EU-förordning

Kommissionens förordning (EU) 2017/735 av den 14 februari 2017 om ändring, för anpassning till den tekniska utvecklingen, av förordning (EG) nr 440/2008 om testmetoder enligt Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach) (Text av betydelse för EES)

CELEX: 32017R0735
Typ: EU-förordning
Datum: 20170214
EUT: L 112

Hänvisat till av

eurlex

EUROPEISKA KOMMISSIONEN HAR ANTAGIT DENNA FÖRORDNING

med beaktande av fördraget om Europeiska unionens funktionssätt,

med beaktande av Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 av den 18 december 2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach), inrättande av en europeisk kemikaliemyndighet, ändring av direktiv 1999/45/EG och upphävande av rådets förordning (EEG) nr 793/93 och kommissionens förordning (EG) nr 1488/94 samt rådets direktiv 76/769/EEG och kommissionens direktiv 91/155/EEG, 93/67/EEG, 93/105/EG och 2000/21/EG, särskilt artikel 13.2, och

1 I kommissionens förordning (EG) nr 440/2008 fastställs testmetoder som ska användas för tillämpning av förordning (EG) nr 1907/2006 när det gäller bestämning av kemikaliers fysikalisk-kemiska egenskaper, toxicitet och ekotoxicitet.

2 Det är nödvändigt att uppdatera förordning (EG) nr 440/2008 för att införa nya och uppdaterade testmetoder som nyligen har antagits av Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD), i syfte att ta hänsyn till tekniska framsteg och säkerställa en minskning av antalet djur som används för försök, i enlighet med Europaparlamentets och rådets direktiv 2010/63/EU. Samråd har förts med berörda parter om detta utkast.

3 Anpassningen till tekniska framsteg omfattar tjugo testmetoder: en ny metod för bestämning av en fysikalisk-kemisk egenskap, fem nya testmetoder och en uppdaterad testmetod för bedömning av ekotoxicitet, två uppdaterade testmetoder för bedömning av omvandling, spridning och fördelning i miljön samt fyra nya och sju uppdaterade testmetoder för bestämning av effekter på människors hälsa.

4 OECD ser regelbundet över sina testriktlinjer för att identifiera dem som är vetenskapligt föråldrade. Genom denna anpassning till tekniska framsteg utgår sex testmetoder för vilka de motsvarande testriktlinjerna från OECD har annullerats.

5 Förordning (EG) nr 440/2008 bör därför ändras i enlighet med detta.

6 De åtgärder som föreskrivs i denna förordning är förenliga med yttrandet från den kommitté som inrättats i enlighet med artikel 133 i förordning (EG) nr 1907/2006.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

Bilagan till förordning (EG) nr 440/2008 ska ändras i enlighet med bilagan till den här förordningen.

Artikel 2

Denna förordning träder i kraft den tjugonde dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning.

1 EUT L 396, 30.12.2006, s. 1.

2 Kommissionens förordning (EG) nr 440/2008 av den 30 maj 2008 om testmetoder enligt Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach) (EUT L 142, 31.5.2008, s. 1).

3 Europaparlamentets och rådets direktiv 2010/63/EU av den 22 september 2010 om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål (EUT L 276, 20.10.2010, s. 33).

BILAGA

Bilagan till förordning (EG) nr 440/2008 ska ändras på följande sätt:

1 I del A ska följande kapitel läggas till:

2 I del B ska kapitel B.5 ersättas med följande:

3 I del B ska kapitel B.10 ersättas med följande:

4 I del B ska kapitel B.11 ersättas med följande:

5 I del B ska kapitel B.12 ersättas med följande:

6 I del B ska kapitel B.15 utgå.

7 I del B ska kapitel B.16 utgå.

8 I del B ska kapitel B.18 utgå.

9 I del B ska kapitel B.19 utgå.

10 I del B ska kapitel B.20 utgå.

11 I del B ska kapitel B.24 utgå.

12 I del B ska kapitel B.47 ersättas med följande:

13 I del B ska kapitel B.48 ersättas med följande:

14 I del B ska kapitel B.49 ersättas med följande:

15 I del B ska följande kapitel läggas till:

16 I del C ska kapitel C. 13 ersättas med följande:

17 I del C ska kapitel C.20 ersättas med följande:

18 I del C ska punkt 66 i kapitel C.29 ersättas med följande:

19 I del C ska följande kapitel läggas till:

1 Inget värde för 20 °C är tillgängligt, men det kan antas att mätresultatets variationer är högre än det förväntade temperaturberoendet.

3 Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 av den 18 december 2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach), inrättande av en europeisk kemikaliemyndighet, ändring av direktiv 1999/45/EG och upphävande av rådets förordning (EEG) nr 793/93 och kommissionens förordning (EG) nr 1488/94 samt rådets direktiv 76/769/EEG och kommissionens direktiv 91/155/EEG, 93/67/EEG, 93/105/EG och 2000/21/EG. EUT L 304, 22.11.2007, s. 1.

4 USA:s Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods

5 Området för hornhinneopacitet bör noteras

7 Om en integrerad testningsstrategi tillämpas med avseende på ögonirritation enligt Reach, se även Echas vägledning om informationskrav och kemikaliesäkerhetsbedömningar, kapitel R.7a: Särskild vägledning om endpoints: http://echa.europa.eu/documents/10162/13632/information_requirements_r7a_en.pdf

8 Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1272/2008 av den 16 december 2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen och blandningar, ändring och upphävande av direktiven 67/548/EEG och 1999/45/EG samt ändring av förordning (EG) nr 1907/2006 (EUT L 353, 31.12.2008, s. 1).

9 Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1272/2008 av den 16 december 2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen och blandningar, ändring och upphävande av direktiven 67/548/EEG och 1999/45/EG samt ändring av förordning (EG) nr 1907/2006 (EUT L 353, 31.12.2008, s. 1).

10 Högsta medelvärde som observerats vid någon tidpunkt.

12 Högsta medelvärde som observerats vid någon tidpunkt (baserat på opacitetsvärden enligt tabell 1).

14 Baserat på poäng som anges i tabell 2.

16 Kombinationer som är mindre sannolika.

19 Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1272/2008 av den 16 december 2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen och blandningar, ändring och upphävande av direktiven 67/548/EEG och 1999/45/EG samt ändring av förordning (EG) nr 1907/2006 (EUT L 353, 31.12.2008, s. 1).

20 Medelvärde avser aritmetiskt medelvärde genomgående i dokumentet.

22 Siffrorna avser statistiskt genererade gränsvärden och har inget samband med mätningens precision.

23 En DPRA-förutsägelse bör övervägas inom ramen för en IATA och enligt anvisningarna i punkterna 9 och 12.

26 Siffrorna avser statistiskt genererade gränsvärden och har inget samband med mätningens precision.

27 En DPRA-förutsägelse bör övervägas inom ramen för en IATA och enligt anvisningarna i punkterna 9 och 12.

29 Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1272/2008 av den 16 december 2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen och blandningar, ändring och upphävande av direktiven 67/548/EEG och 1999/45/EG samt ändring av förordning (EG) nr 1907/2006 (EUT L 353, 31.12.2008, s. 1).

30 Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1272/2008 av den 16 december 2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen och blandningar, ändring och upphävande av direktiven 67/548/EEG och 1999/45/EG samt ändring av förordning (EG) nr 1907/2006 (EUT L 353, 31.12.2008, s. 1).

31 Se tillägg 1 för definitioner och enheter.

32 Benämns ibland POW: bestäms genom en metod med skakning av kolv enligt TM A.8 (4), genom en HPLC-metod enligt TM A.24 (5) och genom en metod med långsam omrörning enligt TM A.23 (6). Ibland används generator-kolonn-tekniken för bestämning av log KOW. Det finns endast ett begränsat antal undersökningar som använder denna teknik, främst för klorerade bifenyler och dibensodioxiner (t.ex. Li och Doucette, 1993) (3). För ämnen som kan joniseras bör log KOW avse den joniserade formen.

33 Se tillägg 1 för definitioner och enheter.

34 TLC: tunnskiktskromatografi, HPLC: vätskekromatografi och GC: gaskromatografi.

35 Enligt vissa regelverk kan analysen av metaboliter vara obligatoriska om vissa villkor är uppfyllda (jfr punkt 65).

36 Uppmätta koncentrationer i vatten under upptagningsfasen bör helst vara över kvantifieringsgränsen så att mer än en halveringstid av kroppsbelastningen kan mätas i undersökningens utsöndringsfas.

37 Se tillägg 1 för definitioner och enheter.

38 De flesta testämnen bör helst inte orsaka detektion i kontrollvattnet. Bakgrundskoncentrationerna bör endast vara relevanta för naturligt förekommande material (t.ex. vissa metaller) och ämnen som finns överallt i miljön.

39 Om det är uppenbart att första ordningens kinetik inte följs ska mer komplexa modeller tillämpas (se litteraturhänvisningar i tillägg 5) och råd inhämtas från biostatistiker.

40 Upptagningen kan begränsas av koncentrationer med låg exponering på grund av dålig upplösningsförmåga i vatten i biokoncentrationstestet, medan mycket högre exponeringskoncentrationer kan uppnås med kosttestet.

41 För multikomponentämnen, UVCB och blandningar bör vattenlösligheten för varje relevant komponent övervägas för att avgöra lämpliga exponeringskoncentrationer.

42 TOC inkluderar organiskt kol från partiklar och löst organiskt kol, dvs. TOC = POC + DOC.

43 Om ett lösningsmedel eller ett solubiliseringsmedel används bör det organiska kol som härrör från agenten läggas till det organiska kolet i testämnet för att bedöma koncentrationen av organiskt kol i testkärlen, men detta rekommenderas inte generellt.

44 Om fetthalten inte analyseras hos samma fiskar som testämnet bör fisken åtminstone vara av liknande vikt och (i förekommande fall) kön.

45 Detta alternativ får endast användas om antalet fiskar i alla testgrupper är ungefär lika och fisken avlägsnas enligt samma mönster och utfodras på samma sätt. Detta säkerställer att fiskens tillväxt i alla testgrupper är liknande, om den testade koncentrationen ligger under toxicitetsintervallet. Om tillväxten är liknande förväntas även fetthalten vara liknande. En annorlunda tillväxt i kontrollgruppen skulle visa på en ämneseffekt och då blir undersökningen ogiltig.

46 Förutom vikt bör totallängd registreras, eftersom jämförelser av längdökningar under testperioden är en bra indikator på huruvida en negativ effekt har uppstått.

47 Ett t-test av tillväxtkonstanterna kan utföras för att undersöka om tillväxten skiljer sig mellan kontroll- och testgrupperna, eller ett F-test om man analyserar variansen. Vid behov kan ett F-test eller sannolikhetsförhållandet användas som underlag för valet av lämplig tillväxtmodell (OECD monograf 54, (32).

48 Dessa procentsiffror förutsätter att analysmodellerna är tillförlitliga och att halveringstiden är < 14 dagar. Om analysmodellerna är mindre tillförlitliga eller halveringstiden ökas (stort) blir dessa siffror högre.

49 CI konfidensintervall (om en uppskattning är möjlig)

50 SD Standardavvikelse (om en uppskattning är möjlig)

62 Det minimerade testet kan användas för att visa snabb metabolism när det är känt att detta är sannolikt.

63 När endast två datapunkter mäts kan uppskattningar av konfidensgränserna för BCFkm göras med hjälp av bootstrappingmetoder. När även mellanliggande datapunkter finns tillgängliga kan konfidensgränserna för BCFkm beräknas som i det fullständiga testet.

64 Se tillägg 1 för definitioner och enheter.

65 Vid tillämpningen av förordning (EG) nr 1907/2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach) (EGT L 396, 30.12.2006, s. 1) tas denna fråga upp i Vägledning om informationskrav och kemikaliesäkerhetsbedömning, kapitel R.7c, R.7.10.3.1, R.7.10.4.1 och figur R7.10-2.

66 De flesta testämnen bör helst inte kunna detekteras i kontrollvattnet. Bakgrundskoncentrationerna bör endast vara relevanta för naturligt förekommande material (t.ex. vissa metaller) och ämnen som finns överallt i miljön.

67 Eftersom BMF definieras som förhållandet mellan ett ämnes koncentration i en organism och i organismens foder vid stabilt tillstånd beaktas fetthalten genom en korrigering för fetthalten i organismen och i fodret, och beskrivs därför mer exakt som en korrigering. Denna metod skiljer sig från normalisering till en fastställd fetthalt hos organismen, vilket görs i biokoncentrationstestet med vattenexponering.

68 Dessutom bör total längd registreras under testet, eftersom detta är en bra indikator på eventuella negativa effekter.

69 HCB finns med i bilagorna A och C till Stockholmskonventionen och i bilagorna I och III till förordning (EG) nr 850/2004 om långlivade organiska föreningar (EUT L 158, 30.4.2004, s. 7).

70 För snabb tillväxt under upptagningsfasen minskas det faktiska utfodringsintervallet under det intervall som fastställdes i början av exponeringen.

71 I en vattenexponeringsundersökning motsvarar en halveringstid på 14 dagar en BCF på cirka 10000 l/kg med användning av fisk på 1 g med en motsvarande upptagning på omkring 500 l/kg/dag (enligt den ekvation som tagits fram av Sijm m.fl.(46)).

