmast munnen förekommer i regel som ett enda par, medan de som är belägna mer ventralt kan bestå av upp till fyra tuberkler. Det faktiska antalet tuberkler är sällan mer än 30 (intervall 18–28; Jensen m.fl., 2001). De mest framträdande tuberklerna (mätt i antal) utgörs av en enda, relativt rund struktur med en höjd som ungefär motsvarar radien. De flesta reproduktivt aktiva hanar har också åtminstone några tuberkler som är förstorade och framträdande så att de inte kan särskiljas som enskilda strukturer.

Vissa typer av endokrinstörande kemikalier kan förorsaka abnorma förekomster av vissa sekundära könskaraktärer hos det motsatta könet. Agonister som påverkar androgenreceptorer, såsom 17-beta-metyltestosteron eller 17-beta-trenbolon, kan få honor av knölskallelöja att utveckla tydliga parningstuberkler (Smith 1974; Ankley m.fl., 2001, 2003), medan agonister som påverkar östrogenreceptorer kan minska parningstuberklernas antal eller storlek hos hanar (Miles-Richardson m.fl., 1999, Harries m.fl., 2000).

Nedan följer en redogörelse av karakteriseringen av parningstuberkler hos knölskallelöja på grundval av de förfaranden som används vid den amerikanska miljöskyddsmyndighetens (EPA) laboratorium i Duluth, Minnesota. Särskilda produkter och/eller utrustning kan ersättas med tillgängliga jämförbara material.

Fiskarna kan bäst observeras med hjälp av ett belyst förstoringsglas eller i ett belyst dissekeringsmikroskop med 3x förstoring. Observera fiskarna dorsalt och med den främre delen framåt (huvudet mot betraktaren).

a Placera fisken i liten petriskål (t.ex. 100 mm i diameter), med främre delen framåt och buksidan nedåt. Fokusera sökaren för att göra det möjligt att identifiera tuberklerna. Rulla långsamt och försiktigt fisken från sida till sida för att identifiera tuberkelområdena. Räkna och klassificera tuberklerna.

b Upprepa observationen på den ventrala huvudytan genom att placera fisken på ryggen med huvudet framåt i petriskålen.

c Observationerna bör göras inom två minuter för varje fisk.

Tuberkelräkning och klassificering

Sex särskilda områden har fastställts för bedömning av förekomsten och utvecklingen av tuberkler hos vuxna knölskallelöjor. En mall har utarbetats för att kartlägga var och i vilket antal tuberklerna förekommer (se slutet av detta tillägg). Antalet tuberkler registreras och deras storlek rangordnas kvantitativt enligt följande: 0–saknas, 1–förekommer, 2–förstorad och 3–framträdande för varje organism (figur 1).

Klassificera avsaknaden av tuberkler som 0. Klassificeringen 1–förekommer definieras som alla tuberkler som har en enda punkt vars höjd är nästan lika med dess radie (diameter). Klassificeringen 2–förstorad definieras som vävnad som liknar en asterisk, vanligtvis med en stor radial bas med räfflor eller fåror som utgår från medelpunkten. På höjden är tuberkeln ofta mer taggig men kan ibland vara något avrundad. Klassificeringen 3–framträdande refererar till vanligtvis ganska stora och rundade tuberkler med mindre definition i strukturen. Ibland växer dessa tuberkler ihop och utgör en enda massa längs ett enskilt område eller en kombination av områden (B, C och D enligt beskrivning nedan). Färgen och utformningen liknar dem för klassificering 2 men är ibland ganska godtyckliga. Med hjälp av detta klassificeringssystem får man i allmänhet ett totalt tuberkelpoängvärde på < 50 för en normal kontrollhane som har 18–20 tuberkler (Jensen m.fl., 2001).

Figur 1

Det faktiska antalet tuberkler hos vissa fiskar kan vara större än antalet mallrutor (tillägg A) för ett visst klassificeringsområde. Om detta är fallet kan ytterligare klassificeringsnummer läggas till inom, till höger eller till vänster om rutan. Mallen behöver därför inte vara symmetrisk. Ytterligare en metod för kartläggning av tuberklerna som sitter ihop två och två eller vertikalt längs munnens horisontalplan är att dubbelmarkera två tuberkelklassificeringspoäng i en enda ruta.

Kartläggningsregioner:

HÄNVISNINGAR

(1) Ankley, G. T., Jensen, K. M., Kahl, M. D., Korte, J. J. och Makynen, M. E. (2001). Description and evaluation of a short-term reproduction test with the fathead minnow (Pimephales promelas). Environ Toxicol Chem 20, 1276–1290.

(2) Ankley, G. T., Jensen, K. M., Makynen, E. A., Kahl, M. D., Korte, J. J., Hornung, M. W., Henry, T. R., Denny, J. S., Leino, R. L., Wilson, V. S., Cardon, M. C., Hartig, P. C. och Gray, E. L. (2003). Effects of the androgenic growth promoter 17-β trenbolone on fecundity and reproductive endocrinology of the fathead minnow. Environ Toxicol Chem 22, 1350–1360.

(3) Harries, J. E., Runnalls, T., Hill, E., Harris, C. A.,Maddix, S., Sumpter, J. P. och Tyler, C. R. (2000). Development of a reproductive performance test for endocrine disrupting chemicals using pair-breeding fathead minnows (Pimephales promelas). Environ Sci Technol 34, 3003–3011.

(4) Jensen, K. M., Korte, J. J., Kahl, M. D., Pasha, M. S. och Ankley, G. T. (2001). Aspects of basic reproductive biology and endocrinology in the fathead minnow (Pimephales promelas). Comp Biochem Physiol C 128, 127–141.

(5) Kahl, M. D., Jensen, K. M., Korte, J. J. och Ankley, G. T. (2001). Effects of handling on endocrinology and reproductive performance of the fathead minnow. J Fish Biol 59, 515–523.

(6) Miles-Richardson, S. R., Kramer, V. J., Fitzgerald, S. D., Render, J. A., Yamini, B., Barbee, S. J. och Giesy. J. P. (1999). Effects of waterborne exposure of 17-estradiol on secondary sex characteristics and gonads of fathead minnows (Pimephales promelas). Aquat Toxicol 47, 129–145.

(7) Smith, R. J. F. (1974). Effects of 17-methyltestosterone on the dorsal pad and tubercles of fathead minnows (Pimephales promelas). Can J Zool 52, 1031–1038.

Tuberkelmall | Klassificering

ID | 1–förekommer

Datum | 2–förstorad

Poäng totalt | 3–framträdande

A | X1 | X1 | X1 | X1

B | X1 | X1 | X1 | X1

C | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1

D | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1

E | X1 | X1

F | X1 | X1 | X1 | X1

Tillägg 5B

Bedömning av sekundära könskaraktärer hos risfisk för påvisande av vissa endokrint aktiva kemikalier

Nedan följer en redogörelse av mätningen av de papillära utväxter som utgör de sekundära könskaraktärerna hos risfiskar (Oryzias latipes).

(1) Efter avlägsnandet av levern (tillägg 6) ska kroppen placeras i en konisk tub innehållande ca 10 ml 10 % neutral buffrad formalin (huvudet uppåt, stjärten nedåt). Om könskörteln fixeras i en annan lösning än 10 % neutral buffrad formalin lägger man ett transversellt snitt över kroppen mellan den främre delen av analfenan och anus med ett rakblad, samtidigt som man undviker att skada gonoporen och könskörteln i sig (figur 3). Placera den kraniala delen av fiskkroppen i fixeringslösningen för att bevara könskörteln, och stjärtdelen av fiskkroppen i 10 % neutral buffrad formalin enligt beskrivning ovan.

(2) Efter att fiskkroppen placerats i 10 % neutral buffrad formalin fattar man tag i analfenans främre del med en pincett och viker den i ca 30 sekunder så att analfenan hålls utspänd. När man lyfter upp analfenan med pincetten bör man försiktigt fatta tag i den främre delen så att man inte skadar de papillära utväxterna.

(3) Efter att analfenan hållits utspänd i ca 30 sekunder bevaras fiskkroppen i 10 % neutral buffrad formalin vid rumstemperatur fram till mätningen av de papillära utväxterna (mätningen ska utföras efter fixering i minst 24 timmar).

Mätning

(1) Fiskkroppen fixeras i 10 % neutral buffrad formalin i minst 24 timmar. Ta därefter upp fiskkroppen ur den koniska tuben och torka av formalinet på filterpapper (eller en pappersservett).

(2) Lägg fisken med buksidan upp. Klipp sedan försiktigt av analfenan med en liten dissektionssax (det är lämpligt att klippa av analfenan tillsammans med en liten bit vävnad från fenfästet (pterygiofor)).

(3) Fatta tag i den främre delen av den avskurna analfenan med en pincett och lägg den på ett objektglas med flera droppar vatten. Täck därefter analfenan med ett täckglas. Var noga med att inte skada de papillära utväxterna när analfenan hålls fast med pincetten.

(4) Räkna antalet ledplattor med papillära utväxter med hjälp av räknaren under ett biologiskt mikroskop (upprätt eller inverterat mikroskop). De papillära utväxterna kan kännas igen på en liten bildning av utväxter som är synbar på den bakre kanten av fenstrålen. Skriv in antalet ledplattor med papillära utväxter på varje fenstråle i tabellen (t.ex. första fenstrålen: 0, andra fenstrålen: 10, tredje fenstrålen: 12 osv.), och skriv in summan av dessa antal i Excel-tabellen per enskild fisk. Vid behov kan man fotografera analfenan och räkna antalet ledplattor med papillära utväxter på fotot.

(5) Efter mätningen läggs analfenan i den koniska tuben som beskrivs i (1) och bevaras.

Fig.1. Diagram som visar könsskillnaden i analfenans storlek och form. A, hane, B, hona. Oka, T. B. (1931). On the processes on the fin rays of the male of Oryzias latipes and other sex characters of this fish. J. Fac. Sci., Tokyo Univ., IV:2, 209–218.

Fig.2. A, Utväxter på fenstrålarnas ledplattor i analfenan. J.P. = ledplatta, A.S. = axelavstånd, P. = utväxt. B, Fenstrålens distala ände. Aktinotrikierna (Act.) sitter på spetsen. Oka, T. B. (1931). On the processes on the fin rays of the male of Oryzias latipes and other sex characters of this fish. J. Fac. Sci., Tokyo Univ., IV:2, 209–218.

Fig.3. Fotografi av fiskkropp som visar var snittet ska läggas när könskörteln fixeras i en annan fixeringslösning än 10 % neutral buffrad formalin. I detta fall ska den övriga kroppen skäras av mellan analfenans främre kant och analöppningen med ett rakblad (röd linje), och fiskkroppens huvudsida läggs sedan i samma fixeringslösning som könskörteln och stjärtsidan läggs i 10 % neutral buffrad formalin.

1 Papillära utväxter förekommer normalt endast hos vuxna hanar och påträffas på den andra till den sjunde eller åttonde fenstrålen räknat från analfenans bakre kant (figur 1 och 2). Utväxterna förekommer sällan på den första fenstrålen från analfenans bakre kant. Detta standardförfarande omfattar mätning av utväxter på den första fenstrålen (fenstrålarna räknas i ordningsföljd från analfenans bakre kant i detta standardförfarande).

Tillägg 6

Rekommenderade förfaranden för provtagning för vitellogeninanalys

Man bör vara noga med att undvika korskontaminering mellan VTG-prover från hanar och honor.

Förfarande 1A: knölskallelöja, insamling av blod från stjärtvenen/-artären

Efter bedövning skärs stjärtspolen delvis av med en skalpell och blod insamlas från den kaudala venen/artären med ett hepariniserat mikrohematokrit-centrifugerat kapillärrör. Efter att blodet har samlats in isoleras plasman snabbt genom centrifugering vid 15000 g i 3 minuter (eller vid 15000 g i 10 minuter vid 4 °C). Om så önskas kan procentandelen hematokrit fastställas efter centrifugeringen. Plasmadelen avlägsnas sedan från mikrohematokritröret och lagras i ett centrifugrör med 0,13 enheter aprotinin (en proteashämmare) vid – 80 °C tills bestämningen av vitellogenin kan göras. Beroende på knölskallelöjans storlek (som är könsbestämd) uppgår mängden blod som kan samlas in till 5–60 μl per fisk (Jensen m.fl., 2001).

Förfarande 1B: Knölskallelöja, insamling av blod från hjärtat

Alternativt kan blod också samlas in genom hjärtpunktering med en hepariniserad spruta (1000 enheter heparin per ml). Blodet överförs till eppendorfrör (på is) och centrifugeras sedan (5 minuter, 7000 g, rumstemperatur). Plasman bör överföras till rena eppendorfrör (i alikvoter om volymen plasma är tillräckligt stor) och omedelbart frysas vid – 80 °C tills den kan analyseras (Panter m.fl., 1998).

Förfarande 2A: Japansk risfisk, utskärning av levern hos risfisk

Avlägsna testfisken från testbehållaren

(1) Testfisken bör avlägsnas ur testbehållaren med hjälp av en liten rund håv. Var noga med att inte tappa ner testfisken i de andra testbehållarna.

(2) I princip ska testfiskarna avlägsnas i följande ordning: kontroll, lösningsmedelskontroll (i förekommande fall), lägsta koncentrationen, mittersta koncentrationen, högsta koncentrationen och positiv kontroll. Dessutom bör alla hanar avlägsnas från en testbehållare innan de återstående honorna avlägsnas.

(3) Könet på varje testfisk fastställs på grundval av externa sekundära könskaraktärer (t.ex. formen på analfenan).

(4) Placera testfisken i en behållare för transport och för den till arbetsstationen där levern skärs ut. Kontrollera att etiketterna på testbehållaren och transportbehållaren stämmer och bekräfta att det antal fiskar som har avlägsnats från testbehållaren och den antal fiskar som återstår i behållaren stämmer överens med vad som förväntas.

(5) Om könet inte kan fastställas genom fiskens externa utseende avlägsnas alla fiskarna från testbehållaren. I detta fall bör könet identifieras genom granskning av könskörteln eller de sekundära könskaraktärerna under ett stereomikroskop.

Utskärning av levern

(1) Överför testfisken från transportbehållaren till bedövningslösningen med den lilla runda håven.

(2) Efter bedövning av testfisken överförs den till ett filterpapper (eller en pappersservett) med hjälp av en anatomisk pincett. När man lyfter upp testfisken bör man fatta tag med pincetten på sidorna av huvudet för att undvika att stjärten bryts av.

(3) Torka av vattnet på ytan av testfisken på filterpappret (eller pappersservetten).

(4) Lägg fisken med buksidan upp. Lägg därefter ett mindre tvärgående snitt halvvägs mellan den ventrala halsregionen och den mellersta abdominala regionen med hjälp av en dissektionssax.

(5) För in dissektionssaxen i det lilla snittet och öppna buken från en punkt som är belägen kaudalt från gälmanteln till den kraniala sidan av anus längs bukens mittlinje. Var noga med att inte föra in dissektionssaxen för djupt så att levern och könskörteln skadas.

(6) Utför följande steg under ett stereomikroskop.

(7) Placera testfisken med buksidan upp på pappersservetten (en petriskål av glas eller ett objektglas går också bra).

(8) Vik ut bukhålans väggar med en precisionspincett och blottlägg de inre organen. Det är även godtagbart att blottlägga de inre organen genom att vid behov avlägsna den ena sidan av bukhålans vägg.

(9) Blotta den del som förbinder levern med gallblåsan med hjälp av en annan precisionspincett. Tag därefter fatt i gallgången och skär av gallblåsan. Var noga med att inte skada gallblåsan.

(10) Tag fatt i matstrupen och skär loss mag-tarmkanalen från levern på samma sätt. Var försiktig så att inte tarminnehållet läcker ut. Skär loss den kaudala mag-tarmkanalen från anus och avlägsna den från bukhålan.

(11) Skär bort fettmassan och andra vävnader från leverns utsida. Var noga med att inte skada levern.

(12) Tag fatt i portasystemet med hjälp av en precisionspincett och avlägsna levern från bukhålan.

(13) Placera levern på objektglaset. Avlägsna om så behövs allt övrigt fett och all främmande vävnad (t.ex. bukhinna) från leverns yta med hjälp av precisionspincetten.

(14) Väg levern med ett 1,5 ml mikrorör som emballagevikt med en elektronisk analysvåg. Registrera värdet i en tabell (läs: 0,1 mg). Bekräfta identifieringsinformationen på mikroröret som innehåller levern.

(15) Stäng mikrorörets lock. Förvara det i ett kylställ (eller ett isställ).

(16) När levern har avlägsnats diskas dissektionsinstrumenten eller ersätts med rena.

(17) Avlägsna levrarna från alla fiskar i transportbehållaren enligt beskrivning ovan.

(18) När levrarna har skurits ut från alla fiskarna i transportbehållaren (dvs. alla hanar och honor i en testbehållare) placeras alla leverprover i ett provrörsställ med en etikett för identifiering och förvaras i en frys. När levrarna förs vidare till förbehandlingen strax efter utskärningen bärs proverna till nästa arbetsstation i ett kylställ (eller isställ).

Efter utskärningen av levern kan fiskkroppens sekundära könskaraktärer mätas.

Prov

Lagra leverproverna från testfiskarna vid ≤ – 70 °C om de inte ska användas i förbehandlingen kort efter utskärningen.

Fig-1 Ett snitt läggs precis framför bröstfenorna med en sax.

Fig-2 Buken öppnas längs mittlinjen med en sax till en punkt ungefär 2 mm kranialt från anus.

Fig-3 Bukväggarna öppnas med en pincett för blottläggning av levern och andra interna organ. (Alternativt kan bukväggarna fästas lateralt).

Fig-4 Levern friläggs och avlägsnas utan att skära med hjälp av en peang.

Fig-5 Tarmarna dras försiktigt ut med hjälp av peangen.

Fig-6 Båda ändarna av tarmarna och eventuellt vidhängande tarmkäx klipps av med en sax.

Fig-7 (hona) Förfarandet är exakt detsamma för honor.

Fig-8 Det avslutade förfarandet.

Förfarande 2B: Japansk risfisk (Oryzias latipes), förbehandling av levern för analys av vitellogenin

Ta fram flaskan med homogenatbuffertlösning från ELISA-utrustningen och kyl den med krossad is (lösningens temperatur: ≤ 4 °C). Om man använder homogenatbuffertlösningen från EnBio:s ELISA-system ska lösningen tinas vid rumstemperatur. Kyl sedan ner flaskan med krossad is.

Beräkna volymen av homogenatbuffertlösningen för levern på grundval av dess vikt (tillsätt 50 μl av homogenatbuffertlösningen per mg av levervikten för homogenatet). Om levern till exempel väger 4,5 mg är homogenatbuffertlösningens volym för levern 225 μl. Gör upp en förteckning över homogenatbuffertlösningens volym för alla levrarna.

Förberedelse av levern för förbehandling

(1) Ta ut det 1,5 ml mikrorör som innehåller levern ur frysen strax före förbehandlingen.

(2) Förbehandlingen av levrar från hanar bör genomföras före förbehandlingen av honornas levrar för att undvika kontaminering av vitellogenin. Förbehandlingen för testgrupperna bör dessutom utföras i följande ordning: kontroll, lösningsmedelskontroll (i förekommande fall), lägsta koncentrationen, mittersta koncentrationen, högsta koncentrationen och positiv kontroll.

(3) Antalet 1,5 ml mikrorör som innehåller leverprover som tagits ut ur frysen vid en viss tidpunkt bör inte överstiga det antal som kan centrifugeras vid den tidpunkten.

(4) Ordna 1,5 ml mikrorören som innehåller leverprover efter de nummer proven har i isstället (levern behöver inte tinas).

Utförandet av förbehandlingen

1. Tillsats av homogeniseringsbuffertlösningen

(1) Kontrollera på förteckningen vilken volym av homogenatbuffertlösningen som ska användas för ett visst leverprov och ställ in mikropipetten (volym: 100–1000 μl) på den lämpliga volymen. Fäst en ren spets på mikropipetten.

(2) Pipettera upp homogenatbuffertlösningen från reagensflaskan och tillsätt 1,5 ml buffertlösning i det 1,5 ml mikrorör som innehåller levern.

(3) Tillsätt homogenatbuffertlösningen i alla 1,5 ml mikrorör som innehåller levrar enligt det förfarande som beskrivs ovan. Det finns ingen anledning att byta ut mikropipettspetsen med en ny. Om spetsen har blivit kontaminerad eller misstänks vara kontaminerad bör den dock bytas ut.

2. Homogenisering av levern

(1) Fäst en ny mortelstöt för homogenisering på mikrorörshomogenisatorn.

(2) För in mortelstöten i 1,5 ml mikroröret. Håll mikrorörshomogenisatorn och pressa levern mellan mortelstötens yta och innerväggen på 1,5 ml mikroröret.

(3) Kör mikrorörshomogenisatorn i 10–20 sekunder. Kyl ner 1,5 ml mikroröret med krossad is när detta görs.

(4) Ta ut mortelstöten från 1,5 ml mikroröret och låt det stå i ca 10 sekunder. Kontrollera därefter suspensionen visuellt.

(5) Om man kan se delar av lever i suspensionen ska steg (3) och (4) upprepas tills ett godtagbart leverhomogenat har beretts.

(6) Kyl ner det suspenderade leverhomogenatet i isstället till dess att centrifugeringen utförs.

(7) Byt ut mortelstöten mot en ny för varje homogenat.

(8) Homogenisera alla levrar med homogenatbuffertlösningen enligt det förfarande som beskrivs ovan.

3. Centrifugering av det suspenderade leverhomogenatet

(1) Bekräfta att temperaturen i kylcentrifugkammaren är ≤ 5 °C.

(2) Ställ in 1,5 ml mikrorören som innehåller de suspenderade leverhomogenaten i kylcentrifugen (justera jämvikten vid behov).

(3) Centrifugera de suspenderade leverhomogenaten vid 13000 g i 10 minuter vid ≤ 5 °C. Om supernatanterna är tillräckligt separerade kan dock centrifugalkraften och varaktigheten justeras efter behov.

(4) Efter centrifugeringen kontrolleras att supernatanterna är tillräckligt separerade (yta: fett, mellanparti: supernatant, bottenskikt: levervävnad). Om skikten inte är tillräckligt separerade centrifugeras suspensionen igen under samma betingelser.

(5) Avlägsna alla prov från kylcentrifugen och ordna dem efter de nummer proven har i isstället. Var noga med att inte återsuspendera de åtskilda skikten efter centrifugeringen.