72 Eftersom de faktiska interna koncentrationerna inte kan bestämmas förrän testet har utförts krävs en uppskattning av den förväntade interna koncentrationen (t.ex. baserat på förväntad BMF och koncentration i fodret, jfr ekvation A5.8 i tillägg 5).

73 Förekomst av testämnet i testmediet till följd av fiskens avföring eller läckage från fodret kanske inte kan undvikas helt. Ett alternativ är därför att mäta ämneskoncentrationen i vattnet i slutet av upptagningsperioden, särskilt om en semistatisk utformning används, för att fastställa om vattenexponering har uppstått.

74 Denna metod är specifik för testet med exponering via föda och skiljer sig från det förfarande som används vid exponering via vatten. För att undvika förvirring har därför begreppet korrigering använts i stället för normalisering – se även fotnot i piunkt 106.

75 Ett t-test av tillväxtkonstanterna kan utföras för att undersöka om tillväxten skiljer sig mellan kontroll- och testgrupperna, eller ett F-test om man analyserar variansen. Vid behov kan ett F-test eller sannolikhetsförhållandet användas som underlag för valet av lämplig tillväxtmodell (OECD monograph 54, (32).

76 En foderanalysteknik för protein- och fetthalt samt innehåll av råfibrer och aska. Denna information finns vanligen tillgänglig från foderleverantören.

77 CI konfidensintervall (om en uppskattning är möjlig)

78 SD Standardavvikelse (om en uppskattning är möjlig)

92 Andra Daphnia-arter kan användas förutsatt att de uppfyller tillämpliga giltighetskriterier (giltighetskriteriet för reproduktionskapaciteten i kontrollgrupperna bör vara relevant för alla arter). Om andra arter av Daphnia används ska de identifieras ordentligt och det ska motiveras varför de används.

93 Oavsiktlig dödlighet med känd orsak: icke-kemikalierelaterad dödlighet som orsakas av en oavsiktlig händelse (dvs. känd orsak).

94 Oavsiktlig dödlighet utan känd orsak: icke-kemikalierelaterad dödlighet utan känd orsak.

Tillägg

DEFINITIONER

Tillägg 1

DEFINITIONER

Tillägg 2.

FORMLER FÖR BESTÄMNING AV CYTOTOXICITET

Mitotiskt index (MI):

Relativ ökning av celltal (RICC) eller relativ populationsfördubbling (RPD) rekommenderas, eftersom den andel av cellpopulationen som har delat sig beaktas i båda metoderna.

där

Populationsfördubbling: [log (Cellantal efter behandling ÷ Ursprungligt cellantal)] ÷ log 2

En RICC eller en RPD på 53 % indikerar t.ex. 47 % cytotoxicitet/cytostas, och 55 % cytotoxicitet/cytostas mätt med MI innebär att det faktiska MI är 45 % av kontrollen.

I alla händelser bör antalet celler före behandling mätas, vilket även gäller behandlade och negativa kontrollodlingar.

Tidigare användes RCC (dvs. antalet celler i behandlade kulturer/antalet celler i kontrollkulturer) som cytotoxicitetsparameter, men rekommenderas inte längre eftersom cytotoxiciteten kan underskattas enligt detta mått.

I negativa kontrollkulturer bör populationsfördubblingstiden överensstämma med kravet på provtagning av celler efter behandling vid en tidpunkt som motsvarar cirka 1,5 gånger den normala cellcykelns längd. Det mitotiska indexet bör vara tillräckligt högt för att få ett tillräckligt antal celler i mitos och tillförlitligt beräkna en minskning med 50 %.

Tillägg 1

DEFINITIONER

Tillägg 2

UTFORMNING AV FAKTORFÖRSÖK FÖR IDENTIFIERING AV SKILLNADER MELLAN KÖNEN I IN VIVO-TEST MED AVSEENDE PÅ KROMOSOMAVVIKELSER

Utformning och analys av faktorförsök

I denna utformning testas minst fem hanar och fem honor vid varje koncentrationsnivå, vilket innebär att minst 40 djur måste användas (20 hanar och 20 honor plus relevanta positiva kontroller).

Detta är ett av de enklaste faktorförsöken och det motsvarar en tvåvägs-variansanalys med kön och koncentrationsnivå som huvudsakliga effekter. Data kan analyseras med hjälp av många vanliga statistiska programvarupaket såsom SPSS, SAS, STATA, Genstat samt med hjälp av R.

Analysen delar upp variationen i datauppsättningen mellan kön, koncentrationer och interaktionen mellan kön och koncentrationer. Var och en av termerna testas mot en uppskattning av variationerna mellan replikatdjuren inom djurgrupper av samma kön som ges samma koncentration. Fullständig information om den underliggande metoden finns i många statistiska läroböcker (se litteraturhänvisningar) och i hjälpavsnitt i statistiska paket.

Nästa steg i analysen är att kontrollera interaktionstermen kön x koncentration i ANOVA tabellen. I avsaknad av en signifikant interaktionsterm ger de kombinerade värdena mellan könen eller koncentrationsnivåerna giltiga statistiska test mellan nivåerna, baserat på den sammanslagna inomgruppsvariationen enligt ANOVA.

Nästa steg i analysen är att dela upp uppskattningen av variationen mellan koncentrationerna i kontraster, som möjliggör ett test avseende linjära och kvadratiska kontraster i responsen mellan koncentrationsnivåerna. Om en signifikant variation i kön x koncentration förekommer kan även denna term delas upp i interaktionskontraster enligt följande: linjära kontraster x kön och kvadratiska kontraster x kön. Med hjälp av dessa termer kan man testa om koncentrationsresponsen är parallell för de två könen eller om den skiljer sig åt.

Uppskattningen av den sammanslagna inomgruppsvariationen kan användas för parvisa test av skillnaderna mellan medelvärdena. Dessa jämförelser kan göras mellan medelvärdena för könen och medelvärdena för de olika koncentrationsnivåerna, t.ex. för jämförelser med de negativa kontrollnivåerna. Om det finns en signifikant interaktion kan man jämföra medelvärden för olika koncentrationer för samma kön eller medelvärden för båda könen vid samma koncentration.

Litteraturhänvisningar

Teori, utformning, metod, analys och tolkning av faktorförsök diskuteras i många statistiska läroböcker, från den enklaste tvåfaktorsanalysen till mer komplexa former som används i försöksutformningsmetoder. Följande förteckning är icke-uttömmande: Vissa böcker innehåller etablerade exempel på jämförbara utformningar, i vissa fall med koder för att köra analysen med hjälp av olika programvarupaket.

Box, G.E.P, Hunter, W.G. och Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.

Box G.E.P. och Draper, N.R. (1987). Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.

Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007). Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.

Mead, R. (1990). The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.

Montgomery D.C. (1997). Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.

Winer, B.J. (1971). Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.

Wu, C.F.J och Hamada, M.S. (2009). Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.

1 Statistiker som använder modelleringsmetoder som allmänna linjära modeller (GLM) kan använda analysen på ett annorlunda men jämförbart sätt. Det är inte nödvändigt att härleda den traditionella ANOVA-modellen, som bygger på algoritmiska metoder för statistisk beräkning som utvecklades före dataåldern..

Tillägg 1

DEFINITIONER

Tillägg 2

UTFORMNING AV FAKTORFÖRSÖK FÖR IDENTIFIERING AV SKILLNADER MELLAN KÖNEN I IN VIVO-TEST MED AVSEENDE PÅ MIKROKÄRNOR

Utformning och analys av faktorförsök

I denna utformning testas minst fem hanar och fem honor vid varje koncentrationsnivå, vilket innebär att minst 40 djur måste användas (20 hanar och 20 honor plus relevanta positiva kontroller).

Litteraturhänvisningar

Teori, utformning, metod, analys och tolkning av faktorförsök diskuteras i många statistiska läroböcker, från den enklaste tvåfaktorsanalysen till mer komplexa former som används i försöksutformningsmetoder (Design of Experiment). Följande förteckning är icke-uttömmande: Vissa böcker innehåller etablerade exempel på jämförbara utformningar, i vissa fall med koder för att köra analysen med hjälp av olika programvarupaket.

Box, G.E.P, Hunter, W.G. och Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.

Box, G.E.P. och Draper, N.R. (1987). Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.

Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007). Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.

Mead, R. (1990). The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.

Montgomery D.C. (1997). Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.

Winer, B.J. (1971). Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.

Wu, C.F.J och Hamada, M.S. (2009). Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc

Tillägg 1

DEFINITIONER

Tillägg 2

BCOP-TESTMETODENS FÖRUTSÄGANDE KAPACITET

% | Nr | % | Nr | % | Nr | % | Nr | % | Nr

GHS EU CLP | 191 | 78,53 | 150/191 | 86,15 | 56/65 | 13,85 | 9/65 | 74,60 | 94/126 | 25,40 | 32/126

US EPA | 190 | 78,95 | 150/190 | 85,71 | 54/63 | 14,29 | 9/63 | 75,59 | 96/127 | 24,41 | 31/127

% | Nr | % | Nr | % | Nr | % | Nr | % | Nr

GHS EU CLP | 196 | 68,88 | 135/196 | 100 | 107/107 | 0 | 0/107 | 31,46 | 28/89 | 68,54 | 61/89

US EPA | 190 | 82,11 | 156/190 | 93,15 | 136/146 | 6,85 | 10/146 | 45,45 | 20/44 | 54,55 | 24/44

Tillägg 3

KVALIFIKATIONSÄMNEN FÖR BCOP-TESTMETODEN

Före rutinanvändning av en testmetod bör laboratoriet påvisa den tekniska kvaliteten genom att korrekt identifiera klassificeringen av kemikalier som är farliga för ögonen för de 13 kemikalier som rekommenderas i tabell 1. Dessa ämnen har valts ut för att representera responsskalan för ämnen som är farliga för ögonen enligt resultaten från in vivo-test på kaninögon (TG 405) (17) och GHS-kategorierna 1, 2A, 2B eller ingen klassificering (4). Till övriga kriterier hör att ämnena ska vara kommersiellt tillgängliga, att det finns tillgång till in vivo-referensdata av hög kvalitet och att det finns data av hög kvalitet från BCOP-testmetoden. Referensdata finns i Streamlined Summary Document (SSD) (3) och i ICCVAM Background Review Document för BCOP-testmetoden (2)(18).

1 Varje testkemikalie tilldelades en kemisk klass med användning av ett standardsystem baserat på klassificeringssystemet National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH) (finns på http//www.nlm.nih.gov/mesh).

2 På grundval av in vivo-test på kaninögon (OECD TG 405) och med användning av GHS (17) (4).

3 Klassificering i kategori 2A eller 2B beror på tolkningen av GHS-kriteriet för att skilja mellan dessa två kategorier, dvs. 1 av 3 jämfört med 2 av 3 djur med effekter på dag 7, vilket krävs för en klassificering i kategori 2A. In vivo-undersökningen omfattade tre djur. Alla resultatpunkter förutom rodnad konjunktiva hos ett djur återhämtades till noll dag 7 eller tidigare. Det djur som inte hade återhämtat sig fullständigt dag 7 hade en konjunktiv rodnad på 1 (dag 7) som var fullständigt återställd dag 10.

Tillägg 4

HORNHINNEHÅLLARE FÖR BCOP-TESTMETODEN

Hornhinnehållare för BCOP är gjorda av ett inert material (t.ex. polypropen). De består av två halvor (en främre och en bakre kammare) och har två likadana cylindriska inre kammare. Varje kammare rymmer 5 ml och har ett glasfönster genom vilket opacitetsmätningarna görs. De inre kamrarna mäter 1,7 cm i diameter och 2,2 cm i djup. Den bakre kammaren har en o-ring för att förhindra läckor. Hornhinnorna placeras med endotelsidan nedåt på den bakre kammarens o-ring och den främre kammaren placeras på hornhinnornas epitelsida. Kamrarna hålls på plats med hjälp av tre rostfria stålskruvar på kammarens ytterkanter. Varje kammare har ett glasfönster som kan tas bort för att enkelt nå hornhinnan. Det finns också en o-ring mellan glasfönstret och kammaren för att förhindra läckor. Upptill på varje kammare finns två hål för att tillsätta och ta bort medium och testkemikalier. Hålen försluts med gummiproppar under behandlings- och inkubationsperioderna. Ljustransmissionen genom hornhinnehållarna kan eventuellt ändras eftersom slitage eller ackumulering av specifika kemikaliska rester på den inre kammarens diameter eller på glasfönstren kan påverka ljusspridningen eller reflektansen. Följden kan bli ökningar eller minskningar i grundvärden för ljustransmission (och omvänt grundvärden för opacitet) genom hornhinnehållarna, och kan vara uppenbar som anmärkningsvärda förändringar i de förväntade grundvärdena vid initiala mätningar av hornhinneopacitet i individuella kammare (dvs, de initiala hornhinneopacitetsvärdena i särskilda individuella hornhinnehållare kan rutinmässigt skilja sig åt med mer än 2 eller 3 opacitetsenheter från de förväntade grundvärdena). Laborationerna bör införa program för att utvärdera ändringar i ljustransmissionen genom hornhinnehållarna, beroende på vilken typ av kemikalier som testas och hur ofta kamrarna används. För att fastställa jämförelsevärden kan man kontrollera hornhinnehållarna före rutinmässig användning genom att mäta grundvärden för opacitet (eller ljustransmission) i kamrarna, fyllda med komplett medium utan hornhinnor. Hornhinnehållarna kontrolleras därefter regelbundet för att upptäcka ändringar i ljustransmissionen under användningsperioderna. Laboratorierna kan fastställa kontrollintervaller för hornhinnehållarna baserat på testade kemikalier, användningsfrekvens och observationer av ändringar i grundvärdena för hornhinnornas opacitet. Om märkbara förändringar i ljustransmissionen genom hornhinnehållarna observeras måste laboratoriet överväga lämpliga rengörings- och/eller poleringsrutiner för hornhinnehållarnas yta eller byta ut hornhinnehållarna.