4. Insamling av supernatanten

(1) Placera fyra 0,5 ml mikrorör i provrörsstället för lagring av supernatanten.

(2) Samla in 30 μl supernatant (separerad som det mellanliggande skiktet) med mikropipetten och tillsätt supernatanten till ett 0,5 ml mikrorör. Var noga med att inte få med fettet på ytan eller levervävnaden i det undre lagret.

(3) Samla in supernatanten och tillsätt den till två andra 0,5 ml mikrorör på samma sätt som beskrivs ovan.

(4) Samla in resten av supernatanten med mikropipetten (om möjligt: ≥ 100 μl). Tillsätt därefter supernatanten till de återstående 0,5 ml mikrorören. Var noga med att inte få med fettet på ytan eller levervävnaden i det undre lagret.

(5) Stäng locket på 0,5 ml mikroröret och anteckna supernatantens volym på etiketten. Kyl därefter omedelbart ner mikrorören i isstället.

(6) Byt ut spetsen på mikropipetten till en ny för varje supernatant. Om en stor mängd fett fäster sig vid spetsen bör den omedelbart bytas ut mot en ny för att undvika kontaminering av leverextraktet med fett.

(7) Fördela hela den centrifugerade supernatanten i 0,5 ml mikrorör enligt det förfarande som beskrivs ovan.

(8) Efter att supernatanten har tillsatts till 0,5 ml mikrorör placeras de alla i provrörsstället med identifieringsetiketten och fryses sedan omedelbart ner i frysen. Om VTG-halterna ska mätas omedelbart efter förbehandlingen hålls ett 0,5 ml mikrorör (med 30 μl supernatant) kallt i provrörsstället och överförs sedan till arbetsstationen där ELISA-testet utförs. I ett sådant fall ska alla övriga mikrorör placeras i provrörsställen och frysas ner i frysen.

(9) Efter insamling av supernatanten kasseras restprodukterna på lämpligt sätt.

Lagring av provet

Lagra 0,5 ml mikrorören som innehåller supernatanten av leverhomogenatet vid ≤ – 70 °C tills de används för ELISA-testet.

Förfarande 3A: Sebrafisk, insamling av blod från den kaudala venen/artären

Omedelbart efter bedövning skärs stjärtspolen av transversalt, och blodet insamlas från den kaudala artären/venen med ett hepariniserat mikrohematokrit-centrifugerat kapillärrör. Volymerna blod varierar mellan 5 och 15 μl beroende på fiskens storlek. En lika stor mängd buffertlösning med aprotinin (6 μgml i fosfatbuffrad saltlösning (PBS)) tillsätts i mikrokapillärröret och plasman separeras från blodet genom centrifugering (5 minuter vid 600 g). Plasman samlas i provrören och lagras vid – 20 °C tills de analyseras med avseende på vitellogenin eller andra proteiner av intresse.

Förfarande 3B: Sebrafisk, insamling av blod genom hjärtpunktering

För att undvika koagulering av blod och nedbrytning av proteiner tas proven i en buffertlösning bestående av fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som innehåller heparin (1000 enheter/ml) och proteashämmaren aprotinin (2 TIU/ml). Som ingredienser i buffertlösningen rekommenderas heparin (ammoniumsalt) och frystorkad aprotinin. För blodprovstagning rekommenderas en spruta (1 ml) med en fast tunn nål (t.ex. Braun omnikan-F). Sprutan ska fyllas på förhand med en buffert (ca 100 μl) för att helt eluera de små blodvolymerna från varje fisk. Blodproven tas genom hjärtpunktering. Till att börja med bör fisken bedövas med MS-222 (100 mg/l). En lämplig bedövningsnivå gör det möjligt för användaren att urskilja sebrafiskens hjärtslag. Medan hjärtpunkteringen utförs ska sprutans kolv hållas under svagt tryck. Samla in blodvolymer på mellan 20 och 40 ml. Efter hjärtpunkteringen ska blod/buffert-blandningen tillsättas i provröret. Plasman separeras från blodet genom centrifugering (20 min., 5000 g) och bör förvaras vid – 80 °C tills den behövs för analys.

Förfarande 3C: Standardförfarande: Sebrafisk, homogenisering av huvud och stjärt

(1) Fiskarna bedövas eller avlivas i enlighet med testbeskrivningen.

(2) Huvudet och stjärten skärs av i enlighet med figur 1.

Obs! Alla dissektionsinstrument och skärbrädan bör sköljas och rengöras ordentligt (t.ex. med 96 % etanol) mellan hanteringen av varje enskild fisk att förhindra vitellogenin-förorening från honor eller inducerade hanar till oinducerade hanar.

Figur 1

Skär bakom bröstfenan

Skär bakom ryggfenan

För Vtg-analys

För gonadhistologi

(3) Den sammanlagda vikten av huvud och stjärt från varje fisk mäts till närmaste mg.

(4) Efter vägning placeras delarna i lämpliga rör (t.ex. 1,5 ml eppendorfrör) och fryses vid – 80 °C tills homogeniseringen, eller homogeniseras direkt på is med två mortelstötar av plast. (Andra metoder kan användas om de utförs på is och resultatet är en homogen massa). Obs! Rören ska numreras noggrant så att fiskarnas huvud och stjärt kan hänföras till deras respektive kroppar, som används för histologisk undersökning av könskörtlarna.

(5) När en homogen massa erhållits tillsätts iskall homogeniseringsbuffertlösning med en mängd på 4 gånger vävnadens vikt. Fortsätt att arbeta med mortelstötarna tills blandningen är homogen. Viktig anmärkning: Nya mortelstötar används för varje fisk.

(6) Proven läggs på is tills centrifugeringen vid 4 °C och 50000 × g i 30 minuter.

(7) Använd en pipett för att dosera ut portioner på 20 μl supernatant i minst två rör genom att doppa pipettens spets under fettlagret på ytan och försiktigt suga upp supernatanten utan att få med fragment av fett eller små bitar.

(8) Rören förvaras vid – 80 °C fram till användningen.

1 Buffertlösning för homogenisering: 50 mM Tris-HCl pH 7,4; 1 % proteashämmarblandning (Sigma): 12 ml Tris-HCl pH 7,4 + 120 μl proteashämmarblandning. TRIS: TRIS-ULTRA PURE (ICN), t.ex. från Bie & Berntsen, Danmark. Proteashämmarblandning: Från Sigma (för däggdjursvävnader), produkt nr P 8340. Anmärkning: Buffertlösningen för homogenisering bör användas samma dag som den beretts. Lägg den på is under användningen.

Tillägg 7

Vitellogeninberikade prover och referensstandard för tester

Varje dag som vitellogenintester utförs ska ett berikningsprov analyseras som beretts med en referensstandard för tester (inter-assay). Vitellogeninet som används för beredning av referensstandarden ska komma från ett annat parti än det som används för att bereda kalibreringsstandarderna för det test som utförs.

Ett berikningsprov bereds genom att man tillsätter en känd mängd av referensstandarden till ett prov med plasma från kontrollhanar. Provet berikas tills en vitellogeninkoncentration på mellan 10 och 100 gånger den förväntade vitellogeninkoncentrationen i hanliga kontrollfiskar uppnås. Det berikade provet med hanlig kontrollplasma kan komma från en enda fisk eller vara en blandning av flera olika fiskar.

Ett delprov av den oberikade hanliga kontrollplasman analyseras i minst två duplikatbrunnar. Det berikade provet analyseras också i minst två duplikatbrunnar. Den genomsnittliga mängden vitellogenin i de två icke-berikade hanliga kontrollproven läggs till den beräknade mängden vitellogenin som lagts till berikningsproverna i syfte att fastställa en förväntad koncentration. Förhållandet mellan denna förväntade koncentration och den uppmätta koncentrationen rapporteras tillsammans med resultaten från varje försöksomgång som utförs på samma dag.

Tillägg 8

Flödesschema över beslutsgången för den statistiska analysen

Dunns test på replikatmedel- värden

Dunnetts test på nästlad ANOVA

Nej

Dunns eller Mann-Whitneys test på replikatmedelvärden

Variansstabiliserande omvandling?

>=4 repl. per konc.

<=3 repl. per konc.

Dunns test

Nej

Normaliserings- omvandling?

Tamhane-Dunnetts test

>=4 repl. per konc.

<=3 repl. per konc.

Nästlad ANOVA ej normal

Nej

Variansstabiliserande omvandling?

Dunnetts test

Varianserna olika

Varianserna lika

Ej monoton

Jonckheeres eller Williams test (step-down)

Step-downtrendtest på replikatmedelvärden

Monoton

Tamhane-Dunnetts test på nästlad ANOVA

Dunns eller Mann-Whitneys test

Nästlad ANOVA normal

Replikatmedelvärden ej normalfördelade

Replikatmedelvärden normalfördelade

Step-downgrundat Jonckheeres test

Replikatmedelvärden ej normal el. ej homogena

Replikatmedelvärden normala & homogena

Avgör om dos responsen är monoton

Tillägg 1

Försöksdjur | Yngel av Xenopus laevis

Inledande yngelstadium | Stadium 51 enligt Nieuwkoop och Faber

Exponeringstid | 21 dagar

Urvalskriterier, yngel | Utvecklingsstadium och total längd (frivilligt)

Testkoncentrationer | Minst tre koncentrationer som spänner över ungefär en storleksordning

Exponeringssystem | Genomflöde (föredras) och/eller statisk förnyelse

Testsystemets flödeshastighet | 25 ml/min (fullständig förnyelse av volymen ungefär per 2,7 timmar)

Primära endpoints/Bestämningsdag | Dödlighet | Dagligen

Utvecklingsstadium | Dag 7 och 21

Bakbenslängd | Dag 7 och 21

Längd från nos till kloak | Dag 7 och 21

Våt kroppsvikt | Dag 7 och 21

Sköldkörtelns histologi | Dag 21

Utspädningsvatten/Laboratoriekontroll | Avklorerat kranvatten (kolfiltrerat) eller motsvarande laboratoriekälla

Yngeltäthet | 20 larver per testkärl (5/l)

Testlösning/Testkärl | 4–10 l (10–15 cm minsta vattendjup)/Testkärl av glas eller rostfritt stål (t.ex. 22,5 cm × 14 cm × 16,5 cm)

Replikation | Fyra replikattestkärl per testkoncentration och kontroll

Godtagbar dödlighetsfrekvens i kontrollerna | ≤ 10 % per replikattestkärl

Sköldkörtelfixering | Antal fixerade | Samtliga grodyngel (fem per replikat utvärderas initialt)

Område | Huvudet eller hela kroppen

Fixermedel | Davidsons fixativ

Utfodring | Foder | Sera Micron® eller motsvarande

Mängd/Frekvens | Se tabell 1 för utfodringsprogram med Sera Micron®

Belysning | Fotoperiod | 12 h ljus/12 h mörker

Intensitet | 600–2000 lux (mätt vid vattenytan)

Vattentemperatur | 22 ± 1 °C

pH-värde | 6,5–8,5

Halt av löst syre | > 3,5 mg/l (>40 % luftmättnad)

Provtagningsschema, analytisk kemi | En gång per vecka (fyra provtagningar per test)

Tillägg 2

Rapporteringstabeller för rådata och sammanställda data

Kemisk information

Ange testkemikalie, koncentrationsenheter och behandlingar

Testkemikalie:

Koncentrationsenheter:

Behandling 1

Behandling 2

Behandling 3

Behandling 4

Datum (dag 0): | Ange datum (dd/mm/åå)

Datum (dag 7): | Ange datum (dd/mm/åå)

Datum (dag 21): | Ange datum (dd/mm/åå)

DAG X DATUM 00/00/00

ROW | TRT | TRT# | REP | IND | ID# | STAGE | BL | HLL | WEIGHT

1 | 0,00 | 1

2 | 0,00 | 1

3 | 0,00 | 1

4 | 0,00 | 1

5 | 0,00 | 1

6 | 0,00 | 1

7 | 0,00 | 1

8 | 0,00 | 1

9 | 0,00 | 1

10 | 0,00 | 1

11 | 0,00 | 1

12 | 0,00 | 1

13 | 0,00 | 1

14 | 0,00 | 1

15 | 0,00 | 1

16 | 0,00 | 1

17 | 0,00 | 1

18 | 0,00 | 1

19 | 0,00 | 1

20 | 0,00 | 1

21 | 0,00 | 2

22 | 0,00 | 2

23 | 0,00 | 2

24 | 0,00 | 2

25 | 0,00 | 2

26 | 0,00 | 2

27 | 0,00 | 2

28 | 0,00 | 2

29 | 0,00 | 2

30 | 0,00 | 2

31 | 0,00 | 2

32 | 0,00 | 2

33 | 0,00 | 2

34 | 0,00 | 2

35 | 0,00 | 2

36 | 0,00 | 2

37 | 0,00 | 2

38 | 0,00 | 2

39 | 0,00 | 2

40 | 0,00 | 2

41 | 0,00 | 3

42 | 0,00 | 3

43 | 0,00 | 3

44 | 0,00 | 3

45 | 0,00 | 3

46 | 0,00 | 3

47 | 0,00 | 3

48 | 0,00 | 3

49 | 0,00 | 3

50 | 0,00 | 3

51 | 0,00 | 3

52 | 0,00 | 3

53 | 0,00 | 3

54 | 0,00 | 3

55 | 0,00 | 3

56 | 0,00 | 3

57 | 0,00 | 3

58 | 0,00 | 3

59 | 0,00 | 3

60 | 0,00 | 3

61 | 0,00 | 4

62 | 0,00 | 4

63 | 0,00 | 4

64 | 0,00 | 4

65 | 0,00 | 4

66 | 0,00 | 4

67 | 0,00 | 4

68 | 0,00 | 4

69 | 0,00 | 4

70 | 0,00 | 4

71 | 0,00 | 4

72 | 0,00 | 4

73 | 0,00 | 4

74 | 0,00 | 4

75 | 0,00 | 4

76 | 0,00 | 4

77 | 0,00 | 4

78 | 0,00 | 4

79 | 0,00 | 4

80 | 0,00 | 4

Utvecklingsstadium | Längd från nos till kloak (mm) | Bakbenslängd (mm) | Vikt (mg)

1 | 1 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0!

1 | 2 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0!

1 | 3 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0!

1 | 4 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0!

2 | 1 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0!

2 | 2 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0!

2 | 3 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0!

2 | 4 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0!

3 | 1 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0!

3 | 2 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0!

3 | 3 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0!

3 | 4 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0!

4 | 1 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0!

4 | 2 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0!

4 | 3 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0!

4 | 4 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0!

Testdag | Datum | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4

0 | 00/00/00

1 | #Value!

2 | #Value!

3 | #Value!

4 | #Value!

5 | #Value!

6 | #Value!

7 | #Value!

8 | #Value!

9 | #Value!

10 | #Value!

11 | #Value!

12 | #Value!

13 | #Value!

14 | #Value!

15 | #Value!

16 | #Value!

17 | #Value!

18 | #Value!

19 | #Value!

20 | #Value!

21 | #Value!

Summa, replikat | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0

Summa, behandling | 0 | 0 | 0 | 0

Tabell 5 Kriterier för vattenkvalitet

Exponeringssystem (genomflöde/statisk förnyelse):

Temperatur:

Ljusintensitet:

Ljus/mörkercykel:

Foder:

Utfodringsfrekvens:

Vattnets pH:

Jodkoncentration i testvattnet:

Kemiskt namn:

CAS-nummer:

Testdag | Datum | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4

0 | 00/00/00

1 | #Value!

2 | #Value!

3 | #Value!

4 | #Value!

5 | #Value!

6 | #Value!

7 | #Value!

8 | #Value!

9 | #Value!

10 | #Value!

11 | #Value!

12 | #Value!

13 | #Value!

14 | #Value!

15 | #Value!

16 | #Value!

17 | #Value!

18 | #Value!

19 | #Value!

20 | #Value!

21 | #Value!

Tabell 7 Histopatologiska rapporteringstabeller för kärnkriterier

Datum: | Kemikalie: | Patolog:

ID, kontrolldjur – replikat 1 | ID, doserat djur – replikat 1

ID, kontrolldjur – replikat 2 | ID, doserat djur – replikat 2

Totalt: | Totalt:

ID, doserat djur – replikat 1 | ID, doserat djur – replikat 1

ID, doserat djur – replikat 2 | ID, doserat djur – replikat 2

Totalt: | Totalt:

Tabell 8 Ytterligare histopatologiska kriterier

Datum: | Kemikalie: | Patolog:

Storleksökning, follikulär lumen | Storleksminskning, follikulär lumen | Storleksökning, follikulär lumen | Storleksminskning, follikulär lumen

ID, kontrolldjur – replikat 1 | ID, doserat – djur replikat 1

ID, kontrolldjur – replikat 2 | ID, doserat – djur replikat 2

Totalt: | Totalt:

Storleksökning, follikulär lumen | Storleksminskning, follikulär lumen | Storleksökning, follikulär lumen | Storleksminskning, follikulär lumen

ID, doserat djur – replikat 1 | ID, doserat djur – replikat 1

ID, doserat djur – replikat 2 | ID, doserat djur – replikat 2

Totalt: | Totalt:

Datum:

Kemikalie:

Patolog:

Förklarande beskrivning

ID, kontrolldjur – replikat 1

ID, kontrolldjur – replikat 2

ID, doserat djur – replikat 1

ID, doserat djur – replikat 2

ID, doserat djur – replikat 1

ID, doserat djur – replikat 2

ID, doserat djur – replikat 1

ID, doserat djur – replikat 2

Kontroll | Dos 1 | Dos 2 | Dos 3

Endpoint | Replikat | Medel | sd | cv | N | Medel | sd | cv | N | p-värde | Medel | sd | cv | N | p-värde | Medel | sd | cv | N | p-värde

Bakbens-längd (mm) | 1

Medelvärde:

Längd från nos till kloak (mm) | 1

Medelvärde:

Våtvikt (mg) | 1

Medelvärde:

Kontroll | Dos 1 | Dos 2 | Dos 3

Replikat | Median | Min. | Max | N | Median | Min. | Max | N | p-värde | Median | Min. | Max | N | p-värde | Median | Min. | Max | Median | p-värde

Utvecklings-stadium | 1

Medelvärde:

Tillägg 3

Alternativ analys av vikt och längd om mer än 20 % av grodynglen genomgår de senare utvecklingsstadierna vid en eller flera koncentrationer

Om ett ökat antal grodyngel utvecklas bortom stadium 60 (≥ 20 %) i en eller flera nominella koncentrationer bör en tvåfaktors ANOVA med en nästlad variansstruktur utföras för samtliga grodyngel för att bedöma tillväxteffekter som beror på kemiska behandlingar, samtidigt som man tar hänsyn till den effekt de senare utvecklingsstadierna har på tillväxten.

Detta förslag innebär att man använder alla data, men att man tar hänsyn till den effekt som de senare utvecklingsfaserna har. Detta kan göras med en tvåfaktors ANOVA med en nästlad variansstruktur. Ange LateStage = ja för ett djur om dess utvecklingsstadium är 61 eller mer. I annat fall anges LateStage = nej. Därefter kan en tvåfaktors ANOVA för koncentrationen och LateStage och deras interaktion utföras, med Rep(Conc) som slumpmässig faktor och Tadpole(Rep) en ytterligare slumpmässig effekt. Detta behandlar rep som analysenhet och ger i stort sett samma resultat som en vägd analys av medelvärdena för rep*latestage, vägda mot antalet djur per medelvärde. Om erhållna data strider mot variansanalysens krav på normalitet eller varianshomogenitet kan en normaliserad rangordningsomvandling göras för att undanröja denna invändning.

Utöver de vanliga ANOVA F-testerna för effekterna av Conc, LateStage, och deras interaktioner kan F-testet för interaktion delas upp i ytterligare två ANOVA F-tester, ett för de genomsnittliga responserna över alla koncentrationer för LateStage = Nej och ett annat för de genomsnittliga responserna över alla koncentrationer för LateStage = ja. Ytterligare jämförelser av testkärlens medelvärden mot kontrollen görs inom varje nivå av LateStage. Ett trendtest kan utföras med hjälp av lämpliga kontraster, eller enklare parvisa jämförelser kan göras om det finns bevis på icke-monoton dos-respons inom en nivå av variabeln LateStage. En Bonferroni-Holm-justering av p-värdena görs endast om motsvarande F-skärning inte är signifikant. Detta kan göras i SAS och förmodligen även i andra statistiska programvarupaket. Komplikationer kan uppstå när det inte finns några djur som har utvecklats till sena stadier i vissa koncentrationer, men dessa situationer kan hanteras på ett okomplicerat sätt.

Tillägg 4

Definitioner

Tillägg 1

Definitioner

Följande definitioner gäller för denna testmetod (i detta test uttrycks alla effektkoncentrationer som massan av testkemikalien per torrmassa av testjorden):

Tillägg 2

De viktigaste åtgärderna och tidsplan för att utföra ett test på hoppstjärtar

Stegen i testet kan sammanfattas på följande sätt:

Tid (dag) | Åtgärd

– 23 till – 26 | Förberedelse av synkron kultur med F. fimetaria

– 14 | Bered syntetisk jord (blandning av torra beståndsdelar). Kontrollera den syntetiska jordens pH och justera efter behov. Mät jordens maximala vattenhållningskapacitet.

– 9 till – 12 | Förberedelse av synkron kultur med F. candida.

– 2 till – 7 | Förhandsfukta jorden.

– 1 | Fördela juveniler i partier. Bered stamlösningar och tillsätt testkemikalie om lösningsmedel krävs.

0 | Bered stamlösningar och tillsätt testkemikalie om den är fast, vattenlöslig eller om ytapplicering krävs. Mät jordens pH och väg behållarna. Tillsätt föda. Introducera hoppstjärtar.

14 | Preliminärt test med F. fimetaria: Avsluta testet, ta ut djuren, mät jordens pH och vattenförlust (vikt). Definitiva test: Mät fukthalten, fyll på vatten och tillsätt 2–10 mg jäst.

21 | Definitivt test med F. fimetaria: Avsluta testet, ta ut djuren, mät jordens pH och vattenförlust (vikt). Preliminärt test med F. candida: Avsluta testet, ta ut djuren, mät jordens pH och vattenförlust (vikt).

28 | Definitivt test med F. candida: Avsluta testet, ta ut djuren, mät jordens pH och vattenförlust (vikt).

Tillägg 3

Vägledning om odling och synkronisering av F. fimetaria och F. candida

De tidpunkter och den varaktighet som anges i denna vägledning bör kontrolleras för varje särskild hoppstjärtsart för att se till att tidsplanen möjliggör tillräckligt synkroniserade juveniler. I princip bestämmer äggläggningen efter att adulterna överförts till färskt substrat samt äggkläckningen den lämpliga dagen för insamling av ägg och insamling av synkrona juveniler.

Det rekommenderas att man har en permanent stamodling med t.ex. 50 kärl/petriskålar. Stamodlingen ska hållas i gott skick genom att man utfodrar den varje vecka, vattnar den och avlägsnar gammalt foder och döda djur. Alltför få hoppstjärtar på substratet kan leda till hämning på grund av hög svamptillväxt. Om stamodlingen används alltför ofta för äggproduktion kan odlingen drabbas av utmattning. Tecken på utmattning är döda adulter och mögel på substratet. De återstående äggen från produktionen av synkrona djur kan användas för att vitalisera odlingen.

I en synkron kultur med F. fimetaria kan hanar särskiljas från honor främst genom storleken. Hanarna är betydligt mindre än honorna och hanarnas gånghastighet är snabbare än honornas. Ett korrekt val av kön kräver inte särskilt mycket träning och kan bekräftas genom en mikroskopisk undersökning av djurens genitalier (13).

1. Uppfödning

1.a. Beredning av odlingssubstrat

Odlingssubstratet är gips (kalciumsulfat) med aktivt träkol. Detta ger ett fuktigt substrat. Kolets uppgift är att absorbera spillgaser och exkret (14) (15). Olika former av träkol kan användas för att underlätta observationer av hoppstjärtarna. Pulvriserat träkol används till exempel för F. candida och F. fimetaria (vilket ger ett svart eller grått gips).

Substratets beståndsdelar:

20 ml aktivt träkol

200 ml destillerat vatten

200 ml gips

eller

50 g aktivt pulvriserat träkol

260–300 ml destillerat vatten

400 g gips.

Substratblandningen får stelna innan användning.

1.b. Avel

Hoppstjärtarna förvaras i behållare såsom petriskålar (90 mm × 13 mm) med botten täckt av ett 0,5 cm tjockt skikt av gips/kolsubstrat. De odlas vid 20 ± 1 °C med en ljus/mörkercykel på 12:12 timmar (400–800 lux). Behållarna hålls alltid fuktiga, och man måste se till att den relativa luftfuktigheten i behållarna är 100 %. Detta kan säkerställas genom förekomsten av fritt vatten i det porösa gipset, men man ska undvika att ett vattenskikt bildas på gipsytan. Vattenförluster kan förhindras genom att man tillhandahåller en fuktig omgivande luft. Alla döda individer bör avlägsnas från behållarna, liksom allt mögligt foder. För att stimulera äggproduktionen är det nödvändigt att överföra adulterna till petriskålar med nyberett gips/kolsubstrat.

1.c. Foderkälla

Torkad granulerad bagerijäst används som enda foderkälla för både F. candida och F. fimetaria. Färskt foder ges en eller två gånger i veckan, för att undvika att fodret angrips av mögel. Det placeras direkt på gipset i en liten hög. Mängden bagerijäst bör anpassas efter storleken på hoppstjärtpopulationen, men i regel räcker det med 2–15 mg.

2. Synkronisering

Testet bör utföras med synkroniserade djur så att man får enhetliga försöksdjur som befinner sig i samma stadium och har samma storlek. Dessutom gör synkroniseringen av F. fimetaria att man kan särskilja hanar och honor från och med tre veckors ålder på grund av sexuell dimorfism, dvs. skillnader i storleken. Det förfarande som beskrivs nedan är ett förslag till hur man kan få fram synkroniserade djur (de praktiska stegen är valfria).

2.a. Synkronisering.

Förbered behållare med ett 0,5 cm tjockt skikt med gips/kolsubstrat.

För över för äggläggningsändamål 150–200 adulta F. fimetaria och 50–100 F. candida från de 15–20 bästa stamodlingsbehållarna med 4–8 veckor gammalt substrat till de nya behållarna och utfodra med 15 mg bagerijäst. Undvik att få med juveniler tillsammans med adulter eftersom närvaron av juveniler kan hämma äggproduktionen.

Förvara odlingen i 20 ± 1 °C (medelvärdet ska vara 20 °C) med en ljus/mörker-cykel på 12/12 timmar (400–800 lux). Se till att det finns tillgång till färskt foder och att luften är vattenmättad. Foderbrist kan göra att djuren lämnar sin avföring på äggen, vilket leder till svampangrepp på äggen, och F. candida kan kannibalisera på sina egna ägg. Samla efter tio dagar försiktigt in äggen med en nål och en spatel och flytta över dem på äggpapper (små bitar filterpapper som doppats i gips/kolblandning) som placeras i en behållare med färskt gips/kolsubstrat. Ett fåtal jästkorn tillsätts till substratet för att locka till sig juvenilerna och få dem att lämna äggpappret. Det är viktigt att äggpappret och substratet är fuktiga, annars kommer äggen att torka ut. Som ett alternativ kan adulterna avlägsnas från de synkroniserade odlingslådorna efter att de har lagt ägg i två eller tre dagar.

Efter tre dagar har de flesta äggen på äggpappret kläckts, och en del juveniler kan finnas under äggpappret.

För att få juveniler av samma ålder avlägsnar man äggpappret med ägg som fortfarande inte har kläckts från petriskålen med en pincett. Juvenilerna, som nu är 0–3 dagar gamla, blir kvar i skålen och utfodras med bagerijäst. Okläckta ägg kastas bort.

Ägg och kläckta juveniler odlas på samma sätt som adulter. I synnerhet när det gäller F. fimetaria bör följande åtgärder vidtas: se till att det finns tillräckligt med färskt foder, avlägsna gammalt mögligt foder, fördela efter en vecka juvenilerna i nya petriskålar om densiteten är högre än 200.

2.b. Hanteringen av hoppstjärtar vid testets inledning

Samla in de 9–12 dagar gamla F. candida eller de 23–26 dagar gamla F. fimetaria, t.ex. genom uppsugning, och överför dem till en liten behållare med fuktigt gips/kolsubstrat. Deras fysiska tillstånd kontrolleras under ett binokulärt mikroskop (skadade djur kastas bort). Alla åtgärder bör vidtas samtidigt som hoppstjärtarna hålls i en fuktig atmosfär för att undvika stress på grund av torka, t.ex. genom att man använder fuktade ytor osv.

Vänd behållaren upp och ner och knacka på den för att överföra hoppstjärtarna till jorden. Statisk elektricitet bör neutraliseras, annars kan djuren komma att flyga ut i luften, eller fastna på testbehållarens sidor och torka ut. En joniserare eller en fuktig trasa under behållaren kan användas för neutralisering.

Fodret bör fördelas över hela jordytan och inte bara i en enda klump.

Under transporten och under testperioden bör man undvika att knacka på eller på annat sätt fysiskt rubba testbehållarna, eftersom detta kan öka jordens sammanpackning och försvåra interaktionen mellan hoppstjärtarna.

3. Alternativa hoppstjärtarter

Andra hoppstjärtarter kan väljas för testning enligt denna testmetod, t.ex. Proisotoma minuta, Isotoma viridis, Isotoma anglicana, Orchesella cincta, Sinella curviseta, Paronychiurus kimi, Orthonychiurus folsomi, Mesaphorura macrochaeta. Ett antal förutsättningar bör vara uppfyllda innan man använder alternativa arter:

De bör vara otvetydigt identifierbara.

Motivering för valet av art bör anges.

Det bör säkerställas att reproduktionsbiologin ingår i testfasen så att den utgör ett potentiellt mål under exponeringen.

Deras livshistoria bör vara känd: ålder vid könsmognad, äggutvecklingens varaktighet och stadier som utsätts för exponering.

Optimala förutsättningar för tillväxt och reproduktion bör tillhandahållas genom testsubstratet och fodret.

Variabiliteten bör vara tillräckligt låg för att en exakt och tillförlitlig uppskattning av toxiciteten ska kunna göras.

Tillägg 4

Insamling och räkning av djur

1. Två insamlingsmetoder kan användas.

1.a. Första metoden: En extraktor med kontrollerad temperaturökning baserad på MacFadyens principer kan användas (1). Värmen kommer från ett värmeelement överst i extraktionslådan (som regleras med hjälp av en termistor som placeras på ytan av jordprovet). Temperaturen i den kylda vätskan som omger insamlingskärlet regleras med hjälp av en termistor som sitter på insamlingskärlets yta (som placeras under jordprovet). Termistorerna är kopplade till en programmerbar kontrollenhet som höjer temperaturen enligt en förprogrammerad tidsplan. Djuren samlas upp i den kylda insamlingslådan (2 °C) med ett bottenskikt av gips/kol. Extraktionen inleds vid 25 °C, temperaturen ökas automatiskt varje tolvtimmarsperiod med 5 °C, och extraktionen varar sammanlagt 48 timmar. Efter tolv timmar vid 40 °C avslutas extraktionen.

1.b. Andra metoden: Efter den experimentella inkubationstiden bedöms antalet juvenila hoppstjärtar med hjälp av flotation. För detta ändamål utförs testet i kärl med en volym på ca 250 ml. Vid testets slut tillsätts ca 200 ml destillerat vatten. Jorden rörs försiktigt om med en liten pensel så att hoppstjärtarna flyter upp till vattenytan. En liten mängd, ca 0,5 ml, svart Kentmeres fotografiska färgämne kan tillsättas vattnet för att underlätta räkningen genom att öka kontrasten mellan vattnet och de vita hoppstjärtarna. Färgämnet inte är giftigt för hoppstjärtar.

2. Räkning:

Räkning av antalet djur kan utföras med blotta ögat eller under ljusmikroskop med hjälp av ett rutnät som placeras över flotationskärlet eller genom att fotografera ytan i varje kärl och senare att räkna hoppstjärtarna på uppförstorade foton eller projicerade diabilder. Räkningarna kan även utföras med hjälp av digitala bildbehandlingstekniker (12). Alla tekniker bör valideras.

Tillägg 5

Bestämning av jordens maximala vattenhållningskapacitet (WHC)

Följande metod för bestämning av den maximala vattenhållningskapaciteten (WHC) har konstaterats vara lämplig. Den beskrivs i bilaga C till ISO DIS 11268-2 (Markundersökningar – Föroreningars effekt på daggmaskar (Eisenia fetida). Del 2: Bestämning av effekter på reproduktion).

Samla in en fastställd kvantitet (t.ex. 5 g) testjordsubstrat med hjälp av en lämplig anordning (jordborr med rör osv.). Täck rörets botten med bit vått filterpapper och placera det sedan i en ställning i ett vattenbad. Röret bör gradvis nedsänkas i vattnet tills vattnet står över jordytan. Det bör därefter lämnas i vattnet i cirka tre timmar. Eftersom allt vatten som absorberas av jordens kapillärer inte kan hållas kvar bör jordprovet dräneras i två timmar genom att röret placeras på en bädd av mycket fuktig finmald kvartssand i ett slutet kärl (för att förhindra uttorkning). Provet bör sedan torkas till en konstant vikt vid 105 °C och vägas. Vattenhållningskapaciteten (WHC) ska beräknas enligt följande:

där

Tillägg 6

Bestämning av jordens pH-värde

Följande metod för bestämning av pH-värdet i jord bygger på beskrivningen i ISO DIS 10390: Markundersökningar – Bestämning av pH.

Tillägg 1

Definitioner

I denna testmetod gäller följande definitioner:

Tillägg 2

Rekommendationer för odling av Chironomus riparius

1. Chironomus-larver kan odlas i kristalliseringskärl eller större behållare. Fin kvartssand sprids ut i ett tunt skikt på cirka 5–10 mm på behållarens botten. Kiselgur (t.ex. Merck, Art. 8117) har visat sig vara ett lämpligt substrat (det räcker med ett tunt lager på några mm). Lämpligt vatten tillsätts sedan till ett djup på flera cm. Vattennivåerna bör fyllas på efter behov för att ersätta avdunstat vatten och förebygga uttorkning. Vattnet kan ersättas vid behov. Skonsam luftning bör tillhandahållas. De kärl som innehåller larver bör förvaras i en lämplig behållare som hindrar kläckta exemplar från att rymma. Behållaren bör vara tillräckligt stor för att de vuxna exemplaren ska kunna svärma, annars kan kopulationen utebli (minimum är cirka 30 × 30 × 30 cm).

2. Behållarna ska hållas i rumstemperatur eller i ett tempererat utrymme vid 20 ± 2 °C med en fotoperiod på 16 timmar ljus (intensitet ca 1000 lux) och 8 timmar mörker. Det har rapporterats att en luftfuktighet på under 60 % relativ luftfuktighet kan hämma reproduktionen.

Utspädningsvatten

3. Allt lämpligt naturligt eller syntetiskt vatten kan användas. Ofta används källvatten, avklorerat kranvatten och artificiella medier (t.ex. Elendt M4 eller M7, se nedan). Vattnet måste luftas före användningen. Vid behov kan odlingsvattnet förnyas genom att man försiktigt häller eller med en hävert tappar av använt vatten från odlingskärlen utan att förstöra larvrören.

Utfodring av larver

4. Chironomus-larverna ges fiskfoder i flingform (Tetra Min ®, Tetra Phyll ® eller motsvarande patenterat märke), cirka 250 mg per kärl och dag. Detta kan ges som torrt malet pulver eller som en suspension i vatten: tillsätt 1,0 g flingfoder i 20 ml utspädningsvatten och blanda till en homogen blandning. Beredningen kan ges med en dosering på cirka 5ml per kärl och dag (skaka om före användning). Äldre larver kan få en större dos.

5. Utfodringen justeras i enlighet med vattenkvaliteten. Om odlingsmediet blir grumligt bör dosen sänkas. Foderdoseringen måste övervakas noggrant. För liten mängd leder till att larverna emigrerar mot vattenkolumnen och för stor mängd leder till ökad mikrobiell aktivitet och lägre syrekoncentrationer. Båda omständigheterna kan leda till minskad tillväxt.

6. Även celler av vissa grönalger (t.ex. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) kan tillsättas när nya odlingskärl inrättas.

Utfodring av vuxna exemplar

7. Vissa testutövare har föreslagit att bomullskompresser indränkta i mättad sackaroslösning kan användas som foder för vuxna exemplar.

Kläckning

8. Vid 20 ± 2 °C börjar de vuxna exemplaren kläckas i odlingskärlen efter cirka 13–15 dagar. Hanarna är lätta att känna igen på sina fjäderantenner och smala kroppar.

Äggmassor

9. När vuxna exemplar finns i odlingsbehållaren bör alla odlingskärl kontrolleras tre gånger per vecka för att se om geléartade äggmassor har lagts. Om sådana upptäcks, bör de försiktigt avlägsnas. Äggmassorna överförs till ett litet kärl som innehåller ett prov av odlingsvattnet. De används sedan för att starta nya odlingskärl (t.ex. 2–4 äggmassor per kärl) eller för toxicitetstest.

10. Första stadiets larver bör kläckas efter 2–3 dagar.

Inrättning av nya odlingskärl

11. När odlingarna är etablerade bör det vara möjligt att inrätta ett nytt odlingskärl för larver varje vecka eller med längre intervall beroende på testningskraven. Äldre kärl avlägsnas efter att de vuxna myggorna har kläckts. På detta sätt får man en regelbunden tillgång till vuxna exemplar med minimalt behov av skötsel.

Beredning av testlösningarna M4 och M7

12. M4-mediet har beskrivits i Elendt (1990). M7-mediet bereds på samma sätt som M4-mediet med undantag för de ämnen som anges i tabell 1, för vilka koncentrationerna är fyra gånger lägre i M7 jämfört med M4. Testlösningen ska inte beredas enligt Elendt och Bias (1990) eftersom de koncentrationer av NaSiO3 · 5H2O, NaNO3, KH2PO4 och K2HPO4 som anges för beredning av stamlösningar inte är lämpliga.

Beredning av M7-medium

13. Varje stamlösning (I) bereds för sig och en kombinerad stamlösning (II) bereds av dessa stamlösningar (I) (se tabell 1). Femtio ml av den kombinerade stamlösningen (II) och de mängder av varje stamlösning med makronäring som anges i tabell 2 samt avjonat vatten tillsätts upp till 1 liter för att bereda M7-mediet. En stamlösning med vitaminer bereds genom att man tillsätter tre vitaminer till avjonat vatten enligt tabell 3, och 0,1 ml av den kombinerade vitaminstamlösningen tillsätts till det slutliga M7-mediet strax före användningen. Vitaminstamlösningen förvaras djupfryst i små alikvoter. Mediet luftas och stabiliseras.

Stamlösningar (I) | Mängd (mg) som fylls upp till 1 liter med avjonat vatten | För den kombinerade stamlösningen (II): blanda följande mängder (ml) stamlösning (I) och fyll upp till 1 liter med avjonat vatten | Slutliga koncentrationer i testlösningarna (mg/l)

M4 | M7 | M4 | M7

H3BO3 | 57190 | 1,0 | 0,25 | 2,86 | 0,715

MnCl2 · 4H2O | 7210 | 1,0 | 0,25 | 0,361 | 0,090

LiCl | 6120 | 1,0 | 0,25 | 0,306 | 0,077

RbCl | 1420 | 1,0 | 0,25 | 0,071 | 0,018

SrCl2 · 6H2O | 3040 | 1,0 | 0,25 | 0,152 | 0,038

NaBr | 320 | 1,0 | 0,25 | 0,016 | 0,004

Na2MoO4 · 2H2O | 1260 | 1,0 | 0,25 | 0,063 | 0,016

CuCl2 · 2H2O | 335 | 1,0 | 0,25 | 0,017 | 0,004

ZnCl2 | 260 | 1,0 | 1,0 | 0,013 | 0,013

CaCl2 · 6H2O | 200 | 1,0 | 1,0 | 0,010 | 0,010

KI | 65 | 1,0 | 1,0 | 0,0033 | 0,0033

Na2SeO3 | 43,8 | 1,0 | 1,0 | 0,0022 | 0,0022

NH4VO3 | 11,5 | 1,0 | 1,0 | 0,00058 | 0,00058

Na2EDTA · 2H2O | 5000 | 20,0 | 5,0 | 2,5 | 0,625

FeSO4 · 7H2O | 1991 | 20,0 | 5,0 | 1,0 | 0,249

Mängd som fylls upp till 1 liter med avjonat vatten (mg) | Mängd stamlösning med makronäringsämnen som tillsätts för att bereda medium M4 och M7 (ml/l) | Slutliga koncentrationer i testlösningarna M4 och M7 (mg/l)

CaCl2 · 2H2O | 293800 | 1,0 | 293,8

MgSO4 · 7H2O | 246600 | 0,5 | 123,3

KCl | 58000 | 0,1 | 5,8

NaHCO3 | 64800 | 1,0 | 64,8

NaSiO3 · 9H2O | 50000 | 0,2 | 10,0

NaNO3 | 2740 | 0,1 | 0,274

KH2PO4 | 1430 | 0,1 | 0,143

K2HPO4 | 1840 | 0,1 | 0,184

Mängd som fylls upp till 1 liter med avjonat vatten (mg) | Mängd stamlösning med vitaminer som tillsätts för att bereda medium M4 och M7 (ml/l) | Slutliga koncentrationer i testlösningarna M4 och M7 (mg/l)

Tiaminhydroklorid | 750 | 0,1 | 0,075

Cyanokobalamin (B12) | 10 | 0,1 | 0,0010

Biotin | 7,5 | 0,1 | 0,00075

HÄNVISNINGAR

BBA (1995), Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system, red. M. Streloke och H. Köpp. Berlin.

Elendt, B. P. (1990), Selenium deficiency in Crustacea, Protoplasma, 154: 25–33.

Elendt, B. P. och W.-R. Bias (1990), Trace nutrient deficiency in Daphnia magna cultured in standard medium for toxicity testing, Effects on the optimisation of culture conditions on life history parameters of D. magna, Water Research, 24: 1157–1167.

1 Dessa ämnen skiljer sig åt i M4 och M7, såsom anges ovan.

2 Dessa lösningar bereds separat, blandas därefter och autoklaveras omedelbart.

Tillägg 3

Beredning av syntetiskt sediment

SEDIMENTSAMMANSÄTTNING

Syntetiskt sediment ska ha följande sammansättning:

Beståndsdel | Egenskaper | % av sedimentets torrvikt

Torv | Vitmosstorv (Sphagnum), så nära pH 5,5–6,0 som möjligt, utan synliga växtrester, finfördelad (partikelstorlek ≤ 1 mm) och lufttorkad | 4–5

Kvartssand | Partikelstorlek: > 50 % av partiklarna bör vara av storleken 50–200 μm | 75–76

Kaolinlera | Kaolinithalt ≥ 30 % | 20

Organiskt kol | Justeras genom tillsats av torv och sand | 2 (± 0,5)

Kalcium-karbonat | CaCO3, i pulverform, kemiskt rent | 0,05–0,1

Vatten | Konduktivitet ≤ 10 μS/cm | 30–50

BEREDNING

FÖRVARING

Det syntetiska sedimentets torra beståndsdelar kan lagras i ett torrt och svalt utrymme vid rumstemperatur. Berett (vått) sediment ska inte lagras innan det används i ett test. Det bör användas omedelbart efter den sju dagar långa konditioneringsperioden, som är sista steget i beredningen.

HÄNVISNINGAR

OECD (1984), Earthworm, Acute Toxicity Test, Test Guideline No. 207, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris.

Meller, M., Egeler, P., Roembke, J., Schallnass, H., Nagel, R. och B. Streit (1998), Short-term toxicity of lindane, hexachlorobenzene and copper sulfate on tubificid sludgeworms (Oligochaeta) in artificial media, Ecotox. Environ. Safety, 39: 10–20.

Tillägg 4

Ett godtagbart utspädningsvattens kemiska egenskaper

BESTÅNDSDEL | KONCENTRATIONER

Partiklar | < 20 mg/l

Halt av organiskt kol | < 2 mg/l

Ojoniserad ammoniak | < 1 μg/l

Hårdhet som CaCO3 | < 400 mg/l

Resterande mängd klor | < 10 μg/l

Total mängd bekämpningsmedel som innehåller organiska fosforföreningar | < 50 ng/l

Total mängd bekämpningsmedel som innehåller organiska klorföreningar plus polyklorerade bifenyler | < 50 ng/l

Total mängd organiskt klor | < 25 ng/l

1 Om man misstänker växelverkan mellan hårdhetsjoner och testkemikalien bör dock vatten med lägre hårdhet användas (och därmed bör Elendt Medium M4 inte användas i detta läge).