Hornhinnehållare: sprängskiss

glass disc

PTFE-O-ring

refill

hanger

cap

glass disc

nut

O-ring

posterior compartment

anterior compartment

nut

fixing screws

1 De här måtten utgår från hållare för hornhinnor från nötkreatur som är 12–60 månader gamla. För hornhinnor från djur som är 6–12 månader ska hållarna utformas så att varje kammare rymmer en volym på 4 ml och innerkamrarnas diameter är 1,5 cm och djup 2,2 cm. Vid utformningen av anpassade hornhinnehållare är det mycket viktigt att förhållandet mellan exponerad hornhinneyta och bakre kammarens volym är samma som motsvarande förhållande i en traditionell hornhinnehållare. Detta är nödvändigt för att säkerställa att permeabilitetsvärdena fastställs korrekt för beräkningen av IVIS med hjälp av den angivna formeln.

Tillägg 5

OPACITETSMÄTARE

Opacitetsmätaren används för mätning av ljustransmission. För OP-KIT-utrustningen från Electro Design (Riom, Frankrike) som användes för valideringen av BCOP-testmetoden, sänds t.ex. ljus från en halogenlampa sänds genom kontrollkammaren (en tom kammare utan fönster eller vätska) till en fotocell och jämförs med ljuset som sänds genom försökskammaren (i vilken hornhinnan finns) till en fotocell. Instrumentet mäter skillnaden mellan fotocellernas ljustransmission och visar ett numeriskt värde på en digital display. Opacitetsenheterna fastställs. Andra typer av opacitetsmätare med andra inställningar (som t.ex. inte kräver parallella mätningar av kontroll- och försökskamrarna) kan användas om de har visat sig ge samma resultat som den validerade utrustningen.

Opacitetsmätaren bör ge en linjär respons genom ett område av opacitetsmätningar som omfattar de brytpunkter som används för de olika klassificeringar som beskrivs i prognosmodellen (dvs. upp till brytpunkten för frätande verkan/kraftig irritation). För att säkerställa linjära och exakta avläsningar upp till 75–80 opacitetsenheter är det nödvändigt att kalibrera opacitetsmätaren med en serie kalibratorer. Kalibratorerna placeras i kalibreringskammaren (en hornhinnekammare utformad för kalibratorer) och avläsning görs på opacitetsmätaren. Kalibratorerna placeras i kalibreringskammaren med mer eller mindre det avstånd mellan ljus och fotocell som motsvarar hornhinnans placering vid opacitetsmätningarna. Referensvärden och initialt börvärde beror på vilken typ av utrustning som används. Opacitetsmätningars linjäritet bör säkerställas genom lämpliga (instrumentspecifika) förfaranden. För OP-KIT-utrustningen från Electro Design (Riom, Frankrike) kalibreras opacitetsmätaren först till 0 opacitetsenheter med hjälp av kalibreringskammaren utan en kalibrator. Därefter placeras tre olika kalibratorer en i sänder i kalibreringskammaren och avläsning görs av opacitetsvärdena. Kalibratorerna 1, 2 och 3 bör ge opacitetsavläsningar som motsvarar deras riktvärden på 75, 150 respektive 225 opacitetsenheter ± 5 %.

Tillägg 1

DEFINITIONER

Tillägg 2

KVALIFIKATIONSÄMNEN FÖR ICE-TESTMETODEN

Före rutinanvändning av ett test som följer denna testmetod bör laboratoriet påvisa den tekniska kvaliteten genom att korrekt identifiera klassificeringen av kemikalier som är farliga för ögonen för de 13 kemikalier som rekommenderas i tabell 1. Dessa ämnen har valts ut att representera responsskalan för ämnen som är farliga för ögonen enligt resultaten från in vivo-test på kaninögon (TG 405) och FN:s GHS-klassificieringssystem (dvs. GHS-kategorierna 1, 2A, 2B eller ingen klassificering) (4)(6). Till övriga kriterier hör att ämnena ska vara kommersiellt tillgängliga, att det finns tillgång till in vivo-referensdata av hög kvalitet och att det finns data av hög kvalitet från ICE-testmetoden in vitro. Referensdata finns i SSD (5) och i ICCVAM Background Review Document för ICE-testmetoden (9).

2 På grundval av in vivo-test på kaninögon (OECD TG 405) och med användning av GHS (4)(6).

3 Baserat på resultat i ICE enligt beskrivningen i tabell 6.

4 Kombination av andra ICE-värden än de som beskrivs i tabell 6 för identifiering av GHS ingen klassificering och GHS-kategori 1 (se tabell 6)

5 Klassificering i kategori 2B eller 2B beror på tolkningen av GHS-kriteriet för att skilja mellan dessa två kategorier, dvs. 1 av 3 jämfört med 2 av 3 djur med effekter på dag 7, vilket krävs för en klassificering i kategori 2A. In vivo-undersökningen omfattade tre djur. Alla resultatpunkter förutom rodnad konjunktiva hos ett djur återhämtades till noll dag 7 eller tidigare. Det djur som inte hade återhämtat sig fullständigt dag 7 hade en konjunktiv rodnad på 1 (dag 7) som var fullständigt återställd dag 10.

Tillägg 3

SUPERFUSIONSAPPARAT OCH ÖGONKLÄMMOR FÖR ICE-TESTMETODEN (Se Burton m.fl. (18) för ytterligare allmänna beskrivningar av superfusionsapparaten och ögonklämmorna) (18)

CROSS SECTION COMPARTMENT

EYE HOLDER

Post nr | Beskrivning | Post nr | Beskrivning

1 | Varmvattenutlopp | 9 | Fack

2 | Skjutdörr | 10 | Ögonhållare

3 | Superfusionsapparat | 11 | Kycklingöga

4 | Optiskt mätinstrument | 12 | Utgående koksaltlösning

5 | Ingående varmvatten | 13 | Ställskruv

6 | Saltlösning | 14 | Justerbar överarm

7 | Varmvatten | 15 | Fast underarm

8 | Ingående koksaltlösning

Tillägg 1

DEFINITIONER

för försök med användning av cellinjer som omfattas av denna testmetod som utförs med tillsats av cytochalasin B avser cytotoxicitet en minskning av proliferationsindexet vid cytokinesinhibering (CBPI) eller replikeringsindexet (RI) i behandlade celler jämfört med den negativa kontrollen (se punkt 26 och tillägg 2).

För försök med användning av cellinjer som omfattas av denna testmetod som utförs i avsaknad av cytochalasin B avser cytotoxicitet en minskning av den relativa populationsfördubblingen (RPD) eller en relativ ökning av celltal (RICC) i behandlade celler jämfört med den negativa kontrollen (se punkt 27 och tillägg 2).

Tillägg 2

FORMLER FÖR BESTÄMNING AV CYTOTOXICITET

När cytoB används ska bedömningen av cytotoxicitet basera sig på proliferationsindex vid cytokinesinhibering (CBPI) eller replikeringsindex (RI) (17) (69). CBPI anger det genomsnittliga antalet kärnor per cell och kan användas för att beräkna cellproliferationen. Replikeringsindex indikerar det relativa antalet cellcykler per cell under exponeringsperioden för cytoB i behandlade odlingar i jämförelse med kontrollodlingar och kan användas för att beräkna procentandelen cytostas:

% cytostas = 100-100{(CBPIT – 1) ÷ (CBPIC – 1)}

och

där

Således gäller att ett CBPI-värde på 1 (alla celler är mononukleära) motsvarar 100 % cytostas.

Cytostas = 100 – RI

Således betyder ett RI-värde på 53 % att, jämfört med antalet celler som har delat sig till binukleära och multinukleära celler i kontrollodlingen, endast 53 % av detta antal har delat sig i den behandlade odlingen, dvs. 47 % cytostas.

När cytoB inte används, rekommenderas att cytotoxiciteten utvärderas på grundval av relativ ökning av celltal (RICC) eller relativ populationsfördubbling (RPD) (69), eftersom den andel av cellpopulationen som har delat sig beaktas i båda metoderna.

där

Populationsfördubbling: [log (Cellantal efter behandling ÷ Ursprungligt cellantal)] ÷ log 2

Således indikerar ett RICC-värde eller ett RPD-värde på 53 % att det förekommer 47 % cytotoxicitet/cytostas.

Genom att använda ett proliferationsindex (PI) kan cytotoxiciteten bestämmas genom att räkna antalet kloner som består av 1 cell (cl1), 2 celler (cl2), 3 till 4 celler (cl4) och 5 till 8 celler (cl8).

PI har använts som en värdefull och tillförlitlig cytotoxicitetsparameter även för cellinjer som har odlats in vitro utan tillsats av cytoB (35) (36) (37) (38) och kan anses utgöra en användbar ytterligare parameter.

I alla händelser bör antalet celler före behandling vara detsamma för behandlade och negativa kontrollodlingar.

Vid användning av automatiska klassificeringssystem, t.ex. flödescytometri, laserskanningcytometri eller bildanalys, kan antalet celler i formeln ersättas med antalet kärnor.

I de negativa kontrollodlingarna bör populationsfördubbling eller replikatindex överensstämma med kravet att provta celler efter behandlingen vid en tidpunkt som motsvarar cirka 1,5–2,0 gånger den normala cellcykeln.

Tillägg 1

DEFINITIONER

Tillägg 2

KVALIFIKATIONSÄMNEN FÖR ICE-TESTMETODEN

Chemico Hud Sensibilisering: Direkt Peptid Reaktivitetsanalys

2,4-Dinitroklorbensen | 97-00-7 | Fast ämne | Sensibiliserande (extremt) | Positiv | 90–100 | 15–45

Oxazolon | 15646-46-5 | Fast ämne | Sensibiliserande (extremt) | Positiv | 60–80 | 10–55

Formaldehyd | 50–00–0 | Vätska | Sensibiliserande (starkt) | Positiv | 30–60 | 0–24

Bensylidenaceton | 122-57-6 | Fast ämne | Sensibiliserande (måttligt) | Positiv | 80–100 | 0–7

Farnesal | 19317-11-4 | Vätska | Sensibiliserande (svag) | Positiv | 15–55 | 0–25

2,3-Butandion | 431-03-8 | Vätska | Sensibiliserande (svagt) | Positiv | 60–100 | 10–45

1-Butanol | 71-36-3 | Vätska | Icke-sensibiliserande | Negativ | 0–7 | 0–5,5

6-Metylkumarin | 92-48-8 | Fast ämne | Icke-sensibiliserande | Negativ | 0–7 | 0–5,5

Mjölksyra | 50-21-5 | Vätska | Icke-sensibiliserande | Negativ | 0–7 | 0–5,5

4-Metoxiacetofenon | 100-06-1 | Fast ämne | Icke-sensibiliserande | Negativ | 0–7 | 0–5,5

1 In vivo-förutsägelserna angående fara och (styrka) baseras på LLNA-data (19). In vivo-styrka härleds med användning av de kriterier som föreslagits av ECETOC (23).

2 En DPRA-förutsägelse bör övervägas inom ramen för en IATA och enligt anvisningarna i punkterna 9 och 11.

3 Intervallen bestäms på grundval av minst tio minskningsvärden som genererats av sex sinsemellan oberoende laboratorier.

Tillägg 3

VÄGLEDNING OM UTFODRING OCH HANTERING AV FISKYNGEL OCH TESTDJUR FRÅN REKOMMENDERADE ARTER

Kalibreringsstandarder och referenskontroller | STD1 STD2 STD3 STD4 STD5 STD6 Utspädningsbuffert Referenskontroll A, rep 1 Referenskontroll A, rep 2 Referenskontroll A, rep 3

Samelueringskontroller | Samelueringskontroll 1 för testkemikalie 1 Samelueringskontroll 2 för testkemikalie 2

Referenskontroller | Referenskontroll B, rep 1 Referenskontroll B, rep 2 Referenskontroll B, rep 3

Första uppsättningen replikat | Referenskontroll C, rep 1 Referenskontroll C, rep 1 Prov 1, rep 1 Prov 2, rep 1

Andra uppsättningen replikat | Referenskontroll C, rep 2 Kanelaldehyd, rep 2 Prov 1, rep 2 Prov 2, rep 2

Tredje uppsättningen replikat | Referenskontroll C, rep 3 Kanelaldehyd, rep 3 Prov 1, rep 3 Prov 2, rep 3

Referenskontroller | Referenskontroll B, rep 4 Referenskontroll B, rep 5 Referenskontroll B, rep 6

Tillägg 1

DEFINITIONER

Tillägg 2

KVALIFIKATIONSÄMNEN

Hudsensibilisering in vitro: Testmetoden ARE-Nrf2-luciferas

Före rutinanvändning av denna testmetod bör laboratoriet påvisa den tekniska kvaliteten genom att korrekt erhålla den förväntade KeratinoSensTM-prediktionen för de tio kvalifikationsämnen som rekommenderas i tabell 1 och genom att erhålla minskningsvärden för EC1,5 och IC50 som håller sig inom respektive referensintervall för minst åtta av de tio kvalifikationsämnena. Dessa kvalifikationsämnen har valts för att representera responsintervallet för hudsensibiliserande faror. Andra urvalskriterier är kommersiell tillgänglighet, tillgång till in vivo-referenser av hög kvalitet och tillgång till in vitro-data av hög kvalitet från KeratinoSensTM-testet.

Isopropanol | 67-63-0 | Vätska | Ej sensibiliserande | Negativ | > 1000 | > 1000

Salicylsyra | 69-72-7 | Fast ämne | Ej sensibiliserande | Negativ | > 1000 | > 1000

Mjölksyra | 50-21-5 | Vätska | Ej sensibiliserande | Negativ | > 1000 | > 1000

Glycerol | 56-81-5 | Vätska | Ej sensibiliserande | Negativ | > 1000 | > 1000

Kanelalkohol | 104-54-1 | Fast ämne | Sensibiliserande (svagt) | Positiv | 25–175 | > 1000

Etylenglykoldimetakrylat | 97-90-5 | Vätska | Sensibiliserande (svagt) | Positiv | [5–125] | 500

2-merkaptobensotiazol | 149-30-4 | Fast ämne | Sensibiliserande (moderat) | Positiv | 25–250 | > 500

Metyldibromglutaronitril | 35691-65-7 | Fast ämne | Sensibiliserande (starkt) | Positiv | < 20 | 20–100

4-metylaminofenolsulfat | 55-55-0 | Fast ämne | Sensibiliserande (starkt) | Positiv | < 12.5 | 20–200

2,4-dinitro-klorbensen | 97-00-7 | Fast ämne | Sensibiliserande (extremt) | Positiv | < 12.5 | 5–20

1 In vivo-förutsägelserna angående fara (och potential) baseras på LLNA-data (13). In vivo-kraft härleds med användning av de kriterier som föreslagits av ECETOC (24).

2 En KeratinoSensTM-förutsägelse bör övervägas inom ramen för en IATA och enligt anvisningarna i punkterna 9 och 11 i denna testmetod.

3 Baserat på historiska observerade värden (12).

Tillägg 3

KVALITETSKONTROLL FÖR LUMINISCENSMÄTNING

Grundläggande försök för att säkerställa optimala luminiscensmätningar i KeratinoSensTM-testet

Följande tre parametrar är kritiska för att se till att tillförlitliga resultat erhålls med luminometern:

Tillräcklig känslighet som ger en stabil bakgrund i kontrollhålen.

Ingen gradient över plattan till följd av långa avläsningsperioder.

Ingen ljusförorening i närliggande hål från starkt aktiva hål.

Innan testningen inleds bör man ha lämpliga luminiscensmätningar, genom att testa en konfiguration för kontrollplattan enligt beskrivningen nedan (tredubbel analys).

Konfiguration för plattan vid första övningsförsöket

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12

H | DMSO | DMSO | DMSO | DMSO | DMSO | DMSO | CA 4 | CA 8 | CA 16 | CA 32 | CA 64 | Blankprov

Kvalitetskontrollanalysen bör visa följande:

En tydlig dos-respons i rad D, med Imax > 20-faldig över bakgrunden (i de flesta fall nås Imax-värden mellan 100 och 300).

Ingen dos-respons i raderna C och E (inget induktionsvärde över 1,5 (helst inte över 1,3) på grund av eventuell ljusförorening, särskilt nära starkt aktiva hål i EGDMA-raden.

Ingen statistiskt signifikant skillnad mellan raderna A, B, C, E, F och G (dvs. ingen gradient över plattan).

Variation i någon av raderna A, B, C, E, F och G, DMSO-hålen i rad H bör vara under 20 % (dvs. stabil bakgrund).

Tillägg 1

DIAGRAM ÖVER MDCK-CELLER OM ODLATS PÅ ETT INSATSMEMBRAN FÖR FL-TESTMETODEN

Ett konfluent lager av MDCK-celler odlas på semipermeabla membran i en insats. Insatserna placeras i hålen på 24-hålsplattor.

Epithelial junctions remain impermeable to fluorescein

Microporous membrane

Apical chamber media (containing fluorescein)

Cell monolayer

Basal chamber media

Insert

Figuren hämtad från: Wilkinson, P.J. (2006), Development of an in vitro model to investigate repeat ocular exposure, Ph.D. Thesis, University of Nottingham, Storbritannien.

Tillägg 2

DEFINITIONER

Tillägg 3

KVALIFIKATIONSÄMNEN FÖR FL-TESTMETODEN

Före rutinanvändning av en testmetod bör laboratoriet påvisa den tekniska kvaliteten genom att korrekt identifiera klassificeringen av frätande verkan på ögonen för de åtta kemikalier som rekommenderas i tabell 1. Dessa kemikalier har valts ut att representera responsskalan för kemikalier som är lokalt frätande/irriterande för ögonen enligt resultaten från in vivo-test på kaninögon (TG 405, TM B.5(5)) (dvs. kategorierna 1, 2A, 2B eller Ingen klassificering enligt GHS). När det gäller FL-testets validerade användningsområde (dvs. endast att identifiera kemikalier som är frätande/kraftigt irriterande för ögonen) finns det dock bara två testutfall för klassificeringsändamål (frätande/kraftigt irriterande eller icke-frätande/ej kraftigt irriterande) som laboratoriet kan använda för att visa att det är kvalificerat. Till övriga kriterier hör att ämnena ska vara kommersiellt tillgängliga, att det finns tillgång till in vivo-referensdata av hög kvalitet och att det finns data av hög kvalitet från FL-testmetoden. Av detta skäl valdes kvalifikationskemikalierna från dokumentet Fluorescein Leakage Assay Background Review Document as an Alternative Method for Eye Irritation Testing (8), som användes för den retrospektiva valideringen av FL-testmetoden.

2 Baserat på resultat från in vivo-test på kaninögon (OECD TG 405, TM B.5) och med användning av GHS och CLP.

3 Baserat på resultat som erhållits med FL (INVITTOX-protokoll nr 71 (6)).

Tillägg 1

DEFINITIONER

Tillägg 2

UTFORMNING AV FAKTORFÖRSÖK FÖR IDENTIFIERING AV SKILLNADER MELLAN KÖNEN I IN VIVO COMET ASSAY

Utformning och analys av faktorförsök

I denna utformning testas minst fem hanar och fem honor vid varje koncentrationsnivå, vilket innebär att minst 40 djur måste användas (20 hanar och 20 honor plus relevanta positiva kontroller).

Litteraturhänvisningar

1 Box, G.E.P, Hunter, W.G. och Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.

2 Box G.E.P. och Draper, N.R. (1987) Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.

3 Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007) Analysis of Variance and Covariance: How to choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.

4 Mead, R. (1990) The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.

5 Montgomery D.C. (1997) Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.

6 Winer, B.J. (1971) Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.

7 Wu, C.F.J och Hamada, M.S. (2009) Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.

Tillägg 3

AKTUELLA BEGRÄNSNINGAR HOS FÖRSÖKET

På grund av nuvarande kunskapsstatus har kometmetoden flera begränsningar. Det förväntas att dessa begränsningar kommer att minskas eller definieras mer snävt allteftersom erfarenheterna av tillämpningen av försöket ökar för att bemöta säkerhetsfrågor i lagstiftningssammanhang.

1. Vissa typer av DNA-brott kan vara kortlivade, dvs. kan repareras för snabbt för att kunna observeras 24 timmar eller senare efter den sista dosen. Det saknas uppgifter om typerna av kortlivade skador och de kemikalier som kan orsaka sådana skador. Den tidsperiod då denna typ av skada kan detekteras är inte heller känd. Optimala provtagningstillfällen kan även vara specifika för kemikalien eller administreringsvägen och bör därför fastställas med utgångspunkt i kinetiska data (t.ex. den tidpunkt (Tmax) då högsta värde för plasma eller vävnadskoncentration (Cmax) uppnås) om sådana data finns tillgängliga. Enligt de flesta valideringsstudier som stöder denna testmetod bör obduktion utföras två eller tre timmar efter administreringen av slutdosen. Enligt de flesta studier i den publicerade litteraturen bör slutdosen ges mellan två och sex timmar före avlivning. Dessa erfarenheter användes som underlag för testmetodens rekommendation att slutdosen, om inte annat anges i tillgängliga data, bör administreras vid en angiven tidpunkt mellan två och sex timmar före obduktion.

2. Det finns inga uppgifter om testets känslighet för detektion av kortlivade DNA-skador efter administrering i foder eller dricksvatten jämfört med administrering via sond. DNA-skador har detekterats efter administrering i foder och dricksvatten, men det finns relativt få sådana rapporter jämfört med den mycket större erfarenheten av administrering via sond eller intraperitonealt (i.p.). Försökets känslighet kan därför minskas för kemikalier som inducerar kortlivad skada och som administreras via föda eller dricksvatten.

3. Inga interlaborativa undersökningar har utförts av andra vävnader än lever och magsäck. Därför saknas rekommendationer om hur en känslig och reproducerbar respons uppnås i andra vävnader än lever, t.ex. förväntade positiva och negativa kontrollintervall. För lever har man inte kunnat enas om att fastställa en lägre gräns även för det negativa kontrollvärdet.

4. Även om flera publikationer visar på en störande effekt på cytotoxicitet in vitro finns mycket få in vivo-data, och därför kan inget särskilt cytotoxicitetsmått rekommenderas. Histopatologiska förändringar såsom inflammation, cellinfiltration och apoptotiska och nekrotiska ändringar har kopplats till ökningar i DNA-migrationen. Såsom visats av JaCVAM:s valideringsförsök (OECD, 2014) leder dessa ändringar inte alltid till positiva komet-resultat och därför finns ingen definitiv förteckning över histopatologiska ändringar som alltid kan kopplas till ökad DNA-migration. Hedgehogs (eller moln, spökceller) har tidigare föreslagits som en indikator på cytotoxicitet, men etiologin för hedgehogs är osäker. Det finns data som tyder på att de kan orsakas av kemikalierelaterad cytotoxicitet, mekanisk/enzyminducerad skada som uppstår under provberedningen (Guerard m.fl., 2014) och/eller en mer extrem effekt av testkemikaliens gentoxicitet. Andra data tyder på att de beror på omfattande men kanske reparerbar DNA-skada (Lorenzo m.fl., 2013).

5. Vävnader och cellkärnor har med framgång frysts ned för senare analys. Detta leder vanligen till en mätbar effekt av responsen på vehikeln och den positiva kontrollen (Recio m.fl., 2010; Recio m.fl., 2012, Jackson m.fl., 2013). Om nedfrysning används ska laboratoriet visa att det är kvalificerat för frysningsmetoder och bekräfta godtagbara låga intervall för procentandelen DNA i kometsvans i målvävnaderna hos vehikelbehandlade djur samt att positiva responser fortfarande kan detekteras. Olika metoder för nedfrysning av vävnader beskrivs i litteraturen. För närvarande råder det dock inte enighet om det bästa sättet att frysa ned och tina upp vävnader och hur man bedömer huruvida en eventuellt ändrad respons kan påverka testets sensitivitet.

6. Nya uppgifter visar att förteckningen över kritiska variabler kommer att bli kortare och parametrarna för kritiska variabler mer exakt definierade (Guerard m.fl., 2014).

Litteratur

1 Guerard, M., C. Marchand, U. Plappert-Helbig (2014), Influence of Experimental Conditions on Data Variability in the Liver Comet Assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, vol. 55/2, s. 114–121.

2 Jackson, P. m.fl. (2013), Validation of use of frozen tissues in high-throughput comet assay with fully-automatic scoring, Mutagenesis, vol. 28/6, s. 699–707.

3 Lorenzo,Y. m.fl. (2013), The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead, Mutagenesis, vol. 28/4, s. 427–432.

4 OECD (2014), Reports of the JaCVAM initiative international pre-validation and validation studies of the in vivo rodent alkaline comet assay for the detection of genotoxic carcinogens, Series on Testing and Assessment, nr 195 och 196, OECD Publishing, Paris.

5 Recio L, Hobbs C, Caspary W, Witt KL, (2010), Dose-response assessment of four genotoxic chemicals in a combined mouse and rat micronucleus (MN) and Comet assay protocol, J. Toxicol. Sci. 35:149–162.

6 Recio, L. m.fl. (2012), Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues, Environmental and Molecular Mutagenesis, vol. 53/2, s. 101–113.