Tillägg 5

Riktlinjer för testets genomförande

Exempel på en odlingsbehållare:

Exempel på ett testkärl:

Exempel på en exhauster som används för att insamla vuxna myggor (pilarna anger flödesriktningen):

Schematisk presentation av ett livscykeltest:

Tillägg 1

Förkortningar och definitioner

Tillägg 2

Försöksbetingelser för testet på fiskars könsutveckling (sötvattensarter)

1. Rekommenderade arter | Japansk risfisk (Oryzias latipes) | Sebrafisk (Danio rerio) | Storspigg (Gasterostreus aculeatus)

2. Testtyp | Genomflödestest eller semistatiskt test | Genomflödestest eller semistatiskt test | Genomflödestest eller semistatiskt test

3. Vattentemperatur | 25 ± 2 °C | 27 ± 2 °C | 20 ± 2 °C

4. Belysningskvalitet | Fluorescerande lampor (brett spektrum) | Fluorescerande lampor (brett spektrum) | Fluorescerande lampor (brett spektrum)

5. Ljusintensitet | 10–20 μE/m2/s, 540–1080 lux, eller 50–100 ft-c (omgivande ljusnivåer i laboratoriet) | 10–20 μE/m2/s, 540–1080 lux, eller 50–100 ft-c (omgivande ljusnivåer i laboratoriet) | 10–20 μE/m2/s, 540–1080 lux, eller 50–100 ft-c (omgivande ljusnivåer i laboratoriet)

6. Fotoperiod | 12–16 timmar ljus, 8–12 timmar mörker | 12–16 timmar ljus, 8–12 timmar mörker | 16 timmar ljus, 8 timmar mörker

7. Behållarens minsta storlek | Enskilda behållare bör innehålla minst 7 liter vatten | Enskilda behållare bör innehålla minst 7 liter vatten | Enskilda behållare bör innehålla minst 7 liter vatten

8. Volymutbyte av testlösningar | Minst fem per dag | Minst fem per dag | Minst fem per dag

9. Testorganismernas ålder i början av exponeringen | Nyligen befruktade ägg (tidigt blastulastadium) | Nyligen befruktade ägg (tidigt blastulastadium) | Nyligen befruktade ägg

10. Antal ägg per testkärl | Minst 120 | Minst 120 | Minst 120

11. Antal testkärl | Minst tre (plus lämpliga kontroller) | Minst tre (plus lämpliga kontroller) | Minst tre (plus lämpliga kontroller)

12. Antal replikat per testkärl | Minst fyra (om man inte använder kvadratrotsfördelning till kontrollerna) | Minst fyra (om man inte använder kvadratrotsfördelning till kontrollerna) | Minst fyra (om man inte använder kvadratrotsfördelning till kontrollerna)

13. Utfodring | Levande Artemia, frysta vuxna saltkräftor, flingfoder, etc. Det rekommenderas att man utfodrar två gånger dagligen | Särskilt yngelfoder, levande Artemia, frysta vuxna saltkräftor, flingfoder, etc. Det rekommenderas att man utfodrar två gånger dagligen | Levande Artemia, frysta vuxna saltkräftor, flingfoder, etc. Det rekommenderas att man utfodrar två gånger dagligen

14. Luftning | Ingen såvida inte koncentrationen av löst syre sjunker under 60 % mättnad | Ingen såvida inte koncentrationen av löst syre sjunker under 60 % mättnad | Ingen såvida inte koncentrationen av löst syre sjunker under 70 % mättnad

15. Utspädningsvatten | Rent yt- eller brunnsvatten eller rekonstituerat vatten | Rent yt- eller brunnsvatten eller rekonstituerat vatten | Rent yt- eller brunnsvatten eller rekonstituerat vatten

16. Den kemiska exponeringens varaktighet | 60 dagar efter kläckningen | 60 dagar efter kläckningen | 60 dagar efter kläckningen

17. Biologiska endpoints | Kläckningsframgång, överlevnad, makromorfologi, VTG könskörtlarnas histologi, genetiskt kön könsfördelning | Kläckningsframgång, överlevnad makromorfologi, VTG könskörtlarnas histologi, könsfördelning | Kläckningsframgång, överlevnad makromorfologi, VTG könskörtlarnas histologi, könsfördelning

18. Testets godtagbarhetskriterier för sammanlagda kontrollreplikat | Kläckningsframgång > 80 % | Kläckningsframgång > 80 % | Kläckningsframgång > 80 %

Överlevnad efter kläckningen ≥ 70 % | Överlevnad efter kläckningen ≥ 70 % | Överlevnad efter kläckningen ≥ 70 %

Tillväxt (den avtorkade fiskens våtvikt) > 150 mg | Tillväxt (den avtorkade fiskens våtvikt) > 75 mg | Tillväxt (den avtorkade fiskens våtvikt) > 120 mg

Längd (normallängd) > 20 mm | Längd (normallängd) > 14 mm | Längd (normallängd) > 20 mm

Könsfördelning (% hanar och honor) 30–70 % | Könsfördelning (% hanar och honor) 30–70 % | Könsfördelning (% hanar och honor) 30–70 %

Tillägg 3

Ett godtagbart utspädningsvattens kemiska egenskaper

BESTÅNDSDEL | KONCENTRATION

Partiklar | < 20 mg/l

Halt av organiskt kol | < 2 mg/l

Ojoniserad ammoniak | < 1 μg/l

Resterande mängd klor | < 10 μg/l

Total mängd bekämpningsmedel som innehåller organiska fosforföreningar | < 50 ng/l

Total mängd bekämpningsmedel som innehåller organiska klorföreningar plus polyklorerade bifenyler | < 50 ng/l

Total mängd organiskt klor | < 25 ng/l

Tillägg 4

Från testmetod c.14 /Vägledning om testkoncentrationer

Kolumn (antal koncentrationer mellan 100 och 10 eller mellan 10 och 1)

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7

100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100

32 | 46 | 56 | 63 | 68 | 72 | 75

10 | 22 | 32 | 40 | 46 | 52 | 56

3,2 | 10 | 18 | 25 | 32 | 37 | 42

1,0 | 4,6 | 10 | 16 | 22 | 27 | 32

2,2 | 5,6 | 10 | 15 | 19 | 24

1,0 | 3,2 | 6,3 | 10 | 14 | 18

1,8 | 4,0 | 6,8 | 10 | 13

1,0 | 2,5 | 4,6 | 7,2 | 10

1,6 | 3,2 | 5,2 | 7,5

1,0 | 2,2 | 3,7 | 5,6

1,5 | 2,7 | 4,2

1,0 | 1,9 | 3,2

1,4 | 2,4

1,0 | 1,8

1,3

1,0

1 En serie med tre (eller flera) på varandra följande koncentrationer kan väljas ur en kolumn. Mittpunkterna mellan koncentrationerna i kolumn (x) finns i kolumn (2x + 1). De angivna värdena kan representera koncentrationer uttryckta som procenthalt per volym eller vikt (mg/l eller μg/l). Värdena kan multipliceras eller divideras med en eller flera tiopotenser, beroende på vad som är lämpligt. Kolumn 1 kan användas om det råder betydande osäkerhet om toxicitetsnivån.

Tillägg 5

Vägledning för homogenisering av huvud och stjärt från unga exemplar av sebrafisk, knölskallelöja, storspigg och japansk risfisk

Syftet med detta avsnitt är att beskriva de förfaranden som föregår bestämningen av VTG-koncentrationen. Andra förfaranden som leder till en jämförbar bestämning av VTG kan också användas. Alternativt kan man fastställa VTG-koncentrationen i blodplasma eller lever i stället för i huvud/stjärthomogenat.

Förfarande

1. Fiskarna bedövas eller avlivas i enlighet med testbeskrivningen.

2. Huvudet och stjärten skärs av i enlighet med testbeskrivningen. Obs! Alla dissektionsinstrument och skärbrädan bör sköljas och rengöras ordentligt (t.ex. med 96 % etanol) mellan hanteringen av varje enskild fisk att förhindra VTG-förorening från honor eller inducerade hanar till oinducerade hanar.

3. Den sammanlagda vikten av huvud och stjärt från varje fisk mäts till närmaste mg.

4. Efter vägning placeras delarna i lämpliga rör (t.ex. 1,5 ml eppendorfrör) och fryses vid – 80 °C tills homogeniseringen, eller homogeniseras direkt på is med två mortelstötar av plast. (Andra metoder kan användas om de utförs på is och resultatet är en homogen massa). Obs! Rören ska numreras noggrant så att fiskarnas huvud och stjärt kan hänföras till deras respektive kroppar, som används för histologisk undersökning av könskörtlarna.

5. När en homogen massa erhållits tillsätts iskall homogeniseringsbuffertlösning med en mängd på 4–10 gånger vävnadens vikt (lägg märke till utspädningen). Fortsätt att arbeta med mortelstötarna tills blandningen är homogen. Viktig anmärkning: Nya mortelstötar används för varje fisk.

6. Proven läggs på is tills centrifugeringen vid 4 °C och 50000 g i 30 minuter.

7. Använd en pipett för att dosera ut portioner på 20–50 μl (lägg märke till mängden) supernatant i minst två rör genom att doppa pipettens spets under fettlagret på ytan och försiktigt suga upp supernatanten utan att få med fragment av fett eller små bitar.

8. Rören förvaras vid – 80 °C fram till användningen.

Anmärkning: Buffertlösningen för homogenisering bör användas samma dag som den beretts. Lägg den på is under användningen.

1 Buffertlösning för homogenisering: 50 mM Tris-HCl pH 7,4; 1 % proteashämmarblandning (Sigma): 12 ml Tris-HCl pH 7,4 + 120 μl proteashämmarblandning (eller liknande proteashämmarblandningar). TRIS: TRIS-ULTRA PURE (ICN) Proteashämmarblandning: Från Sigma (för däggdjursvävnader) produkt nr P 8340.

Tillägg 6

Vägledning för beräkning av vitellogenin för huvud/stjärthomogenat av sebrafisk (Danio rerio) (modifierat från Holbech m.fl., 2001). Andra förfaranden som använder homologa antikroppar och standarder kan användas

1. Mikrotiterplattor (certifierade Maxisorp F96, Nunc, Roskilde Danmark) som i förväg belagts med 5 μg/ml anti-sebrafisk lipovitellin-IgG tinas upp och tvättas tre gånger med en tvättbuffert (*).

2. Renad sebrafisk-vitellogenin-standardlösning späds ut i omgångar till 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10 och 20 ng/ml i en utspädningsbuffert (**), och proven späds ut minst 200 gånger (för att förhindra matriseffekter) i en utspädningsbuffert och appliceras på plattorna. En testkontroll appliceras i två exemplar. 150 μl tillsätts i varje brunn. Standarderna appliceras i två exemplar och proverna i tre exemplar. Inkubera över natten vid 4 °C i en skakapparat.

3. Plattorna tvättas fem gånger med en tvättbuffert (*)

4. HRP bunden till en dextrankedja (t.ex. AMDEX A/S, Danmark) och konjugerade antikroppar späds i en tvättbuffert. Den faktiska utspädningen varierar beroende på parti och ålder. 150 μl tillsätts i varje brunn och plattorna inkuberas i en timme i rumstemperatur i en skakapparat.

5. Plattorna tvättas fem gånger med tvättbuffert (*) och plattornas botten rengörs noggrant med etanol.

6. 150 μl TMB plus (***) tillsätts i varje brunn. Skydda plattan mot ljus med aluminiumfolie, och observera färgutvecklingen i en skakapparat.

7. När standardkurvan är fullt utvecklad hejdas enzymaktiviteten genom tillsats av 150 μl 0,2 M H2SO4 i varje brunn.

8. Absorbansen mäts vid 450 nm (t.ex. med en Molecular Devices Thermomax läsare för mikrotiterplattor). Erhållna data analyseras med lämplig programvara (t.ex. Softmax).

(*) Tvättbuffert: PBS-stamlösning (****) 500,0 ml BSA 5,0 g Tween 20 5,0 ml Justera pH till 7,3 och fyll upp till 5 l med Millipore H2O. Förvara vid 4 °C.

(**) Utspädningsbuffert: PBS-stamlösning (****) 100,0 ml BSA 3,0 g Tween 20 1,0 ml Justera pH till 7,3 och fyll upp till 1 l med Millipore H2O. Förvara vid 4 °C.

(***) TMB plus är ett bruksfärdigt substrat framställt av KemEnTec (Danmark). Det är ljuskänsligt. Förvara vid 4 °C.

(****) PBS-stamlösning NaCl 160,0 g KH2PO4 4,0 g Na2HPO4 · 2H2O 26,6 g KCl 4,0 g Justera pH till 6,8 och fyll upp till 2 l med Millipore H2O. Förvara vid rumstemperatur.

1 Battelle AP4.6.04 (1,18 mg/ml (AAA)), renad enligt Denslow, N. D., Chow, M. C., Kroll, K. J., Green, L. (1999). Vitellogenin som biomarkör för exponering för östrogen eller östrogenimiterande ämnen. Ecotoxicology 8: 385–398.

Tillägg 7

Vägledning för beredning av vävnadspreparat för könsbestämning och stadiebestämning av könskörtlar

Syftet med detta avsnitt är att beskriva de förfaranden som föregår utvärderingen av histologiska preparat. Andra förfaranden som leder liknande resultat för könsbestämningen och stadiebestämningen av könskörtlarna kan också användas.

Med några få undantag är dessa förfaranden är likartade för japansk risfisk (JMD) och sebrafisk (ZF).

Avlivning, obduktion och fixering av vävnader

Mål:

1 Sörja för human avlivning av fisk.

2 Erhålla nödvändiga data rörande kroppsvikt och kroppsmätningar.

3 Utvärdera sekundära könskaraktärer.

4 Dissekera vävnader för VTG-analys.

5 Fixering av könskörtlarna.

Förfaranden:

1 Fiskarna bör avlivas omedelbart innan obduktionen. Om det inte står flera prosektorer till förfogande bör därför inte flera fiskar avlivas samtidigt.

2 Med hjälp av en liten håv avlägsnas fisken från testbehållaren och förs till obduktionsplatsen i transportbehållaren.

3 Fisken släpps ut i avlivningslösningen. Fisken avlägsnas från lösningen när andningen upphör och fisken inte reagerar på extern retning.

4 Fiskens våtvikt fastställs.

5 För beredning av vävnader för VTG-analys kan fisken kan placeras på en korkplatta på objektbordet i ett dissektionsmikroskop.

6 Prov för VTG-analys placeras i eppendorfrör och fryses omedelbart i flytande kväve.

7 Kroppen, inklusive könskörtlar, placeras i en på förhand märkt vävnadskassett av plast som överförs till Davidsons eller Bouins fixativ. Fixativets volym ska vara minst tio gånger den uppskattade vävnadsvolymen. Fixeringsbehållaren omskakas varsamt i fem sekunder för att lösgöra luftbubblor från kassetten.

8 a. Alla vävnader blir kvar i Davidsons fixativ över natten, och överförs sedan till separata behållare med 10 % neutral buffrad formalin följande dag. Behållare med kassetter omskakas varsamt i fem sekunder för att säkerställa tillräcklig infiltrering av formalinet i kassetterna. b. Vävnaderna blir kvar i Bouins fixativ i 24 timmar och överförs därefter till 70 % etanol.

Bearbetning av vävnader

Mål:

1 Torka ut vävnaden för tillräcklig infiltrering av paraffin.

2 Impregnera vävnaden med paraffin för att bevara vävnadsintegriteten och skapa en fast yta för mikrotomi.

Förfaranden:

3 Märkta vävnadskassetter avlägsnas från lagringen i formalin/etanol och kassetterna placeras i beredningskorgarna. Beredningskorgen fylls i vävnadsberedaren.

4 Tidsplanen för beredningen väljs ut.

5 Efter det att vävnadsberedaren har slutfört behandlingscykeln kan korgarna överföras till inbäddningsstationen.

Inbäddning

Mål:

Att korrekt justera provexemplarets position i stelnat paraffin för mikrotomi.

Förfaranden:

1 Korgen med kassetter avlägsnas från beredaren och sänks ned i den paraffinfyllda främre behållaren i inbäddningsstationens värmekonsol, eller så flyttas kassetterna till en separat paraffinvärmare.

2 Den första kassetten som ska bäddas in avlägsnas från den främre behållaren i inbäddningsstationens värmekonsol eller från paraffinvärmaren. Kassettens lock avlägsnas och kasseras, och kassettens etikett kontrolleras mot djurregistret för att lösa eventuella problem med avvikelser innan inbäddningen.

3 En lagom stor inbäddningsform väljs ut.

4 Formen hålls under fördelningskonsolens påfyllningspip och fylls med flytande paraffin.

5 Provexemplaret avlägsnas från kassetten och placeras i det flytande paraffinet i formen. Detta ska upprepas med 4–8 exemplar för varje paraffinform. De enskilda fiskarnas position markeras genom att fisk nr 1 placeras 180 grader mot fisk nr 2–4/8.

6 Ytterligare paraffin tillsätts för att täcka provexemplaret.

7 Formen och kassettens underdel placeras på kylplattan i kryokonsolen.

8 Efter att paraffinet har stelnat avlägsnas blocket (dvs. det stelnade paraffinet innehållande vävnaderna och kassettens underdel) från formen.

Mikrotomi

Mål:

Skära ut och montera histologiska preparat för färgning.

Förfaranden:

1 Den inledande fasen av mikrotomin, som går under benämningen skiktning, utförs enligt följande:

2 Nästa fas av mikrotomin är den slutliga uppdelningen och monteringen av vävnadspreparaten på objektglasen. Dessa förfaranden genomförs på följande sätt:

Färgning, täckning av preparaten med täckglas, märkning av objektglasen

Mål:

Färga preparaten för histopatologisk undersökning

Permanent försegla de monterade och färgade vävnaderna.

Permanent identifiera färgade preparat på ett sätt som möjliggör fullständig spårbarhet.

Förfaranden:

1 Färgning

2 Täckning av preparaten med täckglas

3 Märkning

Tillägg 8

Statistiskt flödesschema för vitellogeninanalys

Replikatmedelvärden normala & homogena

Dunns test på replikat- medelvärden

>=4 replikat per koncentration

<=3 replikat per koncentration

Tamhane-Dunnetts test

Replikatmedelvärden ej normala eller ej homogena

Dunns eller Mann-Whitneys test på replikat- medelvärden

Replikatmedelvärden normalfördelade

Tamhane-Dunnetts test på nästlad ANOVA

Dunnetts test på nästlad ANOVA

Dunnetts test

Variansstabiliserande omvandling?

Varianser olika

Varianser lika

Nej

Step-downtrendtest på replikatmedelvärden

<=3 replikat per koncentration

Variansstabiliserande omvandling?

Dunns eller Mann-Whitneys test

Normaliserande omvandling?

Nästlad ANOVA ej normal

Nästlad ANOVA normal

Monoton

Ävgor om dos-responsen är monoton

Uteslut vattenkontrollen

Dunns test

>=4 replikat per koncentration

Jonckheeres test (step-down)

Jonckheeres eller Williams test (step-down)

Replikatmedelvärden ej normalfördelade

Ej monoton

Kombinera kontrollerna, behåll undergrupperna

Jämför controller med Wilcoxon-test eller t-test. Skijer sig kontrollerna åt?

Används både lösningsmedelskontroller och kontroller utan lösningsmedel?

Nej

Statistiskt flödesschema för analys av könsfördelningen

Använd step-down-grundat Jonckheere-Terpstras test (+) för bestämning av NOEC

Dunns eller Mann-Whitneys U-test m./Bonferroni-Holm-justering för bestämning av NOEC

Använd Dunnetts test om varianserna är homogena (*), annars Tamhane-Dunnetts (T3) test för bestämning av NOEC

Är data normalfördelade? (*)

Är erhållna data förenliga med monoton dos-respons?

(‡) Eller något annat överenskommet kontrollurval

(*) Efter arcsin-kvadratrotstransformation

(+) Med färre ån fem testenheter per behandling bör om möjligt exakta J-T:s eller M-W:s test användas

Nej

Kombinera kontrollerna

Uteslut vattenkontrollen (‡)

Jämför kontrollerna med t-test. Skiljer sig kontrollerna åt?

Nej

Används lösningsmedel?

Tillägg 9

Vägledning för vävnadsprovtagning för bestämning av genetiskt kön och för bestämning av genetiskt kön med PCR-metoden

Vävnadsprovtagning, beredning och lagring före bestämning av det genetiska könet hos risfiskar med PCR-metoden (utarbetad av Laboratory for Aquatic Organisms hos Bayer CropScience AG)

1. Analfenan eller ryggfenan klipps av från varje fisk med en fin sax och placeras i ett rör med 100 μl extraktionsbuffert 1 (för information om beredning av buffertlösning, se nedan). Saxen ska rengöras efter varje enskild fisk i en bägare fylld med destillerat H2O och torkas av med ett mjukt papper.

2. Fenvävnaderna homogeniseras nu med en teflonbelagd mortelstöt för mikrorör för att uppnå lysis hos cellerna. För varje rör används en ny mortelstöt för att förhindra kontaminering. Mortelstötarna placeras över natten i 0,5 M NaOH, sköljs sedan i fem minuter i destillerat H2O och lagras i etanol eller steriliseras efter autoklavering fram till användningen.

3. Det är också möjligt att lagra fenvävnaderna utan extraktionsbuffert 1 i torris och därefter i kylskåp vid – 80 °C för att förhindra degeneration av DNA. Extraktionen går dock lättare om man extraherar DNA samtidigt (hantering se ovan; proven ska tinas på is efter lagring vid – 80 °C innan bufferten fyllas på i rören).

4. Efter homogeniseringen placeras alla rör i vattenbad och kokas i 15 minuter vid 100 °C.

5. Sedan pipetteras 100 μl av extraktionsbuffert 2 (information om beredning av buffertlösning finns nedan) till varje provrör. Proven förvaras vid rumstemperatur i 15 minuter, och skakas ibland under tiden försiktigt för hand.

6. Därefter placeras alla rör i vattenbadet igen och kokas i ytterligare 15 minuter vid 100 °C.

7. Rören fryses vid – 20 °C och lagras för ytterligare analys.

Beredning av buffertlösning

PCR-buffert 1:

500 mg N-lauroylsarkosin (t.ex. Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland)

2 ml 5M NaCl

ad 100 ml dest. H2O

→ autoklavera

PCR-buffert 2:

20 g Chelex (t.ex. Biorad, München, Tyskland)

Låt svälla i 100 ml dest. H2O

→ autoklavera

Bestämning av det genetiska könet (genom PCR-metoden) hos risfiskar (utarbetad av Laboratory for Aquatic Organisms hos Bayer CropScience AG och Universität Würzburg Biozentrum)

De beredda och frysta rören (som beskrivs i avsnittet ovan) tinas på is. Efter detta centrifugeras de i en eppendorfcentrifug (30 sek. på högsta hastighet vid rumstemperatur). Den klara supernatanten som separerats från utfällningen används för PCR. Man måste absolut undvika att några spår av Chelex (lokaliserad i utfällningen) överförs till PCR-reaktionen, eftersom detta skulle påverka Taq-polymerasaktiviteten. Supernatanten ska användas direkt eller kan lagras fryst (vid – 20 °C) och tinas upp igen i flera omgångar utan några negativa effekter på DNA:t för senare analyser.

1. Beredning av reaktionsblandning Reaction Mix (25 μl per prov):

Volym | Slutlig koncentration

Templat-DNA | 0,5 μl–2 μl

10xPCR-buffert med MgCl2 | 2,5 μl | 1x

Nukleotider (var och en av dATP, dCTP, dGTP, dTTP) | 4 μl (5 mM) | 200 μM

Forward primer (10μM) (se nedan 3–5) | 0,5 μl | 200 nM

Reverse primer (10 μM) (se nedan 3–5) | 0,5 μl | 200 nM

DMSO | 1,25 μl | 5 %

Vatten (av PCR-kvalitet) | upp till 25 μl

Taq E-polymeras | 0,3 μl | 1,5 U

10xPCR-buffert med MgCl2: 670 mM Tris/HCl (pH 8,8 vid 25 °C), 160 mM (NH4)2SO4, 25 mM MgCl2, 0,1 % Tween 20

För varje PCR (se nedan 3–5) behövs den särskilda primer som utgörs av en ny kombination av Reaction Mix och den lämpliga mängden templat-DNA som behövs för varje prov (se ovan). Respektive volymer överförs till nya rör med hjälp av pipetter. Därefter försluts alla rör, omröres (ca 10 sek.) och centrifugeras (10 sek. vid rumstemperatur). Nu kan respektive PCR-program påbörjas. Dessutom används en positiv kontroll (typiskt DNA-prov med känd aktivitet och tydliga resultat) och en negativ kontroll (1 μl dest. H2O) i varje PCR-program.

2. Beredning av agarosgel (1 %) – medan PCR-programmen pågår:

Lös upp 3 g agaros i 300 ml 1 × TAE-buffert (1 % agarosgel)

Denna lösning bör kokas i en mikrovågsugn (ca 2–3 minuter)

Överför den varma lösningen till en särskild gjutlåda, som ligger på is

Efter ca 20 min är agarosgelen färdig för användning

Förvara agarosgelen i 1 × TAE-buffert till dess att PCR-programmen avslutats

3. Aktin-PCR-program:

Denna PCR-reaktion syftar till att visa att DNA i provet inte skadas.

Särskild primer:

Program:

4. X- och Y-gen-PCR-program:

Proven med intakt DNA används i detta PCR-program för att påvisa X- och Y-gener. Hanligt DNA bör uppvisa ett dubbelband och honligt DNA bör uppvisa ett enda band (efter färgning och gel-elektrofores). I denna programkörning bör en positiv kontroll för hanar (XY-prov) och en för honor (XX-prov) inkluderas.

Särskild primer:

Program:

5. Y-gen-PCR-program som kontroll för X- och Y-gen-PCR-programmet:

Detta PCR-program verifierar resultatet av X- och Y-gen-PCR-programmet. De hanliga proven bör uppvisa ett band och de honliga proven bör inte uppvisa något band (efter färgning och gel-elektrofores).

Särskild primer:

Program:

6. Färgning av PCR-proven:

Färgningslösning:

50 % glycerol

100 mM EDTA

1 % SDS

0,25 % bromfenolblått

0,25 % xylencyanol

Pipettera 1 μl av färglösningen till varje enskilt rör

7. Påbörja gelelektroforesen:

Den beredda 1 % agarosgelen överförs till en gelelektrofores-kammare fylld med 1 × TAE-buffert

10–15 μl av varje färgat PCR-prov pipetteras till en agarosgel-brunn

Även 5–15 μl av 1kb-stegen (Invitrogen) pipetteras till en separat brunn

Inled elektroforesen med 200 V

Avsluta efter 30–45 minuter

8. Bestämning av banden:

Rengör agarosgelen i destillerat H2O

Placera sedan agarosgelen i etidiumbromid i 15–30 minuter

Därefter ska en bild tas av agarosgelen i en UV-ljusbox

Slutligen analyseras proverna genom att jämföra dem med banden i den positiva kontrollen och stegen

Tillägg 10

Riktlinjer för vävnadsprov för bestämning av genetiskt kön hos storspigg med PCR-metoden

Vävnadsprov och DNA-extraktion

DNA kan extraheras med hjälp av olika kommersiellt tillgängliga reagens och både manuella och automatiserade extraktionssystem. Det protokoll som används vid Cefas Weymouth-laboratoriet beskrivs nedan, och alternativa metoder har lagts till där så är lämpligt.

1. En liten bit vävnad (10–20 mg) från det dorsolaterala området (efter att huvudet och stjärten avlägsnats för VTG-analys), avlägsnas från varje enskild fisk med en fin sax. Vävnaden läggs i ett rör och placeras antingen direkt i flytande kväve (för lagring vid – 80 °C) eller så fylls röret med 70 % etanol (för transport och efterföljande lagring vid 4 °C). Saxen rengörs efter varje enskild fisk i 70 % etanol och därefter i destillerat vatten, och torkas sedan med mjukt papper.

2. Etanolen (i förekommande fall) avlägsnas genom aspiration och vävnaden bryts sedan ned över natten med hjälp av proteas K i 400 μl ATL-buffert (Qiagen). En alikvot (200 μl) av den nedbrutna vävnaden överförs till ett 96-brunns S-block (Qiagen), och DNA extraheras i ett 96-brunnsformat med hjälp av Qiagen BioRobot Universal System och QIAamp Investigator BioRobot Kit. DNA elueras i 50 μl vatten som är fritt från DNAas och RNAas. Om man använder hårda vävnader för att extrahera DNA (t.ex. en tagg eller en bröstfena) kan det bli nödvändigt att homogenisera provet i en lyseringsbuffert med hjälp av ett FastPrep®-instrument för vävnadslysering eller motsvarande vävnadsnedbrytningssystem. Alternativ: a) Vävnaden bryts ned över natten med proteas K i 400 μl G2 lyseringsbuffert (Qiagen) och DNA extraheras från 200 μl av den nedbrutna vävnaden med hjälp av antingen EZ1 DNA Tissue Kit och BioRobot EZ1 eller DNA easy tissue mini kit. DNA elueras i en volym på 50 μl. b) Vävnaderna bearbetas med hjälp av DNAzol-reagenset. Vävnadsproven lyseras i 1 ml DNAzol i 10 minuter i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och centrifugeras därefter vid 13000 rpm i 5 minuter för att avlägsna alla partiklar. Det lyserade provet överförs sedan till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör som innehåller 500 μl 100 % etanol av molekylärbiologisk kvalitet, och centrifugeras därefter vid 13000 rpm i 10 minuter för att fälla ut DNA. Etanolen avlägsnas och ersätts med 400 μl 70 % etanol av molekylärbiologisk kvalitet som centrifugeras vid 13000 rpm i 5 minuter, och DNA-pelleten löses upp i 50 μl molekylärt vatten som är fritt från DNAas och RNAas. Återigen kan det bli nödvändigt, om man använder sig av hårda vävnader (bröstfena), att homogenisera provet i en lyseringsbuffert med hjälp av ett FastPrep®-instrument för vävnadslysering eller motsvarande vävnadsnedbrytningssystem innan DNA extraheras.

3. DNA förvaras vid – 20 °C fram till användning.

Obs! Handskar måste användas under dessa förfaranden.

Analys genom polymeraskedjereaktion (PCR)

Amplifieringar genomförs med 2,5 μl av DNA-extraktet i en reaktionsvolym på 50 μl med hjälp av primers för genlocus ldh (enligt beskrivning av Peichel m.fl., 2004. Current Biology 1, 1416–1424):

Forward primer | 5' GGG ACG AGC AAG ATT TAT TGG 3'

Reverse Primer | 5' TAT AGT TAG CCA GGA GAT GG 3'

Det finns många leverantörer av lämpliga PCR-reagens. Den metod som beskrivs nedan är den som för närvarande används vid Cefas Weymouth-laboratoriet.

1. Beredning av reaktionsblandning Reaction Mix (50 μl per prov):

En masterblandning bereds på det sätt som beskrivs här. Den kan beredas i förväg och lagras fryst vid – 20 °C fram till användning. Bered tillräckligt med masterblandning för en negativ kontroll (endast vatten av molekylärbiologisk kvalitet).

Mät upp 47,5 μl i ett etiketterat 0,5 ml tunnväggigt PCR-rör.

Tillsätt 2,5 μl renat DNA till röret med lämplig etikett. Upprepa för alla prover och den negativa kontrollen.

Täck med 2 droppar mineralolja. Alternativt kan man använda en termocykler med uppvärmt lock.

Stäng locken.

Proven denatureras i en Peltier PTC-225 termocykler vid 94 ± 2 °C i 5 minuter följt av 39 cykler vid 94 ± 2 °C i 1 minut, 55 ± 2 °C i 1 minut, 72 ± 2 °C i 1 minut, och en avslutande förlängning vid 72 ± 2 °C i 10 minuter.

Volym (stamlösningskonc.)/prov | Slutlig koncentration

5xGoTaq® Reaction Buffer | 10 μl | 1x

MgCl2 | 5 μl (25 mM) | 2,5 mM

Nukleotider (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) | 0,5 μl (25 mM vardera) | 250 μM vardera

Forward primer | 0,5 μl (0,1 nmol/μl) | 2,0 μM

Reverse primer | 0,5 μl (0,1 nmol/μl) | 2,0 μM

Vatten av molekylärbiologisk kvalitet | 30,75 μl

GoTaq-polymeras | 0,25 μl | 1,25 U

2. Beredning av agarosgelen (2 %):

Vanligtvis löses PCR-produkterna upp på 20 % agarosgel som innehåller etidiumbromid.

Kapillärbaserade elektroforessystem kan också användas.

Väg upp 2 g agaros i 100 ml 1 × TAE-buffert.

Värm i mikrovågsugn (ca 2–3 minuter) för att lösa upp agarosen.

Tillsätt 2 droppar etidiumbromid, slutkoncentration 0,5 μg/ml.

Överför den varma lösningen till gelgjutningsutrustningen.

Låt gelen stelna.

3. Gelelektrofores:

Överför agarosgelen till elektroforesutrustningen och sänk ner den i 1 × TAE-buffert.

Ladda 20 μl av varje prov i en separat brunn och lägg till en molekylviktsmarkör (100 bp DNA-stege, Promega) i en tom brunn.

Elektroforesen utförs vid 120 V i 30–45 minuter.

4. Visualisering av amplifieringsprodukterna

Om etidiumbromiden tillsattes till agarosgelen enligt beskrivning ovan kan DNA-produkterna visualiseras under en ultraviolett ljuskälla. Alternativt kan agarosgelen färgas genom att gelen täcks med en lösning av upplöst etidiumbromid (0,5 μg/ml i vatten) i 30 minuter innan visualiseringen.

Tillägg 11

Vägledning för konstgjord befruktning av storspigg

Syftet med detta avsnitt är att beskriva de förfaranden som används för att erhålla befruktade ägg från storspigg i syfte att använda dem i testet på fiskars könsutveckling.

Förfaranden

Insamling av sperma från hanar

1. En välfärgad hane från den önskade populationen avlivas.

2. Testiklarna avlägsnas från båda sidorna av fisken. Testiklarna är i allmänhet starkt pigmenterade, stavformiga strukturer som är lätta att urskilja vid kroppens laterala mittlinje. Använd någon av följande metoder:

3. Med hjälp av en fin sax gör man med början vid kloaken ett 1–1,5 cm långt vinklat snitt (45 grader) med ett enda klipp.

4. Använd en skalpell för att göra ett litet snitt i sidan på fisken något framför bäckenet och precis ventralt från de laterala benplattorna.

5. Testiklarna avlägsnas med hjälp av en liten pincett och placeras i en petriskål.

6. Varje testikel täcks med 100 μl nyberedd Hanks lösning.

7. Testiklarna skärs i små tärningar med ett rakblad eller en skalpell. Detta kommer att frigöra sperman och ger Hanks lösning ett mjölkvitt utseende.

8. Vätskan som innehåller sperman samlas upp i ett provrör. Försök undvika att få med bitar av testikelvävnad vid pipetteringen.

9. 800 μl Hanks lösning tillsätts i röret och blandas väl.

10. Om så krävs kan hanen bevaras genom att fixeras i 100 % etanol eller annat utvalt fixativ. Detta är särskilt viktigt om man i undersökningen bestämmer avkommans föräldraursprung.

Viktig anmärkning: Även om de flesta stamlösningar som behövs kan göras i förväg bör stamlösning 5 och därefter Hanks lösning nyberedas samma dag som de används.

NaCl | 8,00 g

KCl | 0,40 g

Destillerat vatten | 100 ml

Na2HPO4 (vattenfri) | 0,358 g

KH2PO4 | 0,60 g

Destillerat vatten | 100 ml

CaCl2 | 0,72 g

Destillerat vatten | 50 ml

MgSO4 · 7H2O | 1,23 g

Destillerat vatten | 50 ml

NaHCO3 | 0,35 g

Destillerat vatten | 10 ml

Anmärkning: Om man redan har en del av ovanstående salter men med en annan vattenhalt (dvs. 2H2O i stället för vattenfri) kan dessa ändå användas, men vikten måste först justeras på grundval av molekylvikten.

För Hanks lösning kombineras i följande ordning

stamlösning 1 | 1,0 ml

stamlösning 2 | 0,1 ml

stamlösning 3 | 0,1 ml

destillerat vatten | 8,6 ml

stamlösning 4 | 0,1 ml

stamlösning 5 | 0,1 ml

Blanda väl före användning.

Befruktning

1. Stora lekmogna honor med ägg väljs ut från den önskade populationen. Honorna är färdiga att kramas ur först när man kan se äggen sticka fram i kloaken. Honor som är lekmogna har en karaktäristisk kroppsställning med huvudet uppåt.

2. För försiktigt ett finger eller tummen längs sidan av fisken mot stjärten för att uppmuntra till utstötning av en äggsäck i en ny petriskål. Upprepa på andra sidan och släpp tillbaka fisken i dess akvarium.

3. Äggen kan spridas ut (till ett enskiktslager) med en liten pensel. Det är viktigt att försöka exponera så många ägg som möjligt för sperman, så det är till stor hjälp om man maximerar äggskiktets ytareal. Viktig anmärkning: Håll äggen fuktiga genom att täcka dem runt om med fuktigt mjukt papper (det är viktigt att äggen inte kommer i direkt beröring med vatten eftersom detta kan göra att korion hårdnar i förtid och därmed förhindrar befruktningen). Antalet ägg som varje hona kan producera varierar kraftigt, men i genomsnitt bör man enkelt kunna erhålla cirka 150 ägg från en enda lekmogen hona.

4. 25μl sperma i Hanks blandning fördelas jämnt över äggskiktets hela yta med hjälp av penseln. Äggen kommer snabbt att hårdna och ändra färg (inom en minut) när befruktningen har inletts. Upprepa förfarandet om det uppskattade antalet ägg är mer än 150. Likaledes ska man tillsätta lite mer sperma om äggen inte hårdnar inom en minut. Viktig anmärkning: Att tillsätta mer sperma ökar inte nödvändigtvis befruktningsfrekvensen.

5. Äggen och spermielösningen bör få stå och interagera i minst 15 minuter och de befruktade äggen placeras i exponeringsakvarierna inom 1,5 timmar efter befruktningen.

6. Förfarandet upprepas med en annan hona till dess att det önskade antalet ägg har samlats in.

7. Behåll ett fåtal ägg från den sista omgången och fixera dem i 10 % ättiksyra.

Räkning och fördelning av äggen i testakvarier

1. Äggen bör fördelas jämnt mellan varje behandlingsnivå för att undvika systematiska genetiska avvikelser. Varje parti befruktade ägg bör delas upp i lika stora grupper (lika många som behandlingsnivåerna) med hjälp av ett trubbigt instrument (t.ex. en insektspincett med bred spets eller med hjälp av en ympögla). Om man ämnar ha fyra replikat per testkärl med 20 ägg i varje måste man fördela 80 ägg per exponeringsakvarium. Viktig anmärkning: Det rekommenderas att man lägger till ytterligare 20 % (dvs. 96 ägg per behandlingsnivå) till dess att man är säker på att man har 100 % befruktningsfrekvens.

2. Spiggägg är mycket känsliga för svampinfektioner utanför boet, som vaktas av fadern. I detta hänseende är det av avgörande betydelse att alla ägg behandlas med metylenblått under de fem första dagarna av testet. En stamlösning med metylenblått bereds vid 1 mg/ml och tillsätts i exponeringsakvarierna för att ge en högsta slutlig koncentration på 2,125 mg/l. Viktig anmärkning: Spigg bör inte exponeras för metylenblått när de har kläckts. Systemet bör vara fritt från metylenblått senast på dag 6.

3. Äggen ska kontrolleras dagligen och eventuella döda eller obefruktade ägg registreras som sådana. Viktig anmärkning: Äggen bör aldrig befinna sig utanför vattnet innan kläckningen ens under mycket korta perioder.

1 Hanks buffrade saltlösning(HBSS): HBSS behövs för att bevara sperman medan man förbereder befruktningen.

Tillägg 1

Bestämning av organiskt kol i havsvatten

SKAKKOLVMETODEN

För bestämning av det organiska kolet i ett vattenprov oxideras de organiska föreningarna i provet till koldioxid, i allmänhet med hjälp av en av följande tre tekniker:

våtoxidation av persulfat/UV-strålning,

våtoxidation av persulfat/förhöjd temperatur (116–130 °C),

förbränning.

Utvecklad CO2 kvantifieras med hjälp av infraröd spektrometri eller titrering. Alternativt kan CO2 reduceras till metan, som kvantifieras med en flamjoniseringsdetektor (FID).

Persulfat/UV-metoden används vanligen för analys av rent vatten med låg halt av partiklar. De senare två metoderna kan användas för de flesta typer av vattenprover. Persulfat/förhöjd temperatur-oxidation är den mest lämpliga metoden för prov med låga nivåer och förbränningstekniken kan tillämpas på prov som har en halt av icke-flyktigt organiskt kol (NVOC) som ligger långt över 1 mg C/l.

Störningar

Alla tre metoderna är beroende av att man eliminerar eller kompenserar för oorganiskt kol (IC) som finns i provet. Avgasning av koldioxid från det surgjorda provet är den vanligaste metoden för att eliminera det oorganiska kolet, även om detta också leder till en förlust av flyktiga organiska föreningar (1). En fullständig eliminering eller kompensation för oorganiskt kol måste garanteras för varje provmatris, och det flyktiga organiska kolet (VOC) måste bestämmas utöver NVOC beroende på provtypen.

Höga koncentrationer av klorid leder till minskad oxidationseffektivitet när man använder persulfat/UV-metoden (2). Genom användning av ett oxidationsreagens som modifierats genom tillsats av kvicksilver(II)nitrat kan man dock avlägsna denna störning. Det rekommenderas att den högsta tillåtliga provvolymen används för att utvärdera varje typ av kloridhaltigt prov. Höga saltkoncentrationer i prov som analyserats med förbränningsmetoden kan orsaka saltbeläggning på katalysatorn och kraftig korrosion av förbränningsröret. Åtgärder bör vidtas enligt tillverkarens anvisningar.

Mycket grumliga prover och prover som innehåller partiklar kan oxideras ofullständigt när man använder persulfat/UV-metoden.

Exempel på en lämplig metod

Icke-flyktigt organiskt kol bestäms genom oxidation med persulfat/UV-strålning och därpå följande kvantifiering av utvecklad CO2 med hjälp av icke-dispersiv infraröd spektroskopi.

Oxidationsreagenset modifieras i enlighet med de förslag som anges i (2) på de sätt som beskrivs i tillverkarens manual:

a 8,2 g HgCl2 och 9,6 g Hg(NO3)2 · H2O löses upp i flera hundra milliliter reagensvatten med låg kolhalt.

b 20 g K2S2O8 löses upp i den kvicksilverhaltiga saltlösningen.

c 5 ml HNO3 (konc.) tillsätts till blandningen.

d reagenset späds ut till 1000 ml.

Störningen från klorid avlägsnas om man använder 40 μl provvolym för 10 procent klorid och 200 μl provvolym för 1,9 procent klorid. Prover med höga kloridkoncentrationer och/eller större provvolymer kan analyseras enligt denna metod förutsatt att man förhindrar att klorid ackumuleras i oxidationskärlet. Bestämningen av flyktigt organiskt kol kan därefter utföras, om det är relevant för provtypen i fråga.

LITTERATUR

(1) ISO, Water quality – determination of total organic carbon. Draft International Standard ISO/DIS 8245, 16 januari 1986.

(2) American Public Health Association, Standard Methods for the Estimation of Water and Wastewater. American Water Works Association & Water Pollution Control Federation, 16:e upplagan, 1985. Också av intresse (ger en beskrivning av ett autoanalyssystem):

(3) Schreurs W. (1978). An automated colorimetric method for the determination of dissolved organic carbon in seawater by UV destruction. Hydrobiological Bulletin 12, 137–142.