Tillägg 1

DEFINITIONER OCH ENHETER

Assimileringseffektivitet (α) är ett mått på den relativa mängd av ämnet som absorberas från tarmen in i organismen (α har ingen enhet, men uttrycks ofta som procentandel i stället för fraktion).

Bioackumulering avser vanligen en process där ämneskoncentrationen i en organism når en nivå som är högre än nivån i andningsmediet (t.ex. vatten för fisk eller luft för ett däggdjur), i födan eller i båda (1).

Biokoncentrationen är ökningen av koncentrationen av det undersökta ämnet i eller på en organism (specificerad vävnad därav) i förhållande till koncentrationen av det undersökta ämnet i omgivande medium.

Biokoncentrationsfaktorn (BCF eller KB) vid varje tidpunkt under upptagningsfasen av ackumulationsprovet är det undersökta ämnets koncentration i/på fisken eller den specificerade vävnaden därav (Cf as mg/kg), dividerat med ämnets koncentration i omgivande medium (Cw i mg/l). BCF uttrycks som l·kg-1. Observera att korrigeringarna för tillväxt och/eller standardfetthalt inte är medräknade.

Biomagnifikation är ökningen av koncentrationen av det undersökta ämnet i eller på en organism (specificerad vävnad därav) i förhållande till koncentrationen av det undersökta ämnet i fodret.

Biomagnifikationsfaktorn (BMF) är koncentrationen av ett ämne i en predator i förhållande till dess byte (eller foder) i stabilt tillstånd. I den metod som beskrivs i denna testmetod undviks exponering via vattenfasen noggrant, vilket innebär att ett BMF-värde från detta test inte kan jämföras direkt med ett BMF-värde från en fältstudie (där både exponering via vatten och föda kan kombineras).

Biomagnifikationsfaktor för test med exponering via föda (BMF för födotest) är den term som används i denna testmetod för att beskriva resultatet av kostexponeringstestet, där exponering via vattenfasen undviks noggrant. Det innebär att BMF för födotest från denna testmetod inte kan jämföras direkt med ett BMF-värde från en fältstudie (där både exponering via vatten och föda kan kombineras),

Utsöndrings- eller efterexponeringsfasen (förlustfasen) är den period, efter det att den undersökta fisken flyttats från ett medium innehållande det undersökta ämnet till ett medium fritt från detta ämne, under vilken utsöndringen (eller nettoförlusten) av det aktuella ämnet från den undersökta fisken eller specificerad vävnad därav studeras.

Utsöndringskonstanten (förlustkonstanten) (k2) är det numeriska värdet för minskningshastigheten av koncentrationen av det undersökta ämnet i den undersökta fisken eller i specificerad vävnad därav, efter överföring av den undersökta fisken från ett medium innehållande det undersökta ämnet till ett medium fritt från detta ämne (k2 uttrycks som dag-1).

Löst organiskt kol (DOC) är ett mått på koncentrationen av kol som härrör från upplösta organiska källor i testmediet.

Exponerings- eller upptagningsfasen är den tid under vilken fisken exponeras för testämnet.

Foderintagskonstanten (I) är den genomsnittliga mängd foder som varje fisk äter varje dag, i förhållande till uppskattad genomsnittlig helfisksvikt (uttryckt i foder/g fisk/dag).

Kinetisk biokoncentrationsfaktor (BCFK) är förhållandet mellan upptagningskonstanten, k1, och utsöndringskonstanten, k2 (dvs. k1/k2 – se motsvarande definitioner i denna bilaga). Detta värde bör i princip vara jämförbart med BCFSS (se definition ovan), men avvikelser kan förekomma om det stabila tillståndet var osäkert eller om tillväxtkorrigeringar har tillämpats på den kinetiska BCF.

Kinetisk biokoncentrationsfaktor normaliserad för fetthalt (BCFKL) normaliseras till en fisk med 5 % fetthalt.

Kinetisk biokoncentrationsfaktor normaliserad för fetthalt och korrigerad för tillväxt (BCFKgL) normaliseras till en fisk med 5 % fetthalt och korrigeras för tillväxt under undersökningsperioden enligt beskrivningen i tillägg 5.

Kinetisk biokoncentrationsfaktor i stabilt tillstånd normaliserad för fetthalt (BCFSSL) normaliseras till en fisk med 5 % fetthalt.

Ett multikomponentämne definieras i Reach som ett ämne där fler än en huvudsaklig beståndsdel förekommer i en koncentration på 10–80 viktprocent.

Fördelningskoefficient oktanol/vatten (KOW) är förhållandet då ämnets lösbarhet i n-oktanol och vatten når balans (A.8 (2), A.24 (3), A.23 (4)), uttrycks även som POW. Logaritmen för KOW används som en indikation på ämnets potential för biokoncentration i vattenorganismer.

Partikulärt organiskt kol (POC) är ett mått på koncentrationen av kol som härrör från suspenderade organiska källor i testmediet.

Mikroextraktion i fastfas (SPME) är en analytisk metod utan lösningsmedel som har utvecklats för utspädningssystem. I denna metod exponeras en polymertäckt fiber för gas- eller vätskefasen som innehåller analyten av intresse. Normalt används en minsta analystid så att jämviktsförhållanden etableras mellan de fasta och flytande faserna, med hänsyn till de mätta arterna. Därefter kan koncentrationen av analyten av intresse bestämmas direkt från fibern eller efter det att den extraherats från fibern till ett lösningsmedel, beroende på bestämningsteknik.

Stabilt tillstånd nås när mängden undersökt ämne i fisk (Cf) i den tidpunkt där kurvan blir parallell med tidsaxeln och tre på varandra följande Cf-analyser, på prover tagna med intervaller på minst två dagar, ligger inom ± 20 % på de tre proverna och ingen signifikant ökning av Cf förekommer under tiden mellan den första och den sista successiva analysen. När kombinerade prover analyseras krävs minst fyra på varandra följande analyser. När de undersökta ämnena tas upp långsamt bör provtagningsintervallerna vara sju dagar.

Den stabila biokoncentrationsfaktorn (BCFSS) genomgår ingen väsentlig förändring under en längre tidsperiod, om koncentrationen av det undersökta ämnet i omgivande medium är konstant under denna tidsperiod (jfr definition av stabilt tillstånd).

Totalt organiskt kol (TOC) är ett mått på koncentrationen av kol som härrör från alla organiska källor i testmediet, inklusive partiklar och upplösta källor.

Konstanten för upptagningsförhållandet (k1) är det numeriska värde som definierar ökningshastigheten av koncentrationen av det undersökta ämnet i/på den undersökta fisken eller specificerad vävnad därav, när fisken exponeras för nämnda ämne (k1 uttrycks som l kg– 1 dag– 1).

Ämnen med okänd eller varierande sammansättning, komplexa reaktionsprodukter eller biologiskt material benämns UVCB-ämnen.

Kemikalie: ett ämne eller en blandning.

Testkemikalie: varje ämne eller blandning som testas med denna testmetod.

LITTERATUR

1 Gobas F.A.P.C., de Wolf W., Burkhard L.P., Verbruggen E. och Plotzke K. (2009), Revisiting bioaccumulation criteria for POPs and PBT assessments. Integr. Environ. Assess. Manag. 5: 624–637.

2 Kapitel A.8 i denna bilaga, Fördelningskoefficient (n-oktanol/vatten): Skakkolvmetoden

3 Kapitel A.24 i denna bilaga, Fördelningskoefficient (n-oktanol/vatten), Vätskekromatografimetoden (HPLC).

4 Kapitel A.23 i denna bilaga, fördelningskoefficient (1-oktanol/vatten): Metod med långsam omrörning

Tillägg 2

TESTBETINGELSER, TESTPERIOD OCH ÖVERLEVNADSKRITERIER FÖR REKOMMENDERADE ARTER

Komponent | Koncentrations-gränsvärde

Partiklar | 5 mg/l

Halt av organiskt kol | 2 mg/l

Icke-joniserad ammoniak | 1 μg/l

Resterande mängd klor | 10 μg/l

Total mängd bekämpningsmedel som innehåller organiska fosforföreningar | < 50 ng/l

Total mängd bekämpningsmedel som innehåller organiska klorföreningar plus polyklorerade bifenyler | < 50 ng/l

Total mängd organiskt klor | < 25 ng/l

Aluminium | 1 μg/l

Arsenik | 1 μg/l

Krom | 1 μg/l

Kobolt | 1 μg/l

Koppar | 1 μg/l

Järn | 1 μg/l

Bly | 1 μg/l

Nickel | 1 μg/l

Zink | 1 μg/l

Kadmium | < 100 ng/l

Kvicksilver | < 100 ng/l

Silver | < 100 ng/l

Tillägg 3

FISKARTER SOM REKOMMENDERAS FÖR TESTNING

Rekommenderade arter | Rekommenderat temperaturområde för undersökningen (°C) | Rekommenderad total längd på det undersökta djuret (cm)

Danio rerio (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton-Buchanan) Sebrafisk | 20–25 | 3,0 ± 0,5

Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque) Knölskallelöja | 20–25 | 5,0 ± 2,0

Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linnaeus) Karp | 20–25 | 8,0 ± 4,0

Oryzias latipes (Teleostei, Poecilliidae) (Temminck och Schlegel) Risfisk | 20–25 | 4,0 ± 1,0

Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters) Guppy | 20–25 | 3,0 ± 1,0

Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) (Rafinesque) Blågälad solabborre | 20–25 | 5,0 ± 2,0

Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum) Regnbåge | 13–17 | 8,0 ± 4,0

Gasteroteus aculeatus (Teleostei, (Gasterosteidae) (Linnaeus) Storspigg | 18–20 | 3,0 ± 1,0

Flera söt- och saltvattenarter har använts i mindre utsträckning, t.ex.

Slätkväkare | (Leiostomus xanthurus)

Sheepshead minnow (art i ordningen tandkarpar) | (Cyprinodon variegatus)

Silverlax | (Menidia beryllina)

Abborre | (Cymatogaster aggregata)

Sjötunga | (Parophrys vetulus)

Staghorn sculpin (art i familjen simpor) | (Leptocottus armatus)

Storspigg | (Gasterosteus aculeatus)

Havsabborre | (Dicentracus labrax)

Löja | (Alburnus alburnus)

Den sötvattenfisk som anges i ovanstående tabell är lätt att skaffa och/eller finns lätt tillgänglig under hela året, medan tillgängligheten for havs- och brackvattenarterna delvis är begränsad till respektive länder. De kan födas upp och odlas på fiskodlingar eller laboratorier under sjukdoms- och parasitkontrollerade förhållanden, så att det använda djuret är friskt och har känd stamtavla. Dessa fiskar finns tillgängliga i stora delar av världen.

LITTERATUR

(1) Meyer A., Biermann C.H. and Orti G. (1993), The phylogenetic position of the zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology: An invitation to the comparative method Proc. R. Soc. Lond. B. 252: 231-236.

1 Meyer m.fl. (1)

2 Det bör noteras att i själva testet är vikt att föredra som mått för att härleda storlek och tillväxtkonstanter. Längd är dock ett mer praktiskt mått om fisken väljs på avstånd i början av försöket (dvs. från stampopulationen).

3 Detta längdintervall anges i testningsmetoder för nya kemiska ämnen osv., baserat på Japans lag om kontroll av kemiska ämnen (CSCL).

Tillägg 4

PROVTAGNINGSSCHEMAN FÖR TEST MED EXPONERING VIA VATTEN OCH FÖDA

1 Teoretiskt exempel på ett provtagningsschema för ett fullständigt biokoncentrationstest av ett ämne via vattenexponering med log KOW = 4.

Provtagning av fisk | Tidsschema för provtagning | Antal vattenprover | Antal fiskar per prov

Längsta tänkbara provtagningsfrekvens (dagar) | Tilläggsprover (dagar)

Upptagningsfas

1 | – 1 | 2 | 4

0 | (2) | (3)

2 | 0,3 | 2 | 4

0,4 | (2) | (4)

3 | 0,6 | 2 | 4

0,9 | (2) | (4)

4 | 1.2 | 2 | 4

1,7 | (2) | (4)

5 | 2,4 | 2 | 4

3,3 | (2) | (4)

6 | 4,7 | 2 | 4–8

(3)

Utsöndringsfas | Flytta över fisken till vatten som är fritt från testämnet

7 | 5,0 | 2 | 4

5,3 | (4)

8 | 5,9 | 2 | 4

7,0 | (4)

9 | 9,3 | 2 | 4

11,2 | (4)

10 | 14,0 | 2 | 4–8

17,5 | (4+3)

TOTALT | 40–72 (48–80)

2. Teoretiskt exempel på ett provtagningsschema för ett bioackumuleringstest av ett ämne via föda efter en upptagningsfas på 10 dagar och en utsöndringsfas på 42 dagar.