Tillägg 2

Biologisk nedbrytning i havsvatten

SKAKKOLVMETODEN

RESULTATFORMULÄR

1. LABORATORIUM:

2. DATUM FÖR INLEDNING AV TESTET:

3. TESTÄMNE: Namn: Stamlösningens koncentration: mg/l som ämne Startkoncentration i mediet, t0: mg/l som ämne : mg DOC/l

4. HAVSVATTEN: Källa: Insamlingsdatum: Provtagningsdjup: Utseende vid insamlingstillfället (t.ex. grumligt, etc.): Salthalt vid insamlingen: ‰ Temperatur vid insamlingen: °C DOC x timmar efter insamlingen: mg/l Förbehandling före testning (t.ex. filtrering, sedimentering, åldrande, etc.): Räkning av kolonier av mikroorganismer — ursprungligt prov: kolonier/ml — vid testets inledning: kolonier/ml Andra egenskaper:

5. KOLBESTÄMNINGAR: Kolanalysator: Kolv nr DOC efter n dagar (mg/l) 0 n1 n2 n3 nx Test: näringsmättat havsvatten med testämne 1 a1 a2 medelvärdet, Ca(t) 2 b1 b2 medelvärdet, Cb(t) Blankprov: näringsmättat havsvatten utan testämne 1 c1 c2 medelvärdet, Cc(t) 2 d1 d2 medelvärdet, Cd(t) medelvärdet, C bl t C c t C d t 2

6. UTVÄRDERING AV RÅDATA: Kolv nr Beräkning av resultaten % nedbrytning efter n dagar 0 n1 n2 n3 nx 1 D 1 1 C a t C bl t C 0 C bl 0 100 0 2 D 2 1 C b t C bl t C 0 C bl 0 100 0 Medelvärde D t D 1 D 2 2 0 Anmärkning: Liknande format kan användas när nedbrytningen följs av särskild analys, och för referensämnet och toxicitetskontrollproverna.

7. ABIOTISK NEDBRYTNING (valfritt) Tid (dagar) 0 t DOC-koncentration (mg/l) i steril kontroll Cs(o) Cs(t) % abiotisk nedbrytning C s 0 C s t C s o 100

1 Genomsnittet av D1 och D2 ska inte beräknas om det föreligger en betydande skillnad mellan de två värdena.

Tillägg 3

Beräkning av den teoretiska biokemiska syreförbrukningen

CLOSED BOTTLE-METODEN

ThOD för ämnet CcHhClclNnNanaOoPpSs med molekylvikten MW beräknas enligt följande:

Denna beräkning tyder på att C mineraliseras till CO2, H till H2O, P till P2O5 och Na till Na2O. Halogen elimineras som vätehalid och kväve som ammoniak.

Exempel:

Glukos C6H12O6, MW = 180

Molekylvikten av salter annat än alkalimetaller beräknas med antagandet att salterna har hydrolyserats.

Svavel antas oxideras till oxidationstillståndet +6.

Exempel:

Natrium n-dodekylbensensulfonat C18H29SO3Na, MW = 348

När det gäller kvävehaltiga ämnen kan kvävet elimineras som ammoniak, nitrit eller nitrat, motsvarande olika teoretiska biokemiska syreförbrukningar.

Anta när det gäller en sekundär amin att fullständig nitratbildning har iakttagits genom analys:

(C12H25)2 NH, MW = 353

Tillägg 4

temperature (°C)

salinity

in: ‰

Nomogram giving:

Saturation concentration of oxygen of various temperatures and salinities

mg O2/l

Tillägg 5

Biologisk nedbrytning i havsvatten

CLOSED BOTTLE-METODEN

RESULTATFORMULÄR

1. LABORATORIUM:

2. DATUM FÖR INLEDNING AV TESTET:

3. TESTÄMNE: Namn: Stamlösningens koncentration: mg/l Startkoncentration i havsvattenmediet: mg/l ThOD eller COD: mg O2/mg testämne

4. HAVSVATTEN: Källa: Insamlingsdatum: Provtagningsdjup: Utseende vid insamlingstillfället (t.ex. grumligt, etc.): Salthalt vid insamlingen: ‰ Temperatur vid insamlingen: °C DOC x timmar efter insamlingen: mg/l Förbehandling före testning (t.ex. filtrering, sedimentering, åldrande osv.): Räkning av kolonier av mikroorganismer — ursprungligt prov: kolonier/ml — vid testets inledning: kolonier/ml Andra egenskaper:

5. TESTMEDIUM: Temperatur efter luftningen: °C O2-koncentration efter luftningen och vilan före testets inledning: mg O2/l

6. BESTÄMNING AV LÖST SYRE: Metod: Winkler/elektrod Kolv nr mg O2/l efter n dagar 0 5 15 28 Test: näringsmättat havsvatten med testämne 1 a1 2 a2 Medelvärde för testämnesprovet m t a 1 a 2 2 Blankprov: näringsmättat havsvatten utan testämne 1 c1 2 c2 Medelvärde för blankprovet m b c 1 c 2 2 Anmärkning: en motsvarande uppställning kan användas för referensämnes- och toxicitetskontrollproverna.

7. FÖRLUST AV LÖST SYRE: % NEDBRYTNING ( %D): Förlust av löst syre efter n dagar 5 15 28 (mb – mt) %D m b m t testämne mg l ThOD 100

1 Detta förutsätter att mb(o) = mt(o), där mb(o) värde för blankprovet på dag 0, mt(o) värde för testämnet på dag 0. Om mb(o) inte är lika med mt(o) använder man (mt(o) – mt(x)) – (mb(o) – mb(x)), där mb(x) värde för blankprovet på dag x, mt(x) värde för testämnet på dag x.

Tillägg 1

Exempel på utrustning för mätning av biogasproduktion via gastrycket

Teckenförklaring:

Testkärl i en miljö med temperaturen 35 ± 2 °C

Tillägg 2

Omvandling av tryckmätningarna

Avläsningarna från tryckmätaren kan relateras till gasvolymer med hjälp av en standardkurva som genereras genom injicering av kända volymer luft vid 35 ± 2 °C i injektionsflaskor som innehåller en volym vatten som motsvarar volymen av reaktionsblandningen, VR:

Fördela VR ml alikvoter av vatten vars temperatur bibehålls vid 35 ± 2 °C i fem injektionsflaskor. Försegla flaskorna och placera dem i ett vattenbad vid 35 °C i en timme för att uppnå jämvikt.

Slå på tryckmätaren, låt den stabiliseras, och justera till noll.

För in kanylen genom förseglingen på en av flaskorna, öppna ventilen till dess att tryckmätaren visar noll och stäng därefter ventilen.

Upprepa detta förfarande med de återstående flaskorna.

Injicera 1 ml luft vid 35 ± 2 °C i varje flaska. För in nålen (på mätaren) genom förseglingen på en av flaskorna och låt tryckavläsningen stabiliseras. Registrera trycket, öppna ventilen till dess att trycket visar noll och stäng därefter ventilen.

Upprepa förfarandet med de återstående flaskorna.

Upprepa hela förfarandet ovan med 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 8 ml, 10 ml, 12 ml, 16 ml, 20 ml och 50 ml luft.

Rita en omvandlingskurva över trycket (Pa) mot volymen gas som injicerats Vb (ml). Mätresultaten från instrumentet är linjära i intervallet mellan 0 Pa till 70000 Pa, och 0 ml till 50 ml gasproduktion.

Tillägg 3

Exempel på en nedbrytningskurva (kumulativ nettotryckökning)

Gas pressure (m bar)

Time (days)

Plateau

Lag phase

100

200

300

400

500

Tillägg 4

Exempel på resultatformulär för testet för anaerob nedbrytning – Resultatformulär för testämnet

Laboratorium: … | Testämne: … | Test nr: …

Testtemperatur (°C): … | Gasutrymmets volym (Vh): …l) | Vätskans volym (Vl ): …l)

Mängden kol i testämnet Cc,v: …(mg/l) | mv: …(mg)

oorganiskt kol (vid testslut)

pH (vid testslut)

Laboratorium: … | Referensämne: … | Test nr: …

Testtemperatur (°C): … | Gasutrymmets volym (Vh): …l) | Vätskans volym (Vl ) (liter): …

Kol i referensämne Cc,v (mg/l): … | mv (mg): …

oorganiskt kol (vid testslut)

pH (vid testslut)

1 Kol i testkärlet, mv (mg): mv = CC,v × Vl

2 Kol i gasutrymmet, mh (mg) vid normal inkubationstemperatur (35 °C): mh = 0,468Δp × Vh

3 Bionedbrytningen beräknas utifrån gasen i gasutrymmet, Dh (%): Dh = (mh × 100)/mv

4 Kol i flytande form, ml (mg): ml = CIC,net × Vl

5 Den totala massan gasformigt kol, mt (mg): mt + ml

6 Den totala biologiska nedbrytningen, Dt (%): Dt = (mt × 100)/mv

13 Kol i testkärlet, mv (mg): mv = CC,v × Vl

14 Kol i gasutrymmet, mh (mg) vid normal inkubationstemperatur (35 °C): mh = 0,468Δp × Vh

15 Bionedbrytningen beräknas utifrån gasen i gasutrymmet, Dh (%): Dh = (mh × 100)/mv

16 Kol i flytande form, ml (mg): ml = CIC,net × Vl

17 Den totala massan gasformigt kol, mt (mg): mt + ml

18 Den totala biologiska nedbrytningen, Dt (%): Dt = (mt × 100)/mv

Tillägg 1

Definitioner och enheter

En blandning av mineraliska och organiska kemiska beståndsdelar i vilken små (huvudsakligen mikroskopiska) organismer lever. De kemiska beståndsdelarna består av föreningar med hög kol- och kvävehalt samt hög molekylvikt. Jord kan hanteras i två olika tillstånd:

ostörd, såsom den har utvecklats under tidens gång, i karakteristiska skikt med ett flertal olika jordtyper,

störd, vilket normalt gäller för odlad mark eller när jordprover tas genom grävning och därefter undersöks med denna testmetod (2).

(1) Holland, P. T. (1996). Glossary of Terms Relating to Pesticides. IUPAC Reports on Pesticide (36). Pure & Appl. Chem. 68, 1167–1193.

(2) OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil (antagen 12 maj 1981).

Tillägg 2

Figur 1 Exempel på icke-delbara urlakningskolonner av glas med en längd på 35 cm och en innerdiameter på 5 cm (1)

← Glasullspropp för att hålla jorden kvar i kolonnen

← Skikt av kvartssand

← Glaskolonnen fylls med testjord (när man testar foto- labila produkter bör kolonnen viras in i aluminiumfolie)

← Sintringsplatta av glas för att undvika att jorden störs och för att jämnt fördela det artificiella regnet

← Dropptrattar för tillförsel av artificiellt regn

← Rundbottnad kolv för insamling av lakvatten, invirad i aluminiumfolie för att för- hindra fotolys

(1) Drescher, N. (1985). Moderner Acker- und Pflanzenbau aus Sicht der Pflanzenschutzmittelindustrie. In Unser Boden – 70 Jahre Agrarforschung der BASF AG, 225–236. Verlag Wissenschaft und Politik, Köln.

Figur 2 Exempel på en delbar metallkolonn med 4 cm innerdiameter (1)

(1) Burkhard, N., Eberle D. O. och Guth, J. A. (1975). Model systems for studying the environmental behaviour of pesticides. Environmental Quality and Safety, Suppl. Vol. III, 203–213.

Tillägg 3

RMF-intervall | Kemikalie (RMF) | Rörlighetsklass

≤ 0,15 | Paration (< 0,15), fluorodifen (0,15) | I orörlig

0,15–0,8 | Profenofos (0,18), propikonazol (0,23), diazinon (0,28), diuron (0,38), terbutylazin (0,52), metidation (0,56), prometryn (0,59), propazin (0,64), alaklor (0,66), metolaklor (0,68) | II något rörlig

0,8–1,3 | Monuron (1,00), atrazin (1,03), simazin (1,04), fluometuron (1,18) | III måttligt rörlig

1,3–2,5 | Prometon (1,67), cyanazin (1,85), bromacil (1,91), karbutilat (1,98) | IV ganska rörlig

2,5–5,0 | Karbofuran (3,00), dioxakarb (4,33) | V rörlig

> 5,0 | Monokrotofos (> 5,0), dikrotofos (> 5,0) | VI mycket rörlig

(1) Guth, J. A. (1985). Adsorption/desorption. I Joint International Symposium Physicochemical Properties and their Role in Environmental Hazard Assessment. Canterbury, Storbritannien, 1–3 juli 1985.

(2) Guth, J. A. och Hörmann, W. D. (1987). Problematik und Relevanz von Pflanzenschutzmittel-Spuren im Grund (Trink-) Wasser. Schr.Reihe Verein WaBoLu, 68, 91–106.

(3) Harris, C. I. (1967). Movement of herbicides in soil. Weeds 15, 214–216.

(4) Helling, C. S. (1971). Pesticide mobility in soils. Soil Sci. Soc. Am. Proc. 35, 743–748.

(5) McCall, P. J., Laskowski, D. A., Swann, R. L. och Dishburger, H. J. (1981). Measurements of sorption coefficients of organic chemicals and their use in environmental fate analysis. I Test Protocols for Environmental Fate and Movement of Toxicants. Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washington D.C.

(6) Hollis, J. M. (1991). Mapping the vulnerability of aquifers and surface waters to pesticide contamination at the national/regional scale. BCPC Monograph No. 47 Pesticides in Soil and Water, 165–174.

3 Den relativa rörlighetsfaktorn beräknas på följande sätt (3): RMF urlakningsavstånd för testkemikalien cm urlakningsavstånd för referenskemikalien cm

4 Referenskemikalie

5 + Andra system för klassificering av en kemikalies rörlighet i jord är baserade på Rf-värden från jordanalyser med tunnskiktskromatografi (4) och på Koc-värden (5) (6).

Tillägg 1

Datablankett för testmetoden

Provningslaboratorium

Träskyddsmedlets leverantör

Träskyddsmedlets särskilda och unika namn eller kod

Träskyddsmedlets handels- eller trivialnamn

Tillsatsämnen

Den relevanta upptagningen för trä som används i kontakt med vatten

Appliceringsmetod

Datum för applicering

Formel som används för att beräkna upptagningen:

Konditioneringsförfarande

Konditioneringens varaktighet

Försegling av ändträet / antal gånger den applicerats

Efterbehandling | (om tillämpligt)

Träslag

Träets densitet | (minsta värde … medelvärde … högsta värde)

Tillväxthastighet (ringar per 10 mm) | (minsta värde … medelvärde … högsta värde)

Fukthalt

Testkombinationer | Upptagning (t.ex. kg/m3)

Behandlat x | Medelvärde och standardavvikelse för fem exemplar

Behandlat y | Medelvärde och standardavvikelse för fem exemplar

Behandlat z | Medelvärde och standardavvikelse för fem exemplar

Obehandlat

Ändring av testmetodens parametrar | t.ex. vattenkvalitet, provexemplarens dimensioner, osv.

Tid | Vattenbyte | Provmassa | Vattenupptagning | Vattenprov

Datum | g | g | g | g | nr | pH-värde | pH-värde | pH-värde | pH-värde

start

6 h | 1

24 h | 2

2 d. | 3

4 d. | 4

8 d. | 5

15 d. | 6

22 d. | 7

29 d. | 8

V.g. fyll i separata tabeller för varje aktiv substans

Tid | Vattenbyte | Analysresultat

Obehandlade exemplar | Behandlade exemplar

x | y | z | Medel | x | y | z | Medel | x | y | z | Medel

Datum | mg/l | mg/l | mg/l | mg/l | mg/m2 | mg/m2 | mg/m2 | mg/m2 | mg/m2/d | mg/m2/d | mg/m2/d | mg/m2/d

6 h

24 h

2 d.

4 d.

8 d.

15 d.

22 d.

29 d.

Anmärkning: Eftersom man kan behöva använda resultaten från obehandlade prover för att korrigera utsläppshastigheten från behandlade prover bör de obehandlade resultaten komma först och alla värden för behandlade prover blir då korrigerade värden. En korrigering kan också behöva göras för den ursprungliga vattenundersökningen.

1 x, y, z representerar de tre replikatproven

Tillägg 2

Definitioner

Tillägg 1

Definitioner och enheter

Syntetiskt sediment eller rekonstituerat eller konstgjort sediment: en blandning av material som är avsedda att efterlikna de fysiska beståndsdelarna i naturligt sediment.

Bioackumulering: ökningen av testämnets koncentration i eller på en organism i förhållande till testämnets koncentration i det omgivande mediet. Bioackumulering uppstår till följd av både biokoncentrations- och biomagnifieringsprocesser (se nedan).

Bioackumuleringsfaktorn (BAF): den koncentration av testämnet under valfri tidpunkt under upptagningsfasen som förekommer i eller på testorganismen (Ca uttryckt som g kg– 1 torr- eller våtvikt) dividerad med testämnets koncentration i det omgivande mediet (Cs uttryckt som g kg– 1 torr- eller våtvikt sediment). För att hänvisa till enheterna för Ca och Cs har BAF-värdet enheten kg sediment kg– 1 mask (15).

Bioackumuleringsfaktorer som beräknas direkt utifrån kvoten av sedimentets upptagningskonstant dividerad med konstanterna för elimineringshastighet (ks respektive ke, se nedan) kallas kinetiska bioackumuleringsfaktorer (BAFK).

Biokoncentration: ökningen i testämnets koncentration i eller på en organism uteslutande till följd av upptagning via kroppsytan, i förhållande till testämnets koncentration i det omgivande mediet.

Biomagnifiering: ökningen i testämnets koncentration i eller på en organism, främst till följd av upptagning från förorenad föda eller förorenat byte, i förhållande till testämnets koncentration i födan eller bytet. Biomagnifiering kan leda till överföring eller ackumulering av testämnet inom näringskedjor.

Ackumuleringsfaktorn biota/sediment (BSAF): den fettnormaliserade testämneskoncentrationen vid ett stabilt tillstånd i eller på testorganismen dividerad med den organiskt kol-normaliserade koncentrationen av ämnet i sedimentet vid ett stabilt tillstånd. Ca uttrycks då som g kg– 1 fettinnehåll i organismen och Cs som g kg– 1 organiskt innehåll i sedimentet.

Konditioneringsperioden: används för att stabilisera den mikrobiella komponenten i sedimentet och avlägsna t.ex. ammoniak från sedimentets beståndsdelar. Den äger rum före spikningen av sedimentet med testämnet. Vanligtvis kastas det överliggande vattnet bort efter konditioneringen.

Eliminering av ett testämne: förlusten av detta ämne från testorganismens vävnad genom aktiva eller passiva processer som inträffar oberoende av förekomsten eller frånvaron av testämnet i det omgivande mediet.

Elimineringsfas: den tid efter överföringen av testorganismerna från ett förorenat medium till ett medium som inte innehåller testämne under vilken elimineringen (eller nettoförlusten) av ämnet från testorganismerna studeras.

Elimineringskonstant (ke): det numeriska värde som definierar reduktionshastigheten för testämneskoncentrationen i eller på testorganismen efter överföring av testorganismerna från ett medium som innehåller testämnet till ett kemikaliefritt medium (ke uttrycks i d– 1).

Stabiliseringsperiod: används för att låta testämnet fördela sig mellan den fasta fasen, porvattnet och det överliggande vattnet. Den äger rum efter spikningen av sedimentet med testämnet och före tillsatsen av testorganismerna.

Fördelningskoefficienten oktanol/vatten (Kow): förhållandet mellan ämnets löslighet i n-oktanol och i vatten vid jämvikt, ibland även uttryckt som Pow. Logaritmen av Kow (log Kow) används som en indikation på ett ämnes potential för bioackumulering i vattenlevande organismer.

Fördelningskoefficienten organiskt kol/vatten (Koc): förhållandet mellan ett ämnes koncentration i eller på sedimentets fraktion av organiskt kol och ämnets koncentration i vatten vid jämvikt.

Överliggande vatten: det vatten som täcker sedimentet i testkärlet.

Platå eller stabilt tillstånd: ett tillstånd där jämvikt råder mellan de upptagnings- och elimineringsprocesser som inträffar samtidigt under exponeringsfasen. Det stabila tillståndet uppnås i diagrammet över BAF vid varje provtagningsperiod mot tiden när kurvan blir parallell med tidsaxeln och tre på varandra följande analyser av BAF på prover tagna med intervaller på minst två dagar ligger inom 20 % av varandra, och det inte finns några statistiskt signifikanta skillnader mellan de tre provtagningsperioderna. För testämnen som tas upp långsamt är det lämpligare med intervall på sju dagar (5).

Porvatten: det vatten som finns i mellanrummen mellan sediment- eller jordpartiklar.

Konstanten för sedimentets upptagningshastighet (ks): ett numeriskt värde som definierar ökningshastigheten av testämneskoncentrationen i eller på testorganismen till följd av upptagning från sedimentfasen (ks uttrycks som g sediment kg– 1 maskar d– 1).

Spikat sediment: sediment till vilket ett testämne har tillsatts.

Bioackumuleringsfaktor vid stabilt tillstånd (BAFss): den BAF som gäller vid ett stabilt tillstånd och som inte förändras betydligt över en längre tidsperiod, förutsatt att testämneskoncentrationen i det omgivande mediet (Cs uttryckt som g kg– 1 våt- eller torrvikt sediment) är konstant under denna tidsperiod.

Upptagnings- eller exponeringsfasen: den tid under vilken testorganismerna exponeras för testämnet.

Tillägg 2

Beräkning av upptagnings- och elimineringsparametrar

Den viktigaste endpointen i ett bioackumuleringstest är bioackumuleringsfaktorn, BAF. Det uppmätta BAF-värdet kan beräknas genom att dividera testämneskoncentrationen i testorganismen, Ca, med testämneskoncentrationen i sedimentet, Cs, vid stabilt tillstånd. Om ett stabilt tillstånd inte uppnås under upptagningsfasen beräknas BAF på samma sätt för dag 28. Man bör dock notera huruvida BAF är baserat på koncentrationer vid stabilt tillstånd eller inte.

Den bästa metoden för att få fram den kinetiska bioackumuleringsfaktorn (BAFK), konstanten för upptagningshastigheten i sedimentet (ks) och elimineringskonstanten (ke) är att använda icke-linjära datorbaserade parameteruppskattningsmetoder. Förutsatt att man känner till tidsserien av genomsnittliga ackumuleringsfaktorer (Ca, medelvärden för varje provtagningsdatum/Cs, medelvärden för varje provtagningsdatum = AF) för upptagningsfasen på grundval av maskarnas och sedimentets våtvikt, och modellekvationen

AF(t) = BAF × (1 – eke × t) | [ekvation 1]

där AF(t) är förhållandet mellan testämneskoncentrationen i maskarna och testämneskoncentrationen i sedimentet vid en given tidpunkt (t) i upptagningsfasen, kan dessa datorprogram beräkna värden för BAFK, ks och ke.

Om ett stabilt tillstånd inte uppnås under upptagningsfasen, (dvs. t = ∞), kan ekvation 1 förenklas till

BAF K k s k e | [ekvation 2]

där

Då är ks/ke×Cs en tillnärmning av testämneskoncentrationen i maskvävnad vid ett stabilt tillstånd (Ca,ss).

Ackumuleringsfaktorn biota/sediment (BSAF) beräknas på följande sätt:

där foc är fraktionen organiskt kol i sedimentet och flip är fraktionen fett i maskarna, båda baserade antingen på torrvikt eller på våtvikt.

Förutsatt att man känner till en tidsserie med koncentrationsvärden kan elimineringskinetiken modelleras med hjälp av följande modellekvationer och en icke-linjär datorbaserad parameteruppskattningsmetod.

Det genomsnittliga uppmätta värdet för rester i kroppen vid slutet av upptagningsfasen rekommenderas som standardutgångspunkt. Värdet som modellerats/beräknats från upptagningsfasen bör endast användas t.ex. om det uppmätta värdet avviker väsentligt från det modellerade värdet för rester i kroppen. Se även punkt 50 för alternativa förhandsexponeringar av de maskar som valts ut för elimineringen. Med detta tillvägagångssätt anses proverna från dessa förhandsexponerade maskar på dag 0 av elimineringsfasen ge en realistisk mängd rester i kroppen att inleda elimineringskinetiken med.

Om datapunkterna plottade mot tiden indikerar en konstant exponentiell minskning av testämneskoncentrationen i djuren kan en one-compartment-modell (ekvation 4) användas för att beskriva elimineringens tidsförlopp.

C a t C a,ss e k et | [ekvation 3]

Elimineringsprocesserna verkar ibland ha två faser med en snabb minskning av Ca till en början och därefter en långsammare avgång av testämnen senare under elimineringen (8) (19) (25)). De två faserna kan tolkas med antagandet att det finns två olika avdelningar (compartments) i organismen från vilka testämnet avgår med olika hastighet. I sådana fall bör information inhämtas från specifik litteratur (15) (16) (17) (25).

En two-compartment-eliminering beskrivs t.ex. genom följande ekvation (25):

C a A e k a t B e k b t | [ekvation 4]

A och B utgör storleken på avdelningarna (i procent av de totala resterna i vävnaderna), där A är avdelningen med snabb förlust av ämnet och B avdelningen med långsam förlust av testämnet. Summan av A och B motsvarar 100 % av hela djurets avdelningsvolym vid ett stabilt tillstånd. ka och kb representerar motsvarande elimineringskonstanter (d– 1). Om two-compartmentmodellen anpassas till depureringsdata kan upptagningskonstanten ks bestämmas på följande sätt (53) (54):

k s A k a B k b BAF A B | [ekvation 5]

Dessa modellekvationer bör dock användas med försiktighet, särskilt när förändringar i testämnets biotillgänglighet inträffar under testets gång (42).

Som ett alternativ till de ovan beskrivna modellekvationerna kan kinetiken (ks och ke) även beräknas i ett steg genom att tillämpa modellen för första ordningens kinetik på alla data från både upptagnings- och elimineringsfasen tillsammans. För en beskrivning av en metod som möjliggör en sådan kombinerad beräkning av upptagnings- och elimineringskonstanterna, se hänvisningarna (55), (56) och (57).

De icke-eliminerade resterna (NER) bör beräknas som en sekundär endpoint genom att multiplicera förhållandet mellan den genomsnittliga koncentrationen i maskarna (Ca) på dag 10 av elimineringsfasen och den genomsnittliga koncentrationen i maskarna (Ca) vid ett stabilt tillstånd (dag 28 i upptagningsfasen) med 100:

Tillägg 3

Exempel på provtagningsschema för ett 28-dagars bioackumuleringstest

a) Upptagningsfas (inbegripet en fyra dagars stabiliseringsfas)

Dag | Aktiviteter

– 6 | Bered torvlösningen för sedimentet, konditionera lösningen i 48 timmar.

– 4 | Spika sedimentet eller sedimentfraktionen, blanda alla beståndsdelar till sedimentet, ta sedimentprover på behandlat kontrollsediment och kontrollsediment med lösningsmedel för bestämning av testämneskoncentrationen, tillsätt det överliggande vattnet, inkubera under testförhållanden (stabiliseringsfasen).

– 3/– 2 | Skilj testorganismerna från odlingen för acklimatisering.

0 | Mät vattenkvaliteten (se punkt 52), avlägsna replikat för provtagning av vatten och sediment för bestämning av testämneskoncentrationer, fördela maskarna slumpmässigt i testbehållarna, behåll tillräcklig mängd delprov med maskar för bestämning av de analytiska bakgrundsvärdena, kontrollera lufttillförseln vid användning av ett slutet testsystem.

1 | Avlägsna replikat för provtagning, kontrollera lufttillförseln, maskarnas beteende, vattenkvaliteten (se punkt 56), ta vatten-, sediment- och maskprover för bestämning av testämneskoncentrationen.

2 | Kontrollera lufttillförseln, maskarnas beteende och temperaturen.

3 | Samma som dag 1.

4–6 | Samma som dag 2.

7 | Samma som dag 1, fyll på vatten vid behov för att kompensera för avdunstat vatten.

8–13 | Samma som dag 2.

14 | Samma som dag 1, fyll på vatten vid behov för att kompensera för avdunstat vatten.

15–20 | Samma som dag 2.

21 | Samma som dag 1, fyll på vatten vid behov för att kompensera för avdunstat vatten.

22–27 | Samma som dag 2.

28 | Samma som dag 1, mät vattenkvaliteten (se punkt 52), slutet på upptagningsfasen, behåll tillräcklig mängd delprov med maskar för bestämning av de analytiska bakgrundsvärdena, våt- och torrvikt samt fettinnehåll, överför maskarna från de kvarvarande exponeringskärlen till kärl som innehåller rent sediment för elimineringsfasen (ingen tarmtömning), ta vatten-, sediment- och maskprover på lösningsmedelskontrollerna, ta prover på lösningarna i fällorna, om sådana används.

Förhandsexponeringsaktiviteterna (stabiliseringsfasen) bör planeras med hänsyn tagen till egenskaperna hos det ämne som testas. Om så krävs, konditionera det beredda sedimentet under överliggande vatten vid 20 ± 2 °C i sju dagar – bered i så fall sedimentet tidigare!

Aktiviteterna för dag 2 bör genomföras dagligen (åtminstone på arbetsdagar).

b) Elimineringsfas

Dag | Aktiviteter

– 6 | Bered torvlösningen för sedimentet, konditionera lösningen i 48 timmar.

– 4 | Blanda alla beståndsdelar till sedimentet, ta sedimentprover på behandlat kontrollsediment och kontrollsediment med lösningsmedel för bestämning av testämneskoncentrationen, tillsätt det överliggande vattnet, inkubera under testförhållanden.

0 (dag 28 i upp-tagnings-fasen) | Mät vattenkvaliteten (se punkt 52), överför maskarna från de återstående exponeringsreplikatkärlen till kärl som innehåller rent sediment, avlägsna replikaten efter 4–6 timmar för provtagning av vatten, sediment och maskar för bestämning av testämneskoncentrationen, fördela maskarna slumpvis i testbehållarna.

1 | Avlägsna replikat för provtagning, kontrollera lufttillförseln, maskarnas beteende, vattenkvaliteten (se punkt 52), ta vatten-, sediment- och maskprover för bestämning av testämneskoncentrationen.

2 | Kontrollera lufttillförseln, maskarnas beteende och temperaturen.

3 | Samma som dag 1.

4 | Samma som dag 2.

5 | Samma som dag 1.

6 | Samma som dag 2.

7 | Samma som dag 1, fyll på vatten vid behov för att kompensera för avdunstat vatten.

8–9 | Samma som dag 2.

10 | Samma som dag 1, slutet på elimineringsfasen, mät vattenkvaliteten (se punkt 52), ta vatten-, sediment- och maskprover på lösningsmedelskontrollerna, ta prover på lösningarna i fällorna, om sådana används.

Beredningen av sedimentet före elimineringsfasens början bör göras på samma sätt som före upptagningsfasens början.

Aktiviteterna för dag 2 bör genomföras dagligen (åtminstone på arbetsdagar).

Tillägg 4

Vissa fysikalisk-kemiska egenskaper hos godtagbart utspädningsvatten

BESTÅNDSDEL | KONCENTRATIONER

Partiklar | < 20 mg/l

Halt av organiskt kol | < 2μg/l

Ojoniserad ammoniak | < 1 μg/l

Resterande mängd klor | < 10 μg/l

Total mängd bekämpningsmedel som innehåller organiska fosforföreningar | < 50 ng/l

Total mängd bekämpningsmedel som innehåller organiska klorföreningar plus polyklorerade bifenyler | < 50 ng/l

Total mängd organiskt klor | < 25 ng/l

DET REKOMMENDERADE REKONSTITUERADE VATTNETS SAMMANSÄTTNING

a Kalciumkloridlösning

b Magnesiumsulfatlösning

c Natriumbikarbonatlösning

d Kaliumkloridlösning

Alla kemikalier ska vara av analyskvalitet.

Konduktiviteten i det destillerade eller avjonade vattnet bör inte överstiga 10 μScm– 1.

25 ml av var och en av lösningarna (a) till (d) blandas och den totala volymen späds till 1 liter med avjonat vatten. Summan av kalcium- och magnesiumjoner i denna lösning är 2,5 mmol/l.

Förhållandet mellan Ca- och Mg-joner är 4:1 och mellan Na- och K-joner 10:1. Syrakapaciteten KS4,3 i denna lösning är 0,8 mmol/l.

Lufta utspädningsvattnet till dess att syremättnad uppnås, och lagra det sedan i ungefär två dagar utan ytterligare luftning före användning.

pH-värdet för godtagbart utspädningsvatten bör ligga i intervallet 6–9.

Tillägg 5

Syntetiskt sediment – rekommendationer om beredning och lagring

I motsats till kraven i testmetod C.8 (40) rekommenderas att torvinnehållet i det syntetiska sedimentet ska vara 2 % i stället för 10 % torrsubstans, för att motsvara en låg till måttlig halt av organiska ämnen i naturliga sediment (58).

Den procentuella andelen torra beståndsdelar i det syntetiska sedimentet:

Beståndsdel | Egenskaper | % av torrt sediment

Torv | Vitmosstorv (Sphagnum), nedbrytningsgrad: medium, lufttorkad, inga synliga växtrester, finfördelad (partikelstorlek ≤ 0,5 mm) | 2 ± 0,5

Kvartssand | Kornstorlek: ≤ 2 mm, men > 50 % av partiklarna bör vara av storleken 50–200 μm | 76

Kaolinlera | Kaolinithalt ≥ 30 % | 22 ± 1

Foderkälla | Folia urticae, pulvriserade blad av Urtica sp. (nässla), finmalda (partikelstorlek ≤ 0,5 mm), eller en blandning av pulvriserade blad från Urtica sp. med alfacellulosa (1: 1), i enlighet med apoteksstandarder, lämplig som livsmedel, dessutom torrt sediment | 0,4–0,5 %

Kalcium-karbonat | CaCO3, i pulverform, kemiskt rent, dessutom torrt sediment | 0,05–1

Avjonat vatten | Konduktivitet ≤ 10 μS/cm, utöver torrt sediment | 30–50

Om man förväntar sig förhöjda koncentrationer av ammoniak, t.ex. om det är känt att testämnet hämmar nitrifikationen, kan det vara lämpligt att ersätta 50 % av det kväverika nässlelpulvret med cellulosa (t.ex. alfacellulosapulver, kemiskt rent, partikelstorlek ≤ 0,5 mm).

Beredning

Torven lufttorkas och mals ner till ett fint pulver (kornstorlek ≤ 0,5 mm, inga synliga växtrester). En suspension med den erforderliga mängden torvpulver bereds med en del av det avjonade vatten som ska tillsättas det torra sedimentet (en vattenvolym på 11,5 × torrvikt torv har visat sig användbar för att producera en rörbar torvsörja (8)) med hjälp av en högpresterande homogeniseringsapparat.

Suspensionens pH justeras till 5,5 ± 0,5 med CaCO3. Suspensionen konditioneras i minst två dagar med skonsam omrörning vid 20 ± 2 °C, för att stabilisera pH-värdet och skapa en stabil mikrobiell komponent. pH uppmäts på nytt och justeras vid behov till 6,0 ± 0,5 med CaCO3. Sedan blandas hela suspensionen med övriga torra beståndsdelar, med hänsyn tagen till de delar som används för spikning. Det återstående avjonade vattnet tillsätts för att erhålla ett homogent sediment. pH uppmäts på nytt och justeras vid behov till 6,5–7,5 med CaCO3. Om man förväntar sig utveckling av ammoniak kan det vara lämpligt att hålla pH-värdet i sedimentet under 7,0 (t.ex. mellan 6,0 och 6,5). Prover tas av sedimentet för att bestämma torrvikten och halten av organiskt kol. Om man förväntar sig utveckling av ammoniak, kan det syntetiska sedimentet konditioneras i sju dagar under samma betingelser som råder i det efterföljande testet (t.ex. ett förhållande mellan sediment och vatten på 1: 4, sedimentskiktets tjocklek som i testkärlen) innan det spikas med testämnet, dvs. det bör fyllas på med vatten, som bör luftas. I slutet av konditioneringsperioden bör det överliggande vattnet avlägsnas och kasseras. Prover tas av sedimentet för att bestämma torrvikten och halten av organiskt kol (t.ex. tre prov).

Därefter blandas den spikade kvartssanden med sedimentet för varje behandlingsnivå, och sedimentet fördelas till replikattestkärlen, som fylls på med testvatten (t.ex. förhållande mellan sediment och vatten 1:4, sedimentskiktets tjocklek samma som i testkärlen). Kärlen inkuberas sedan under samma betingelser som råder i det efterföljande testet. Det är nu stabiliseringsperioden inleds. Det överliggande vattnet bör luftas.

Den valda foderkällan bör läggas till före eller under spikningen av sedimentet med testämnet. Inledningsvis kan den blandas med torvsuspensionen (se ovan). Man kan dock undvika onödig försämring av foderkällan före tillsatsen av testorganismerna – t.ex. vid långa stabiliseringsperioder – genom att man påbörjar exponeringen så snart som möjligt efter fodertillsatsen. För att se till att fodret är i tillräcklig kontakt med testämnet bör foderkällan blandas med sedimentet senast samma dag som sedimentet spikas med testämnet. Undantag kan göras om stabiliseringsperiodens längd leder till en alltför stor mikrobiell nedbrytning av fodret innan testorganismerna tillförs. Prover tas av sedimentet för att bestämma torrvikten och halten av organiskt kol (t.ex. tre prover av det spikade sedimentet eller kontrollsedimentet).

Komponenternas (torv, sand, kaolin) torrvikt ska rapporteras i gram och i procent av den totala torrvikten.

Den volym vatten som ska tillsättas till de torra beståndsdelarna under beredningen av sedimentet bör också rapporteras i procent av den totala torrvikten (t.ex. 100 % torrvikt + 46 % vatten betyder att till 1000 g torrvikt tillsätts sammanlagt 460 ml vatten, vilket ger 1460 g vått sediment).

Lagring

Det syntetiska sedimentets torra beståndsdelar kan lagras i ett torrt och svalt utrymme vid rumstemperatur. Det färdigberedda våta sedimentet kan lagras (endast för fortsatt användning i kulturen) vid 4 ± 2 °C i mörker under en period på 2–4 veckor från beredningsdagen (8).

Sediment som spikats med testämne bör användas omedelbart, med undantag för om det finns information om att sedimentet i fråga kan förvaras utan att testämnets toxicitet och biotillgänglighet påverkas. Prover av spikat sediment kan lagras under de förhållanden som rekommenderas för testämnet i fråga fram till analysen.

Tillägg 6

Arter av oligochaeta som rekommenderas för bioackumuleringstester

Tubifex tubifex (MÜLLER), Tubificidae, Oligochaeta

Glattmasken Tubifex tubifex (Müller) (Tubificidae, Oligochaeta) lever i sötvattenssediment i rör som är fodrade med slem. Maskarna lever i dessa rör med huvudet nedåt och äter sedimentpartiklar från vilka de tillgodogör sig mikroorganismer och organiskt material. Bakdelen tjänar som andningsorgan och vajar normalt sett i det överliggande vattnet. Även om denna art lever i ett stort antal sedimenttyper över hela norra halvklotet, föredrar Tubifex tubifex relativt små kornstorlekar (59). Denna arts lämplighet för ekotoxikologisk testning beskrivs exempelvis i (8) (29) (31) (39) (60) (62) (63).

Odlingsmetoder

För att man ska få ett tillräckligt antal Tubifex tubifex för bioackumuleringstester måste maskarna hållas i en permanent laboratorieodling. Ett system som består av syntetiskt sediment baserat på syntetisk jord i enlighet med testmetod C.8 (40) och rekonstituerat vatten i enlighet med testmetod C.1 rekommenderas för odling av T. tubifex (8).

Behållare av glas eller rostfritt stål med en höjd på 12–20 cm kan användas som odlingskärl. Varje odlingsbehållare fylls med ett skikt fuktigt syntetiskt sediment som beretts enligt anvisningarna i tillägg 5. Sedimentskiktets djup bör vara lämpligt för maskarnas naturliga grävbeteende (minst 2 cm djup för T. tubifex). Rekonstituerat vatten tillsätts till systemet. Man bör undvika att störa sedimentet. Vattnet ska luftas försiktigt (t.ex. 2 bubblor per sekund med 0,45 μm-filtrerad luft) via en pasteurpipett placerad 2 cm ovanför sedimentets yta. Den rekommenderade odlingstemperaturen är 20 ± 2 °C.

Maskarna tillförs till odlingssystemet med en högsta djurtäthet på 20000 individer/m2 sedimentyta. En större djurtäthet kan leda till minskad tillväxt och fortplantning (43).

I odlingar med syntetiskt sediment måste maskarna utfodras. Foder bestående av finmalt fiskfoder, t.ex. TetraMin®, kan tjäna som tilläggsnäring (8); Klerks 1994, pers. medd. Utfodringsfrekvensen bör möjliggöra tillräcklig tillväxt och fortplantning och minimera ackumuleringen av ammoniak och svamptillväxt i odlingen. Utfodring bör ske två gånger per vecka (t.ex. 0,6–0,8 mg per cm2 sedimentyta). Praktiska erfarenheter har visat att applicering av foder som suspenderats och homogeniserats i avjonat vatten kan underlätta en homogen foderdistribution på sedimentytan i odlingsbehållarna.

För att undvika ackumulering av ammoniak bör det överliggande vattnet bytas ut via ett genomflödessystem, eller manuellt åtminstone en gång i veckan. Sedimentet bör bytas ut var tredje månad i stamodlingarna.

Provtagning av maskar från odlingen kan göras genom att sikta odlingssedimentet genom en 1 mm sikt om man endast behöver vuxna djur. För insamling av kokonger behövs en 0,5 mm sikt, och för juvenila maskar en 0,25 mm sikt. Siktarna kan placeras i rekonstituerat vatten efter det att sedimentet har passerat igenom dem. Maskarna lämnar nätet och kan därefter plockas upp ur vattnet med hjälp av en mjuk stålpincett eller en pipett med flampolerade kanter.

Endast intakta och tydligt identifierade exemplar av Tubifex tubifex (t.ex. (64)) används för att inleda ett test eller starta nya odlingar. Sjuka eller skadade maskar samt kokonger angripna av svamphyfer måste kastas bort.

En synkroniserad odling kan tillhandahålla maskar med specificerad ålder i lämpliga intervall när så önskas. Vid de valda intervallen (t.ex. varannan vecka) startas nya odlingar i separata kärl med djur i en viss ålder (t.ex. kokonger). Vid de odlingsbetingelser som beskrivs här når maskarna vuxen ålder efter 8–10 veckor. Odlingarna kan skördas när maskarna har producerat nya kokonger, t.ex. efter tio veckor. De insamlade vuxna djuren kan användas för tester, och nya kulturer kan startas med kokongerna.

Lumbriculus variegatus (MÜLLER), Lumbriculidae, Oligochaeta

Lumbriculus variegatus (Lumbriculidae, Oligochaeta) lever också i sötvattenssediment över hela världen och används allmänt för ekotoxikologisk testning. Information om arternas biologi, odlingsförhållanden och känslighet finns i (1) (6) (9) (36). Lumbriculus variegatus kan med vissa begränsningar också odlas i det syntetiska sediment som rekommenderas för T. tubifex enligt (8). Eftersom L. variegatus i naturen föredrar grövre sediment än T. tubifex (59) kan laboratorieodlingar med det syntetiska sediment som används för T. tubifex upphöra efter 4–6 månader. Praktiska erfarenheter visar att L. variegatus kan hållas i ett sandigt substrat (t.ex. kvartssand, fint grus) i ett genomflödessystem med fiskfoder som näringskälla under flera år utan att man behöver förnya substratet. En stor fördel med L. variegatus framför andra vattenlevande oligochaeter är dess snabba fortplantning, vilket leder till en snabbt ökande biomassa i laboratorieodlade populationer (1) (6) (9) (10).

Odlingsmetoder

Odlingsbetingelser för Lumbriculus variegatus beskrivs i detalj i Phipps m.fl. (1993) (10), Brunson m.fl. (1998) (28), ASTM (2000) (1), U.S. EPA (2000) (6). En kort sammanfattning av dessa betingelser ges nedan.

Maskarna kan odlas i stora akvarier (57–80 liter) vid 23 °C med fotoperiod på 16 timmar ljus (100–1000 lux) och 8 timmar mörker med dagligen förnyat naturligt vatten (45–50 liter per akvarium). Substratet bereds genom att oblekta bruna pappersservetter klipps till remsor, som sedan blandas med odlingsvatten i några sekunder, vilket leder till att man får små bitar av papperssubstrat. Detta substrat kan sedan omedelbart användas i odlingsakvarier för Lumbriculus genom att man täcker botten av akvariet med det, eller lagras fryst i avjonat vatten för senare användning. Nytt substrat i akvariet räcker i allmänhet i ungefär två månader.

Varje maskodling startas upp med 500–1000 maskar som utfodras med en 10 ml suspension innehållande 6 g yngelfoder för öring tre gånger per vecka under förnyelse- eller genomflödesförhållanden. Statiska eller semistatiska odlingar bör ha lägre utfodringsfrekvens för att förebygga tillväxt av bakterier och svamp. Foder och papperssubstrat bör analyseras med avseende på de ämnen som ska användas i bioackumuleringstesterna.