Provtagningshändelse | Tidsschema för provtagning | Antal foderprover | Antal fiskar per prov

Dag i fasen | Ytterligare fiskprover? | Testgrupp | Kontrollgrupp

Upptagningsfas

1 | 0 | Möjlig | 3 – testgrupp | 0 | 5–10

3 – kontrollgrupp | (8–13)

1A | 1–3 | 5–10 | 5–10

2 | 10 | Ja | 3 – testgrupp | 10–15 | 5–10

3 – kontrollgrupp | (13–18) | (8–13)

Utsöndringsfas

3 | 1 | Ja | 10–15 | 5–10

4 | 2 | 5–10 | 5–10

5 | 4 | 5–10 | 5–10

6 | 7 | Ja | 10–15 | 5–10

7 | 14 | 5–10 | 5–10

8 | 28 | 5–10 | 5–10

9 | 42 | Ja | 10–15 (13–18) | 5–10 (8–13)

TOTALT | 59–120 (63–126) | 50–110 (56–116)

Anmärkning om tidpunkter för de olika faserna samt provtagning: Upptagningsfasen inleds med den första utfodringen med behandlat foder. En försöksdag löper från en utfodring till kort före nästa utfodring, 24 timmar senare. Det första provtagningstillfället (1 i tabellen) bör utföras kort före den första utfodringen (t.ex. en timme). Provtagningen bör helst utföras kort före följande dags utfodring (dvs. cirka 23 timmar efter provdagens utfodring). Upptagningsfasen slutar kort före den första utfodringen med behandlat foder, när utsöndringsfasen börjar (testgruppens fiskar håller sannolikt fortfarande på att smälta det behandlade fodret under de mellanliggande 24 timmarna efter den sista utfodringen med behandlat foder). Detta innebär att provet i slutet av upptagningsfasen bör tas kort före den första utfodringen med obehandlat foder. Det första provet under utsöndringsfasen bör tas cirka 23 timmar efter den första utfodringen med obehandlat foder.

1 Värden inom parentes står för antal prover (vatten, fisk) som ska tas om tilläggsprovtagning görs.

2 Föregående uppskattning för k2, för log KOW på 4,0 är 0,652 dagar– 1. Försökets totala varaktighet är fastställd till 3 × tSS = 3 × 4,6 dagar, dvs. 14 dagar. För uppskattning av tSS, se tillägg 5.

3 Ta prover på vattnet när minst tre kärlvolymer har levererats.

4 Dessa fiskar provtas från stampopulationen.

5 Om större precision eller metabolismstudier är nödvändiga som kräver användning av fler fiskar, bör dessa fiskar särskilt provtas i slutet av upptagnings- och utsöndringsfaserna (jfr punkt 40).

6 Minst tre ytterligare fiskar kan krävas för analysen av fetthalt om det inte är möjligt att använda samma provtagningsfisk som för ämneskoncentrationerna i början av testet, i slutet av upptagningsfasen och i slutet av utsöndringsfasen. Observera att det i många fall är möjligt att använda endast tre kontrollfiskar (jfr punkt 56).

19 Tre foderprover från både kontroll- och testgrupperna analyseras med avseende på testämneskoncentrationer och fetthalt.

20 Provtagningsfisk tas från stampopulationen, vilket ska ske så sent som möjligt innan undersökningen inleds. Minst tre fiskar från stampopulationen vid teststarten ska provtas med avseende på fetthalt.

21 (Valfri) provtagning tidigt under upptagningsfasen ger data för beräkningen av testämnets upptag via födan. Dessa data kan jämföras med den upptagningseffektivitet som har beräknats på grundval av data från utsöndringsfasen.

22 Fem extra fiskar kan provtas för en vävnadsspecifik analys.

23 Minst tre ytterligare fiskar kan krävas för analysen av fetthalt om det inte är möjligt att använda samma provtagningsfisk som för ämneskoncentrationerna i början av testet, i slutet av upptagningsfasen och i slutet av utsöndringsfasen. Observera att det i många fall är möjligt att använda endast tre kontrollfiskar (jfr punkterna 56 och 153).

Tillägg 5

ALLMÄNNA BERÄKNINGAR

1. Inledning

2. Prediktion av upptagningsfasens längd

3. Prediktion av utsöndringsfasens längd

4. Stegvis metod: bestämning av utsöndringskonstanten (förlust) k2

5. Stegvis metod: bestämning av upptagningskonstanten k1 (endast vattenexponeringsmetoden)

6. Samtidig metod för beräkning av upptagningskonstanten och utsöndringskonstanten (förlust) (endast vattenexponeringsmetoden)

7. Korrigering av utspädning för kinetisk BCF och BMF

8. Normalisering av fetthalten till 5 % (endast vattenexponeringsmetoden)

1. INLEDNING

Den allmänna modellen för bioackumulering i vatten kan beskrivas i form av upptagnings- och förlustprocesser, utan hänsyn till upptagning via föda. Den differentialekvation (dCf/dt) som beskriver förändringshastigheten för koncentrationen i fisk (mg · kg– 1·dag– 1) anges med (1):

dC f dt k 1 C w k 2 k g k m k e C f | [Ekvation A5.1]

där

För bioackumulerande ämnen kan ett tidsviktat genomsnitt (TWA) förväntas vara den mest relevanta exponeringskoncentrationen i vatten (Cw) inom det tillåtna fluktueringsintervallet (jfr punkt 24). Ett tidsviktat genomsnitt för vattenkoncentrationen bör beräknas enligt förfarandet i tillägg 6 till testmetod C.20 (2). Observera att ln-transformationen av vattenkoncentrationen är lämplig när ett exponentiellt sönderfall mellan förnyelseperioderna förväntas, t.ex. i en semi-statisk testutformning. I ett genomflödessystem kanske ln-transformation av exponeringskoncentrationerna inte är nödvändig. Om TWA-vattenkoncentrationer härleds bör de redovisas och användas i beräkningarna.

I ett BCF-test av standardtyp kan upptagning och utsöndring beskrivas i form av första ordningens kinetiska processer.

Upptagningstakt = k1 × Cw | [Ekvation A5.2]

Total förlusttakt = (k2 + kg + km + ke) × Cf | [Ekvation A5.3]

Vid stabilt tillstånd behöver man inte uppskatta tillväxt och metabolism (dvs. värdena för kg och km kan inte särskiljas från noll). Upptagningskonstanten motsvarar utsöndringskonstanten. En kombination av ekvation A5.2 och ekvation A5.3 ger då följande förhållande:

BCF C f SS C w SS k 1 k 2 | [Ekvation A5.4]

där

Förhållandet k1/k2 kallas kinetisk BCF (BCFK) och bör motsvara BCF i stabilt tillstånd (BCFSS), som erhålls från förhållandet mellan den stabila koncentrationen i fisk och den stabila koncentrationen i vatten. Avvikelser kan dock förekomma om det stabila tillståndet var osäkert eller om tillväxtkorrigeringar har tillämpats på den kinetiska BCF. Eftersom k1 och k2 är konstanter behöver stabilt tillstånd inte nås för att härleda en BCFK.

Tillägg 5 innehåller de allmänna beräkningar som behövs för bioackumuleringsmetoden med exponering via vatten och via föda. Beräkningarna grundas på dessa första ordningens ekvationer. Avsnitten 5, 6 och 8 är dock endast relevanta för vattenexponeringsmetoden, men båda metoderna finns med här eftersom de är allmänna tekniker. De stegvisa metoderna (avsnitten 4 och 5) och de samtidiga metoderna (avsnitt 6) möjliggör beräkning av upptagnings- och utsöndringskonstanter som används för att härleda kinetisk BCF. Den stegvisa metoden för bestämning av k2 (avsnitt 4) är viktig för metoden med exponering via föda, eftersom den behövs för att beräkna både assimileringseffektivitet och BMF. De beräkningar som är specifika för metoden med exponering via föda anges i tillägg 7.

2. PREDIKTION AV UPPTAGNINGSFASENS LÄNGD

Innan provet påbörjas ska en uppskattning av k2 göras, och hänsyn till hur stor del av tiden som krävs för att nå stabilitet kan inhämtas från empiriska förhållanden mellan k2 och fördelningskoefficienten n-oktanol/vatten (KOW) eller k1, och BCF. Man bör dock vara medveten om att ekvationerna i detta avsnitt endast gäller när upptagnings- och utsöndringsfaserna följer första ordningens kinetik. Om så uppenbart inte är fallet bör man dock inhämta råd från biostatistiker och/eller farmakokinetiker om förutsägelser av upptagningsfasen är önskvärda.

En uppskattning av k2 (dag-1) kan erhållas med flera metoder. Följande empiriska förhållanden kan t.ex. användas som ett första steg:

log k2 = 1,47 – 0,414logKOW | (r2 = 0,95) [(3), ekvation A5.5]

eller

k 2 k 1 BCF | [Ekvation A5.6]

där k1 = 520 × W– 0,32 (för ämnen med en log KOW > 3) | (r2 = 0,85) [(4), Ekvation A5.7]

och BCF 10 0,910 logK OW 1,975 log 6,8 10 7K OW 1 0,786 | (r2 = 0,90) [(5), Ekvation A5.8]

W = vikt för behandlad fisk (gram våtvikt) i slutet av upptagningsfasen/i början av utsöndringsfasen.

För andra relaterade förhållanden se (6). Det kan vara fördelaktigt att tillämpa mer komplicerade modeller för uppskattningen av k2 om det t.ex. är sannolikt att betydlig metabolism kan förekomma (7) (8). Eftersom komplexiteten ökar bör man dock vara försiktigare med tolkningen av uppskattningarna. Förekomsten av nitrogrupper kan t.ex. tyda på snabb metabolism, men så är inte alltid fallet. Vid schemaläggningen av undersökningen bör man därför väga resultaten från den prediktiva metoden mot kemisk struktur och annan relevant information (t.ex. preliminära undersökningar).

Tiden för att nå en viss del av den stabila nivån kan fås genom tillämpning av så kallad k2-bedömning, med den allmänna kinetiska ekvationen för upptagning och utsöndring (första ordningens kinetik), med antagandet att tillväxt och metabolism är försumbara: Om signifikant tillväxt förekommer under undersökningen kommer de uppskattningar som beskrivs nedan inte att vara tillförlitliga. I ett sådant fall är det bättre att använda den tillväxtkorrigerade k2g, vilket beskrivs senare (se avsnitt 7 i detta tillägg):

dC f dt k 1C W k 2C f | [Ekvation A5.9]

eller om Cw är konstant:

C f k 1 k 2 C W 1 e k 2t | [Ekvation A5.10]

När stabiliteten börjar närma sig (t → ∞), kan ekvation A5.10 reduceras (jfr (9) (10)) till:

C f k 1 k 2 C W | [Ekvation A5.11]

eller

C f C w k 1 k 2 BCF | [Ekvation A5.12]

Då är BCF × Cw en approximation till koncentrationen i fisken vid stabilt tillstånd (Cf-SS). [Obs: samma metod kan användas för uppskattningar av en stabil BMF i testet med exponering via föda. I detta fall ersätts BCF med BMF och Cw med Cfood, koncentration i fodret, i ovanstående ekvationer.]

Ekvation A5.10 kan skrivas om på följande sätt:

C f C f SS 1 e k 2t | [Ekvation A5.13]

eller

C f C f SS 1 e k 2t | [Ekvation A5.14]

Vid användning av ekvation A5.14 kan tiden för att nå viss stabilitet förutsägas när k2 förutbestäms med ekvation A5.5 eller A5.6.

Som riktlinje kan sägas att den statistiskt optimala längden på upptagningsfasen, för produktion av statistiskt acceptabla data (BCFk) är den period som krävs för att kurvan över koncentrationslogaritmen för det undersökta ämnet i fisken, avsatt mot en linjär tidsaxel, till att nå minst 50-procentig stabilitet (dvs. 0,69/k2), men inte mer än 95-procentig stabilitet (dvs. 3,0/k2) (11). Om ackumuleringen går utöver 95 % stabilt tillstånd kan en beräkning av BCFSS göras.

Tiden för att nå 80 % stabilt tillstånd är (med användning av ekvation A5.14):

0,80 1 e k 2t | [Ekvation A5.15]

eller

t 80 ln 0,20 k 2 1,6 k 2 | [Ekvation A5.16]

Likaså är tiden för att nå 95 % stabilt tillstånd:

t 95 ln 0,05 k 2 3,0 k 2 | [Ekvation A5.17]

Upptagningsfasens varaktighet (dvs. tiden till dess att en viss procent av stabilt tillstånd nås, t.ex. t80 eller t95) för ett testämne med log KOW = 4 skulle t.ex. vara (med användning av ekvationerna A5.5, A5.16 och A5.17):

logk2 = 1,47 – 0,414 · 4

k2 = 0,652 dag– 1

t 80 1,6 0,652 2,45dagar 59 timmar

eller t 95 3,0 0,652 4,60dagar 110 timmar.

Alternativt kan följande uttryck användas:

teSS = 6,54 · 10 – 3 · KOW + 55,31 (timmar) | [Ekvation A5.18]

kan användas för att beräkna den tid det tar tills faktiskt stabilt tillstånd (teSS) uppnås (12). För ett testämne med logg Kow = 4 resulterar detta i:

teSS = 6,54 · 10 – 3 · 104 + 55,31 = 121 timmar

3. PREDIKTION AV UTSÖNDRINGSFASENS LÄNGD

Prediktion av den tid som krävs för att minska mängden ämne i kroppen, till en viss del av den ursprungliga koncentrationen, kan också göras med den allmänna ekvationen för upptagning och utsöndring (med första ordningens kinetik), jfr Ekvation A5.9 (1) (13).