Under dessa förhållanden fördubblas vanligen antalet individer i odlingen på cirka 10–14 dagar.

Lumbriculus variegatus kan avlägsnas från odlingarna t.ex. genom att substratet överförs med ett finmaskigt nät, eller med hjälp av en glaspipett med bred spets (cirka 5 mm i diameter), till en separat bägare. Om man också överför substrat till denna bägare låter man bägaren som innehåller maskar och substrat stå över natten under genomflödesförhållanden, vilket gör att substratet avlägsnas från bägaren medan maskarna blir kvar på kärlets botten. De kan sedan överföras till nyligen beredda odlingsakvarier eller bearbetas ytterligare för testet enligt beskrivning i (1) och (6). Skador eller autotomi bör undvikas, t.ex. genom att man använder pipetter med flampolerade kanter eller tandläkarsonder av rostfritt stål vid hanteringen av maskarna.

En fråga som man bör kritiskt beakta vid användning av L. variegatus i bioackumuleringstest med sediment är dess reproduktionssätt (fragmentering (architomy) följt av regenerering (morphallaxis)). Resultatet av denna asexuella reproduktion är två delar som inte intar någon föda förrän den främre eller bakre delen regenererats (t.ex. (36)(37)). Detta innebär när det gäller L. variegatus att upptagningen av sediment och föroreningar genom födan eventuellt inte sker löpande som hos glattmaskar (Tubificidae), vilka inte fortplantar sig genom delning.

Därför bör en synkronisering utföras för att minimera okontrollerad reproduktion och regenerering, som båda leder till stora variationer i testresultaten. Denna variation kan inträffa om vissa individer, som har genomgått delning och därmed inte intar någon föda under en viss tid, i mindre grad exponeras för testkemikalien än andra individer som inte genomgår delning under testet, t.ex. (38). Maskarna bör delas på konstgjord väg 10–14 dagar före början av exponeringen (synkronisering) (65). Stora maskar bör användas som helst inte visar några tecken på att nyligen ha delats. Dessa maskar kan placeras på ett objektglas med en droppe odlingsvatten och skäras av på den mittersta kroppsregionen med en skalpell. Man bör se till att de bakre ändarna är av liknande storlek. Man bör sedan låta de bakre ändarna återbilda nya huvuden i ett kulturkärl som innehåller samma substrat som används i kulturen och rekonstituerat vatten tills exponeringen inleds. Tecknet på att regenereringen av nya främre delar pågår är att de synkroniserade maskarna gräver sig igenom i substratet (närvaron av återbildade huvuddelar kan bekräftas genom att ett representativt delprov granskas i ett binokulärt mikroskop). Testorganismerna kan därefter förväntas befinna sig i ett liknande fysiologiskt tillstånd. Detta innebär att när de synkroniserade maskarna regenererar genom morphallaxis under testets gång exponeras praktiskt taget alla djur i lika hög grad för det spikade sedimentet. De synkroniserade maskarna bör utfodras så snart de börjar gräva sig genom substratet, eller sju dagar efter delningen. Utfodringen bör vara jämförbar med den i de vanliga odlingarna, men det är tillrådligt att ge de synkroniserade maskarna samma foder som ska användas i testet. Maskarna bör hållas i samma temperatur som i testet, dvs. 20 ± 2 °C. Efter regenerering bör intakta hela maskar av liknande storlek som aktivt simmar eller kryper efter lätt mekanisk retning användas för testet. Skador eller autotomi bör undvikas, t.ex. genom att man använder pipetter med flampolerade kanter eller tandläkarsonder av rostfritt stål vid hanteringen av maskarna.

Vid användning av Lumbriculus variegatus i testet bör en ökning av antalet maskar ske under testet på grund av artens specifika fortplantningssätt, om betingelserna är lämpliga (6). Avsaknad av fortplantning i bioackumuleringstest med L. variegatus bör registreras och beaktas vid tolkningen av testresultaten.

Branchiura sowerbyi (BEDDARD), Tubificidae, Oligochaeta (ej validerad i ringtestet)

Branchiura sowerbyi lever i en mängd olika sedimenttyper i vattenmagasin, sjöar, dammar och floder, ursprungligen i tropiska områden. De finns också i varma vattenmassor på norra halvklotet. De är emellertid mer vanligt förekommande i gyttje-lersediment med hög halt av organiskt material. Maskarna lever i sedimentskiktet. Även maskarnas bakre ände är vanligen nergrävd. Denna art kan lätt identifieras på grund av gältrådarna på dess bakre del. Vuxna djur kan nå en längd på 9–11 cm och en vikt på 40–50 mg. Maskarna har en hög reproduktionstakt och uppvisar populationsfördubblingstider på mindre än två veckor under samma temperatur- och utfodringsförhållanden som beskrivs nedan (Aston m.fl., 1982 (65)). B. sowerbyi har använts i både toxicitets- och bioackumuleringsstudier (Marchese & Brinkhurst, 1996 (31) respektive Roghair m.fl., 1996, (67)).

Odlingsmetoder

En sammanfattning av odlingsbetingelserna för Branchiura sowerbyi återges nedan (tillhandahållna av Mercedes R. Marchese, INALI, Argentina, och Carla J. Roghair, RIVM, Nederländerna).

Man behöver inte hålla sig till en enda teknik för odling av testorganismerna. Organismerna kan odlas i oförorenade naturliga sediment (31). Praktiska erfarenheter har visat att ett medium bestående av naturligt sediment och sand förbättrar maskarnas tillstånd jämfört med rent naturligt sediment (32) (67). Trelitersbägare som innehåller 1500 ml sediment/vattenmedium bestående av 375 ml naturligt oförorenat sediment (ca 10 % halt av organiskt kol, ca 17 % partiklar ≤ 63 μm), 375 ml ren sand (M32) och 750 ml rekonstituerat eller avklorerat vattenledningsvatten kan användas för odlingen (31) (32) (67). Pappersservetter kan också användas som substrat i odlingarna, men populationstillväxten är då lägre än i naturligt sediment. I semistatiska system luftas vattenskiktet i bägaren långsamt, och det överliggande vattnet bör förnyas en gång per vecka.

Varje bägare innehåller till att börja med 25 unga maskar. Efter två månader plockas de stora maskarna ut från sedimentet med en pincett och placeras i en ny bägare med nyberett sediment/vattenmedium. Den gamla bägaren innehåller också kokonger och unga maskar. Upp till 400 unga maskar per bägare kan insamlas på detta sätt. Vuxna maskar kan användas för fortplantning under minst ett år.

Temperaturen i kulturerna ska hållas mellan 21–25 °C. Temperaturvariationerna bör hållas under ± 2 °C. Den tid som krävs för embryots utveckling från äggläggning till dess att de unga maskarna lämnar kokongerna är ungefär tre veckor vid 25 °C. Äggproduktionen per överlevande mask befanns för B. sowerbyi vara från 6,36 (31) till 11,2 (30) i gyttja vid 25 °C. Antalet ägg per kokong varierar mellan 1,8 till 2,8 (66) (69) eller upp till 8 (68).

Löst syre, vattnets hårdhet, temperatur och pH bör mätas varje vecka. Fiskfoder (t.ex. TetraMin®) kan läggas till ad libitum som suspension två eller tre gånger per vecka. Maskarna kan också ad lib-utfodras med tinad sallat.

En stor fördel med denna art är den höga individuella biomassan (upp till 40–50 mg våtvikt per individ). Därför kan denna art användas för testning av bioackumuleringen av icke-radioaktivmärkta testämnen. Den kan exponeras i de system som används för T. tubifex eller L. variegatus med en enda individ per replikat (11). I sådana fall bör dock antalet replikat ökas, såvida inte större testbehållare används (11). Även giltighetskriteriet avseende grävbeteendet behöver justeras för denna art.

LITTERATUR

(1) ASTM International (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates, E 1688-00a. I ASTM International 2004 Annual Book of Standards. Vol. 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA.

(2) Europeiska kommissionen (EC) (2003). Tekniska riktlinjer till stöd för kommissionens direktiv 93/67/EEG om riskbedömning för nya anmälda ämnen, kommissionens förordning (EG) nr 1488/94 om riskbedömning för existerande ämnen samt Europaparlamentets och rådets direktiv 98/8/EG om utsläppande av biocidprodukter på marknaden, del I–IV. Byrån för Europeiska gemenskapernas officiella publikationer, Luxemburg.

(3) OECD (1992a). Report of the OECD workshop on effects assessment of chemicals in sediment. OECD Monographs No. 60. Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD), Paris.

(4) Ingersoll, C. G., Ankley, G. T., Benoit D. A., Brunson, E. L., Burton, G. A., Dwyer, F. J., Hoke, R. A., Landrum, P. F., Norberg-King, T. J. och Winger, P. V. (1996). Toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants using freshwater invertebrates: A review of methods and applications. Environ. Toxicol. Chem. 14, 1885–1894.

(5) Kapitel C.13 i denna bilaga, Biokoncentration: Genomflödesprovning med fisk.

(6) U.S. EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Andra upplagan. EPA 600/R-99/064, U.S. Environmental Protection Agency, Duluth, MN, mars 2000.

(7) Kapitel C.27 i denna bilaga, Toxicitetstest i sediment- och vattenfas på chironomidlarver med spikat sediment

(8) Egeler, Ph., Römbke, J., Meller, M., Knacker, Th., Franke, C., Studinger, G. och Nagel, R. (1997). Bioaccumulation of lindane and hexachlorobenzene by tubificid sludgeworms (Oligochaeta) under standardised laboratory conditions. Chemosphere 35, 835–852.

(9) Ingersoll, C. G., Brunson, E. L., Wang N., Dwyer, F. J., Ankley, G. T., Mount D. R., Huckins J., Petty, J. och Landrum, P. F. (2003). Uptake and depuration of nonionic organic contaminants from sediment by the oligochaete, Lumbriculus variegatus. Environmental Toxicology and Chemistry 22, 872–885.

(10) Phipps, G. L., Ankley, G. T., Benoit, D. A. och Mattson, V. R. (1993). Use of the aquatic Oligochaete Lumbriculus variegatus for assessing the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants. Environ.Toxicol. Chem. 12, 269–279.

(11) Egeler, Ph., Römbke, J., Knacker, Th., Franke, C. och Studinger, G. (1999). Workshop on Bioaccumulation: Sediment test using benthic oligochaetes, 26–27 april 1999, Hochheim/Main, Tyskland. Report on the R+D-project No. 298 67 419, Umweltbundesamt, Berlin.

(12) Egeler, Ph., Meller, M., Schallnaß, H. J. och Gilberg, D. (2006). Validation of a sediment bioaccumulation test with endobenthic aquatic oligochaetes by an international ring test. Rapport till den federala miljöbyrån (Umweltbundesamt Dessau), R&D nr: 202 67 437.

(13) Kelly, J. R., Levine, S. N., Buttel, L. A., Kelly, A. C., Rudnick, D. T. och Morton, R. D. (1990). Effects of tributyltin within a Thalassia seagrass ecosystem. Estuaries 13, 301–310.

(14) Nendza, M. (1991). QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log Kow/log BCF correlations. I: R. Nagel och R. Loskill (red.): Bioaccumulation in aquatic systems. Contributions to the assessment. Proceedings of an international workshop, Berlin 1990. VCH, Weinheim.

(15) Landrum, P. F., Lee II, H. och Lydy, M. J. (1992). Toxicokinetics in aquatic systems: Model comparisons and use in hazard assessment. Environ. Toxicol. Chem. 11, 1709–1725.

(16) Markwell, R. D., Connell, D. W. och Gabric, A. J. (1989). Bioaccumulation of lipophilic compounds from sediments by oligochaetes. Wat. Res. 23, 1443–1450.

(17) Gabric, A. J., Connell, D. W. och Bell, P. R. F. (1990). A kinetic model for bioconcentration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24, 1225–1231.

(18) Kukkonen, J. och Landrum, P. F. (1994). Toxicokinetics and toxicity of sediment-associated Pyrene to Lumbriculus variegatus (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 13, 1457–1468.

(19) Franke, C., Studinger, G., Berger, G., Böhling, S., Bruckmann, U., Cohors-Fresenborg, D. och Jöhncke, U. (1994). The assessment of bioaccumulation. Chemosphere 29, 1501–1514.

(20) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.

(21) U.S. EPA (1996). Special Considerations for Conducting Aquatic Laboratory Studies. Ecological Effects Test Guidelines. OPPTS 850.1000. Public Draft. EPA 712-C-96-113. U.S. Environmental Protection Agency.

(22) Följande kapitel i denna bilaga: Kapitel A.4, Ångtryck Kapitel A.5 Ytspänning Kapitel A.6, Vattenlöslighet Kapitel A.8, Fördelningskoefficient, skakkolvmetoden Kapitel A.24, Fördelningskoefficient, HPLC-metoden Kapitel C.7, Nedbrytning – abiotisk nedbrytning: hydrolys som funktion av pH. Kapitel C.4 A–F Bestämning av lätt bionedbrytbarhet Kapitel C.19 Uppskattning av adsorptionskoefficienten (Koc) i jord och avloppsslam med användning av högtrycksvätskekromatografi (HPLC) Kapitel C.29, Lätt bionedbrytbarhet – CO2 i förslutna kärl (headspace-test)

(23) OECD (1996). Direct phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals No. 3. OECD, Paris.

(24) Antoine, M. D., Dewanathan, S. och Patonay, G. (1991). Determination of critical micelles concentration of surfactants using a near-infrared hydrophobicity probe. Microchem. J. 43, 165–172.

(25) Beek, B., S. Boehling, U. Bruckmann, C. Franke, U. Joehncke och G. Studinger (2000). The assessment of bioaccumulation. I Hutzinger, O. (red.), The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2, Del J (volymredaktör: B. Beek): Bioaccumulation – New Aspects and Developments. Springer-Verlag Berlin Heidelberg: 235–276.

(26) Spacie, A. och Hamelink, J. L. (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309–320.

(27) Hawker, D. W. och Connell, D. W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22, 701–707.

(28) Brunson, E. L., Canfield, T. J., Ingersoll, C. J. och Kemble, N. E. (1998). Assessing the bioaccumulation of contaminants from sediments of the Upper Mississippi river using field-collected oligochaetes and laboratory-exposed Lumbriculus variegatus. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 35, 191–201.

(29) Reynoldson, T. B., Thompson, S. P. och Bamsey, J. L. (1991). A sediment bioassay using the tubificid oligochaete worm Tubifex tubifex. Environ. Toxicol. Chem. 10, 1061–1072.

(30) Aston, R. J. och Milner, A. G. P. (1981). Conditions for the culture of Branchiura sowerbyi (Oligochaeta: Tubificidae) in activated sludge. Aquaculture 26, 155–160.

(31) Marchese, M. R. och Brinkhurst, R. O. (1996). A comparison of two tubificid species as candidates for sublethal bioassay tests relevant to subtropical and tropical regions. Hydrobiologia 334, 163–168.

(32) Roghair, C. J. och Buijze, A. (1994). Development of sediment toxicity tests. IV. A bioassay to determine the toxicity of field sediments to the oligochaete worm Branchiura sowerbyi. RIVM Report 719102027.

(33) Kapitel C.1 i denna bilaga, Test avseende akut toxicitet för fisk.

(34) OECD (1992c). Guidelines for Testing of Chemicals No. 210. Fish, Early-life Stage Toxicity Test. OECD, Paris.

(35) Kaster, J. L., Klump, J. V., Meyer, J., Krezoski, J. och Smith, M. E. (1984). Comparison of defecation rates of Limnodrilus hoffmeisteri using two different methods. Hydrobiologia 11, 181–184.

(36) Leppänen, M. T. och Kukkonen, J. V. K. 1998: Factors affecting feeding rate, reproduction and growth of an oligochaete Lumbriculus variegatus (Müller). Hydrobiologia 377, 183–194.

(37) Leppänen, M. T. och Kukkonen, J. V. K. 1998: Relationship between reproduction, sediment type and feeding activity of Lumbriculus variegatus (Müller): Implications for sediment toxicity testing. Environ. Toxicol. Chem. 17, 2196–2202.

(38) Leppänen, M. T. och Kukkonen, J. V. K. (1998). Relative importance of ingested sediment and porewater as bioaccumulation routes for pyrene to oligochaete (Lumbriculus variegatus, Müller). Environ. Sci. Toxicol. 32, 1503–1508.

(39) Martinez-Madrid, M., Rodriguez, P., Perez-Iglesias, J. I. och Navarro, E. (1999). Sediment toxicity bioassays for assessment of contaminated sites in the Nervion river (Northern Spain). 2. Tubifex tubifex (Müller) reproduction sediment bioassay. Ecotoxicology 8, 111–124.

(40) Kapitel C.8 i denna bilaga, Toxicitet hos daggmaskar.

(41) Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxicity test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30.

(42) Landrum, P. F. (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod Pontoporeia hoyi. Environ. Sci. Toxicol. 23, 588–595.

(43) Poddubnaya, T. L. (1980). Life cycles of mass species of Tubificidae (Oligochaeta). I: R. O. Brinkhurst och D. G. Cook (red.): Aquatic Oligochaeta Biology, 175–184. Plenum Press, New York.

(44) ASTM (1998). Standard guide for collection, storage, characterisation, and manipulation of sediment for toxicological testing. American Society for Testing and Materials, E 1391-94.

(45) Hooftman, R. N., van de Guchte, K. och Roghair, C. J. (1993). Development of ecotoxicological test systems to assess contaminated sediments. Joint report no. 1: Acute and (sub)chronic tests with the model compound chlorpyrifos. RIVM-719102022.

(46) Franke, C. (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk assessment?. Chemosphere 32, 1897–1905.

(47) Mount, D. R., Dawson, T. D. och Burkhard, L. P. (1999). Implications of gut purging for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with Lumbriculus variegatus. Environ. Toxicol. Chem. 18, 1244–1249.

(48) Randall, R. C., Lee II, H., Ozretich, R. J., Lake, J. L. och Pruell, R. J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Environ.Toxicol. Chem. 10, 1431–1436.

(49) Gardner, W. S., Frez, W. A., Cichocki, E. A. och Parrish, C. C. (1985). Micromethods for lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography, 30, 1099–1105.

(50) Bligh, E. G. och Dyer, W. J. (1959). A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911–917.

(51) De Boer, J., Smedes, F., Wells, D. och Allan, A. (1999). Report on the QUASH interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shellfish. Round 1 SBT-2. Exercise 1000. EU, Standards, Measurement and Testing Programme.

(52) Kristensen, P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Vandkvalitetsinstituttet, Danmark.

(53) Zok, S., Görge, G., Kalsch, W. och Nagel, R. (1991). Bioconcentration, metabolism and toxicity of substituted anilines in the zebrafish (Brachydanio rerio). Sci. Total Environment 109/110, 411–421

(54) Nagel, R. (1988). Umweltchemikalien und Fische – Beiträge zu einer Bewertung. Habilitationsschrift, Johannes Gutenberg-Universität Mainz, Tyskland.

(55) Janssen, M. P. M., A. Bruins, T. H. De Vries och Van Straalen, N. M. (1991). Comparison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20, 305–312.

(56) Van Brummelen, T. C. och Van Straalen, N. M. (1996). Uptake and elimination of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod Porcellio scaber. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 31, 277–285.

(57) Sterenborg, I., Vork, N. A., Verkade, S. K., Van Gestel, C. A. M. och Van Straalen, N. M. (2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail Orchesella cincta. Environ. Toxicol. Chemistry 22, 1167–1171.

(58) Suedel, B. C. och Rodgers, J. H. (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13, 1163–1175.

(59) Wachs, B. (1967). Die Oligochaeten-Fauna der Fließgewässer unter besonderer Berücksichtigung der Beziehung zwischen der Tubificiden-Besiedlung und dem Substrat. Arch. Hydr. 63, 310–386.

(60) Oliver, B. G. (1987). Biouptake of chlorinated hydrocarbons from laboratory-spiked and field sediments by oligochaete worms. Environ. Sci. Technol. 21, 785–790.

(61) Chapman, P. M., Farrell, M. A. och Brinkhurst, R. O. (1982a). Relative tolerances of selected aquatic oligochaetes to individual pollutants and environmental factors. Aquatic Toxicology 2, 47–67.

(62) Chapman, P. M., Farrell, M. A. och Brinkhurst, R. O. (1982b). Relative tolerances of selected aquatic oligochaetes to combinations of pollutants and environmental factors. Aquatic Toxicology 2, 69–78.

(63) Rodriguez, P. och Reynoldson, T. B. (1999). Laboratory methods and criteria for sediment bioassessment. I: A. Mudroch, J. M. Azcue och P. Mudroch (red.): Manual of Bioassessment of aquatic sediment quality. Lewis Publishers, Boca Raton, CRC Press LLC.

(64) Brinkhurst, R. O. (1971). A guide for the identification of British aquatic oligochaeta. Freshw. Biol. Assoc., Sci. Publ. No. 22.

(65) Egeler, Ph., Meller, M., Schallnaß, H. J. och Gilberg, D. (2005). Validation of a sediment toxicity test with the endobenthic aquatic oligochaete Lumbriculus variegatus by an international ring test. I samarbete med R. Nagel och B. Karaoglan. Rapport till den federala miljöbyrån (Umweltbundesamt Berlin), R&D nr: 202 67 429.

(66) Aston, R. J., Sadler, K. och Milner, A. G. P. (1982). The effect of temperature on the culture of Branchiura sowerbyi (Oligochaeta: Tubificidae) on activated sludge. Aquaculture 29, 137–145.

(67) Roghair, C. J., Buijze, A., Huys, M. P. A., Wolters-Balk, M. A. H., Yedema, E. S. E. och Hermens, J. L. M. (1996). Toxicity and toxicokinetics for benthic organisms; II: QSAR for base-line toxicity to the midge Chironomus riparius and the tubificid oligochaete worm Branchiura sowerbyi. RIVM Report 719101026.

(68) Aston, R. J. (1984). The culture of Branchiura sowerbyi (Tubificidae, Oligochaeta) using cellulose substrate. Aquaculture 40, 89–94.

(69) Bonacina, C., Pasteris, A., Bonomi, G. och Marzuoli, D. (1994). Quantitative observations on the population ecology of Branchiura sowerbyi (Oligochaeta, Tubificidae). Hydrobiologia, 278, 267–274