För utsöndringsfasen antas Cw (eller Cfood för testet med exponering via föda) vara noll. Ekvationen kan därefter reduceras till:

dC f dt k 2C f | [Ekvation A5.19]

eller

C f C f,0 e k 2t | [Ekvation A5.20]

där Cf,0 är koncentrationen vid början av utsöndringsperioden.

50-procentig utsöndring nås då vid tiden (t50):

C f C f,0 1 2 e – k 2t 50

eller

t 50 – ln 0,50 k 2 0,693 k 2

Likaså kommer 95-procentig utsöndring att nås vid:

t 95 – ln 0,05 k 2 3,0 k 2

Om en upptagning på 80 % används för den första perioden (1,6/k2) och en 95-procentig förlust i utsöndringsfasen (3,0/k2), är utsöndringsfasen ungefär dubbelt så lång som utsöndringen i upptagningsfasen.

Observera dock att dessa beräkningar är grundade på förutsättningen att upptagnings-och utsöndringsmönstren följer första ordningens kinetik. Om det är uppenbart att första ordningens kinetik inte följs är dessa uppskattningar inte giltiga.

4. STEGVIS METOD: BESTÄMNING AV UTSÖNDRINGSKONSTANTEN (FÖRLUST) K2

De flesta biokoncentrationsdata har förutsatts bli skäligen väl beskrivna med en enkel tvådelad modell eller tvåparametersmodell, på det sätt som visas med den räta kurva som närmar sig punkterna för koncentrationen i fisk (på en ln-skala) under utsöndringsfasen.

In(concentration)

Cf2

Cf1

time

Observera att avvikelser från en rät linje kan vara ett tecken på ett mer komplext utsöndringsmönster än första ordningens kinetik. Den grafiska metoden kan användas för att särskilja utsöndringstyper som avviker från första ordningens kinetik.

För att beräkna k2 för flera provtagningstillfällen och provtagningspunkter görs en linjär regression av ln(koncentration) mot tiden. Regressionslinjens lutning är en uppskattning av utsöndringskonstanten k2. Utifrån skärningspunkten är det enkelt att beräkna den genomsnittliga koncentrationen i fisken i början av utsöndringsfasen(C0,d, som motsvarar den genomsnittliga koncentrationen i fisken i slutet av upptagningsfasen (inklusive felmarginaler):

C0,d = eintercept | [Ekvation A5.21]

Vid beräkning av k2 när endast två provtagningstidpunkter och provtagningspunkter finns tillgängliga (som i den minimerade utformningen) ersätts de två genomsnittliga koncentrationerna i följande ekvation:

k 2 ln C fl ln C f2 t 2 t 1 | [Ekvation A5.22]

Där ln(Cf1) och ln(Cf2) är de naturliga logaritmerna för koncentrationerna vid tidpunkterna t1 respektive t2, och t2 och t1 är de tidpunkter då de två proven samlades in i förhållande till utsöndringsfasens början.

5. STEGVIS METOD: BESTÄMNING AV UPPTAGNINGSKONSTANTEN K1 (ENDAST VATTENEXPONERINGSMETODEN)

För att finna ett värde för k1 utifrån en uppsättning koncentrationsdata sekventiella i tiden för upptagningsfasen behövs ett datorprogram som passar följande modell:

C f t C w t k 1 k 2 1 e k 2t | [Ekvation A5.23]

Om k2 fås fram genom den föregående beräkningen är Cf(t) och Cw(t) koncentrationerna i fisk respektive vatten vid tidpunkten t.

För att beräkna k1 när endast två provtagningstidpunkter och provtagningspunkter finns tillgängliga (som i den minimerade utformningen) används följande formel:

k 1 C f k 2 C w 1 e k 2t | [Ekvation A5.24]

Om k2 fås fram genom den föregående beräkningen är Cf koncentrationen i fisken i början av utsöndringsfasen, och Cw är den genomsnittliga koncentrationen i vattnet under upptagningsfasen.

En visuell inspektion av lutningarna för k1 och k2 när de avsätts mot uppmätta data vid provtagningspunkterna kan användas för att bedöma anpassningsgraden. Om det visar sig att den stegvisa metoden har gett en dålig uppskattning för k1 bör den samtidiga metoden för att beräkna k1 och k2 användas (se avsnitt 6). Även här bör de resulterande lutningarna jämföras mot avsatta uppmätta data för visuell inspektion av anpassningsgraden. Om anpassningsgraden fortfarande är dålig kan det vara en indikation på att första ordningens kinetik inte gäller och mer komplexa metoder bör användas.

6. SAMTIDIG METOD FÖR BERÄKNING AV UPPTAGNINGSKONSTANTEN OCH UTSÖNDRINGSKONSTANTEN (FÖRLUST) (ENDAST VATTENEXPONERING)

Datorprogram kan användas för att finna värdena för k1 och k2 utifrån en uppsättning koncentrationsdata sekventiella i tiden och med följande ekvation:

C f C w k 1 k 2 1 e k 2t | 0 < t < tc | [Ekvation A5.25]

C f C w k 1 k 2 e k 2 t t c e k 2t | t > tc | [Ekvation A5.26]

där

Denna metod ger direkt standardfel för uppskattningarna av k1 och k2. När k1/k2 ersätts med BCV (jfr ekvation A5.4) i ekvationerna A5.25 och A5.26, kan även standardfelet och det 95-procentiga konfidensintervallet (CI) uppskattas. Detta är särskilt användbart vid jämförelser av uppskattningar som skiljer sig åt på grund av datatransformation. Den beroende variabeln (fiskkoncentration) kan anpassas med eller utan ln-transformation, vilket gör det möjligt att beräkna osäkerheten för den resulterande BCF.

Eftersom ett starkt samband finns mellan de två parametrarna k1 och k2 om de beräknas samtidigt, kan det vara tillrådligt att först beräkna k2 från enbart utsöndringsdata (se ovan). I de flesta fall kan k2 uppskattas i utsöndringskurvan med förhållandevis hög precision och k1 kan därefter beräknas från upptagningsdata med icke-linjär regression. Det rekommenderas att använda samma dataomvandling vid montering sekventiellt.

En visuell inspektion av de resulterande lutningarna när de avsätts mot uppmätta data vid provtagningspunkterna kan användas för att bedöma anpassningsgraden. Om det visar sig att denna metod har gett en dålig uppskattning för k1 kan den samtidiga metoden för att beräkna k1 och k2 användas. Den anpassade modellen bör återigen jämföras mot avsatta uppmätta data för visuell inspektion av anpassningsgraden. De resulterande parameteruppskattningarna för k1, k2 och BCF och deras standardfel och/eller konfidensnivåer bör jämföras mellan olika typer av anpassningar.

Om anpassningsgraden är dålig kan det vara en indikation på att första ordningens kinetik inte gäller och mer komplexa metoder bör användas. En av de vanligaste komplikationerna är fiskens tillväxt under testet.

7. KORRIGERING AV UTSPÄDNING FÖR KINETISK BCF OCH BMF

I detta avsnitt beskrivs en standardmetod för korrigering på grund av fiskens tillväxt under testet (så kallad utspädning på grund av tillväxt). Metoden är endast giltig om första ordningens kinetik gäller. Om det finns indikationer på att första ordningens kinetik inte gäller bör man inhämta råd från biostatistiker för en korrekt korrigering av utspädning på grund av tillväxt eller använda den massbaserade metod som beskrivs nedan.

I vissa fall saknar denna metod för att korrigera utspädning på grund av tillväxt tillräcklig precision och ibland fungerar den inte (för mycket långsamt utsöndrande ämnen som testas hos snabbväxande fisk kan t.ex. den härledda utsöndringskonstanten korrigerad för utspädning på grund av tillväxt, k2g, vara mycket liten, vilket innebär att det fel i de två konstanter som används för att härleda den blir kritiskt, och i andra fall kan kg-uppskattningarna bli större än k2). I sådana fall kan en alternativ metod (dvs. den massbaserade metoden) användas, som också fungerar om första ordningens kinetik inte har följts. På så sätt behöver man inte göra korrigeringar. Denna metod beskrivs i slutet av detta avsnitt.

Metod för att subtrahera tillväxtkonstanten för tillväxtkorrigering.

I standardmetoden omvandlas alla individuella vikt- och längddata till naturliga logaritmer, och ln(vikt) eller ln(1/vikt) avsätts mot tid (dag), separat för behandlings- och kontrollgrupperna. Samma process utförs separat för data från upptagnings- och utsöndringsfaserna. När det gäller korrigering av utspädning på grund av tillväxt är det i allmänhet lämpligare att använda viktdata från hela undersökningen för att härleda tillväxtkonstanten (kg), men statistiskt signifikanta skillnader mellan de tillväxtkonstanter som härletts för upptagnings- och utsöndringsfaserna kan visa att konstanten för utsöndringsfasen bör användas. Totala tillväxtkonstanter från vattenundersökningar för test- och kontrollgrupper kan användas för att kontrollera eventuella behandlingsrelaterade effekter.

En linjär korrelation med minsta kvadratmetoden beräknas för ln(fiskvikt) som funktion av dag (och för ln(1/vikt) som funktion av dag) för varje grupp (test- och kontrollgrupper, individuella data, inte dagliga medelvärden) för hela undersökningen och för upptagnings- och utsöndringsfaserna med användning av statistiska standardförfaranden. Varianserna i linjernas lutningar beräknas och används för att utvärdera den statistiska signifikansen (p = 0,05) för skillnaden i kurvorna (tillväxtkonstanter) med Student t-test (eller ANOVA om fler än en koncentration används). Viktdata är i allmänhet att föredra för tillväxtkorrigeringar. Längddata, behandlade på samma sätt, kan vara användbara för att jämföra test- och kontrollgrupperna med avseende på behandlingsrelaterade effekter. Om det inte finns någon statistiskt signifikant skillnad i analysen av viktdata kan test- och kontrolldata slås ihop och en total tillväxtkonstant för undersökningen (kg) beräknas som den linjära korrelationens totala lutning. Om statistiskt signifikanta skillnader observeras ska tillväxthastighetskonstanterna för varje fiskgrupp och/eller undersökningsfas redovisas separat. Tillväxtkonstanten för varje behandlad grupp används sedan för korrigering av utspädning på grund av tillväxt för den gruppen. Om statistiska skillnader mellan upptagnings- och utsöndringsfasens konstanter observerats bör de konstanter som härletts från utsöndringsfasen användas.

Den beräknade tillväxtkonstanten (kg, uttryckt som dag– 1) kan subtraheras från den totala utsöndringskonstanten (k2) för att få fram utsöndringskonstanten, k2g.

k2g = k2 – kg | [Ekvation A5.27]

Upptagningskonstanten divideras med den tillväxtkorrigerade utsöndringskonstanten för att få fram tillväxtkorrigerad kinetisk BCF, som benämns BCFKg (eller BMFKg).

BCF Kg k 1 k 2g | [Ekvation A5.28]

En tillväxtkonstant som har härletts för ett test med exponering via föda används i ekvation A7.5 för att beräkna tillväxtkorrigerad BMFKg (jfr tillägg 7).

Massbaserad metod för tillväxtkorrigering

Det finns en alternativ metod till den ovanstående metoden för att subtrahera tillväxtkonstanten för tillväxtkorrigering, där man undviker behovet av korrigera för tillväxt. Metoden används enligt följande. Principen är att använda utsöndringsdata på massbasis per hel fisk i stället för en koncentrationsbaserad metod.

Konvertera vävnadskoncentrationer från utsöndringsfasen (testämnets massa/fiskens enhetsmassa) till testämnesmassa/fiskmassa: matcha koncentrationer och längd för enskilda fiskar i tabellform (t.ex. med användning av ett datakalkylblad) och multiplicera varje koncentration med total fiskvikt för den mätningen. På så sätt får man fram en uppsättning testämnesmassa/fiskmassa för alla prover från utsöndringsfasen.

Avsätt den resulterande naturliga logaritmen för data om ämnesmassa mot tidpunkten för försöket (utsöndringsfasen) så som skulle ha gjorts normalt.

För vattenexponeringsmetoden härleds upptagningskonstanten rutinmässigt (se avsnitten 4 och 6), observera att ett normalt k2-värde bör användas i ekvationerna med anpassade kurvor för k1) och härled utsöndringskonstanten från ovanstående data. Eftersom det resulterande värdet för utsöndringshastighetskonstanten är oberoende av tillväxt, eftersom det har härletts baserat på massa per hel fisk, bör det betecknas som k2g och inte k2.

8. NORMALISERING AV FETTHALTEN TILL 5 % (ENDAST VATTENEXPONERINGSMETODEN)

BCF-resultat (kinetiskt och stabilt tillstånd) från vattenexponeringstester bör också redovisas i förhållande till standardvärdet för fetthalt i fisk på 5 % (våtvikt) om det inte kan hävdas att testämnet inte primärt ackumuleras i fettet (t.ex. att vissa perfluorerade ämnen kan bindas till proteiner). Data om fiskkoncentration eller BCF måste omvandlas till 5 % fetthalt, våtvikt. Om samma fiskar har använts för att mäta ämneskoncentrationer och fetthalt vid alla provtagningspunkter måste varje enskild uppmätt koncentration i fisken korrigeras för det fettvärdet.

C f,L 0,05 L C f | [Ekvation A5.29]

där

Om fetthaltsanalysen inte har utförts på all provtagningsfisk används ett medelvärde för fetthalten för att normalisera BCF. För BCF i stabilt tillstånd bör man använda det medelvärde som registrerats för behandlingsgruppen i slutet av upptagningsfasen. När det gäller normalisering av en kinetisk BCF kan en annan metod krävas i vissa fall, t.ex. om fetthalten har förändrats markant under upptagnings- eller utsöndringsfasen. I alla händelser bör ett utfodringsintervall som minimerar dramatiska förändringar i fetthalten användas rutinmässigt.

BCF KL 0.05 L n BCF K | [Ekvation A5.30]

där

LITTERATUR

1 Arnot J.A. och Gobas F.A.P.C. (2004), A food web bioaccumulation model for organic chemicals in aquatic ecosystems, Environ. Toxicol. Chem. 23: 2343–2355

2 Kapitel C.20 i denna bilaga, Reproduktionstest på Daphnia magna.

3 Spacie A. and Hamelink J.L. (1982), Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1: 309-320.

4 Sijm D.T.H.M., Verberne M.E., de Jonge W.J., Pärt P. and Opperhuizen A. (1995), Allometry in the uptake of hydrophobic chemicals determined in vivo and in isolated perfused gills. Toxicol. Appl. Pharmacol. 131: 130-135.

5 Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993), Nonlinear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR QSAR Environ. Res. 1: 29-39.

6 Kristensen P. (1991), Bioconcentration in fish: comparison of BCF's derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute, Hørsholm, Denmark.

7 Arnot J.A., Meylan W., Tunkel J., Howard P.H., Mackay D., Bonnell M. and Boethling R.S. (2009), A quantitative structure-activity relationship for predicting metabolic biotransformation rates for organic chemicals in fish. Environ. Toxicol. Chem. 28: 1168-1177.

8 OECD (2011), QSAR Toolbox 2.1. February 2011. Available from: http://www.oecd.org/document/54/0,3746,en_2649_34379_42923638_1_1_1_1,00.html.

9 Branson D.R., Blau G.E., Alexander H.C. and Neely W.B. (1975). Bioconcentration of 2,2′,4,4′ tetrachlorobiphenyl in rainbow trout as measured by an accelerated test. T. Am. Fish. Soc. 104: 785-792.

10 Ernst W. (1985), Accumulation in aquatic organisms, in Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of chemicals, Sheeman, P., et al., Editors. John Wiley & Sons Ltd, New York, NY, USA: 243-255.

11 Reilly P.M., Bajramovic R., Blau G.E., Branson D.R. and Sauerhoff M.W. (1977), Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kinetic models. Can. J. Chem. Eng. 55: 614-622.

12 Hawker D.W. and Connell D.W. (1988), Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 701-707.

13 Konemann H. and van Leeuwen K. (1980), Toxicokinetics in fish: Accumulation and elimination of six chlorobenzenes by guppies. Chemosphere. 9: 3-19.

1 Precis som för alla empiriska förhållanden bör man kontrollera att testämnet omfattas av förhållandets tillämpningsområde

2 Fiskens vikt i slutet av upptagningsfasen kan uppskattas från tidigare undersökningsdata eller kunskap om artens sannolika viktökning, från en typisk vikt vid teststarten och under en upptagningsfas med typisk varaktighet (t.ex. 28 dagar).

3 De flesta program som tillåter linjär regression ger även standardfel och konfidensintervall (CI) för uppskattningarna, t.ex. Microsoft Excel med verktygspaketet för dataanalys.

4 De flesta program som tillåter linjär regression ger även standardfel och konfidensintervall (CI) för uppskattningarna, t.ex. Microsoft Excel med verktygspaketet för dataanalys.

5 Till skillnad från den linjära regressionsmetoden ger denna formel inte ett standardfel för k2

6 Till skillnad från en linjär anpassningsmetod ger denna formel vanligen inte ett standardfel eller konfidensintervall för uppskattad k1.

7 Man bör vara medveten om att osäkerheten i k2-uppskattningen inte används på rätt sätt i bioackumuleringsmodellen om den endast betraktas som en konstant när k1 passas in i den stegvisa modellen. Den osäkerhet i BCF som blir resultatet kommer därför att skilja sig mellan den samtidiga och den stegvisa modellen

Tillägg 6

AVSNITT MED EKVATIONER FÖR VATTENEXPONERINGSTESTET: MINIMERAD TESTUTFORMNING

Den logiska grunden för denna metod är att biokoncentrationsfaktorn i ett fullständigt test antingen kan bestämmas som biokoncentrationsfaktorn i stabilt tillstånd (BCFSS) genom att beräkna förhållandet mellan koncentrationen av testämnet i fiskens vävnader och testämnets koncentration i vatten, eller genom att beräkna den kinetiska biokoncentrationsfaktorn (BCFK) som förhållandet mellan upptagningshastighetskonstanten k1 och utsöndringskonstanten k2. BCFK är giltig även om ämnets koncentration inte uppnår stabilt tillstånd under upptagningsfasen, under förutsättning att upptagningen och utsöndringen sker ungefär enligt första ordningens kinetiska processer.

Om en mätning av ämneskoncentrationen i vävnader (Cf1) görs när exponeringsfasen avslutas (t1) och koncentrationen i vävnaden (Cf2) mäts återigen efter en tid (t2), kan utsöndringskonstanten (k2) uppskattas med ekvation A5.22 i tillägg 5.

Upptagningskonstanten, k1, kan sedan bestämmas algebraiskt med hjälp av ekvation A5.23 i tillägg 5 (där Cf motsvarar Cf1 och t motsvarar t1) (1). Den kinetiska biokoncentrationsfaktorn för den minimerade utformningen (som benämns BCFKm för att åtskilja den från kinetiska biokoncentrationsfaktorer som bestämts med andra metoder) är således:

BCF Km k 1 k 2 | [Ekvation A6.1]

Koncentrationerna eller resultaten bör korrigeras för tillväxt på grund av utspädning och normaliseras till en fetthalt på 5 % enligt beskrivningen i tillägg 5.

Den minimerade BCFSS är den BCF som beräknas i slutet av upptagningsfasen, med antagandet att stabilt tillstånd har uppnåtts. Detta kan bara antas, eftersom antalet provtagningspunkter inte är tillräckligt för att bevisa detta.

minimeradBCF SS C f minSS C w minSS | [Ekvation A6.2]

där

LITTERATUR

(1) Springer T.A., Guiney P.D., Krueger H.O. och Jaber M.J. (2008), Assessment of an approach to estimating aquatic bioconcentration factors using reduced sampling. Environ. Toxicol. Chem. 27: 2271–2280.

Tillägg 7

AVSNITT MED EKVATIONER FÖR TEST MED EXPONERING VIA FÖDA

1. Exempel på mängder för beståndsdelar i ett lämpligt kommersiellt fiskfoder

2. Exempel på inblandningstekniker

3. Beräkning av assimileringseffektiviteten och biomagnifikationsfaktorn

4. Korrigering för fetthalt

5. Utvärdering av skillnader mellan uppmätt koncentration vid tiden noll (C0, m) och härledd koncentration vid tiden noll (C0, d)

6. Vägledning för mycket snabbt utsöndrande testämnen

1. EXEMPEL PÅ MÄNGDER FÖR BESTÅNDSDELAR I ETT LÄMPLIGT KOMMERSIELLT FISKFODER

Huvudbeståndsdel | Fiskmjöl

Råprotein | ≤ 55,0

Råfett | ≤ 15,0 %

Växttråd | ≥ 2,0

Fukt | ≥ 12 %

Aska | ≥ 8 %

2. EXEMPEL PÅ INBLANDNINGSTEKNIKER

Allmänt

Kontrollfodret bör beredas på exakt samma sätt som det behandlade fodret, men utan testämnet.

För ett kontrollera koncentrationen i det behandlade fodret bör tredubbla prover av det behandlade fodret extraheras med en lämplig extraktionsmetod för att mäta testämneskoncentration eller radioaktivitet. Höga analytiska utbyten (> 85 %) med låg variation mellan proverna bör påvisas (tre provkoncentrationer för ämnet tas vid teststarten, som inte får variera mer än ± 15 % från medelvärdet).

I testet med exponering via föda bör tre foderprover samlas in för analys dag 0 och i slutet av upptagningsfasen för att bestämma halten av testämne i fodret.

Beredning av fiskfoder med ett flytande testmaterial (rent)

En nominell måltestkoncentration i det behandlade fiskfodret fastställs, t.ex. 500 μg testämne/g foder. En lämplig mängd (per molmassa eller specifik radioaktivitet) av rent testämne tillsätts till en känd massa fiskfoder i ett glaskärl eller en rotationsindunstare. Massan av fiskfoder bör vara så stor att den räcker under hela upptagningsfasen (eftersom mängderna av varje foder måste ökas allteftersom fisken växer). Fiskfodret/testämnet bör blandas över natten med långsam tumling (t.ex. med en roto-rack-mixer eller en rotationsindunstare om en sådan används). Det behandlade fodret bör förvaras under förhållanden där testämnets stabilitet i foderblandningen upprätthålls (t.ex. kylning) fram till användning.

Beredning av fiskfoder med en majs- eller fiskoljevehikel

Fasta testämnen bör malas i en mortel till ett fint pulver. Flytande testämnen kan tillsättas direkt till majs eller fiskolja. Testämnet löses i en känd mängd majs eller fiskolja (t.ex. 5–15 ml). Den doserade oljan överförs kvantitativt till en rotationsindunstare av lämplig storlek. Den kolv som används för att bereda den doserade oljan sköljs med två små delar olja som sedan tillsätts rotationsindunstarens glasbehållare för att se till att allt upplöst testämne överförs. För att säkerställa fullständig upplösning/dispersion i oljan (eller om fler än ett testämne används i undersökningen) tillsätts en mikroomrörare, kolven proppas igen och blandningen ställs in på snabb omrörning över natten. En lämplig mängd fiskfoder (vanligen i pelletform) för testet tillsätts behållaren och glasbehållarens innehåll blandas homogent genom att behållaren kontinuerligt vänds i minst 30 minuter, men helst över natten. Därefter förvaras det behandlade fodret på lämpligt sätt (t.ex. i kylskåp) för att upprätthålla testämnets stabilitet i fodret fram till användning.

Beredning av fiskfoder med ett organiskt lösningsmedel

En lämplig mängd av testämnet (per molmassa eller specifik radioaktivitet), tillräcklig för att uppnå måldosen, löses upp i ett lämpligt organiskt lösningsmedel (t.ex. cyklohexan eller aceton, 10–40 ml, eller en större volym om det är nödvändigt beroende på kvaliteten på det foder som ska behandlas). Antingen en del eller alla delar (de tillsätts portionsvis) av denna lösning blandas med en tillräcklig massa fiskfoder för att uppnå testets fastställda nominella dosnivå. Fodret/testämnet kan blandas i en mixerskål av rostfritt stål. Det nydoserade fiskfodret lämnas kvar i skålen och får stå i ett dragskåp i två dagar (det ska röras om då och då) för att låta överskottet av lösningsmedel avdunsta. Det kan också blandas i en rotationsindunstare med kontinuerlig rotation. Överskottet av lösningsmedel kan blåsas bort under en ström av luft eller kväve om så är nödvändigt. Det är viktigt att se till att testämnet inte kristalliseras när lösningsmedlet avlägsnas. Det behandlade fodret bör förvaras under förhållanden (t.ex. kylning) där testämnets stabilitet i foderblandningen upprätthålls fram till användning.

3. BERÄKNING AV ASSIMILERINGSEFFEKTIVITETEN OCH BIOMAGNIFIKATIONSFAKTORN

För att beräkna assimileringseffektiviteten bör man först uppskatta den totala avsöndringskonstanten enligt avsnitt 4 i tillägg 5 (med den stegvisa metoden, dvs. den linjära standardmetoden) med användning av genomsnittliga provkoncentrationer från utsöndringsfasen. Utfodringskonstanten, I, och upptagningsfasens varaktighet, t, är kända parametrar i undersökningen. Cfood, den genomsnittliga uppmätta koncentrationen av testämnet i fodret, är en uppmätt variabel i undersökningen. C0,d, testämnets koncentration i fisken i slutet av upptagningsfasen, härleds i regel från skärningspunkten i ett diagram över ln(koncentration) som funktion av utsöndringsdag.

Ämnets assimileringseffektivitet (a, absorption av testämnet genom tarmen) beräknas enligt följande:

α C 0,d k 2 I C food 1 1 e k 2t | [Ekvation A7.1]

där

Den utfodringskonstant, I, som används i beräkningen kan dock behöva justeras för tillväxt för att ge en korrekt assimileringseffektivitet, a. I ett test där fisken växer avsevärt under upptagningsfasen (och ingen korrigering av fodermängderna görs för att upprätthålla det fastställda utfodringsintervallet) kommer det effektiva utfodringsintervallet att vara lägre än det fastställda intervallet allteftersom upptagningsfasen fortsätter, vilket leder till en högre reell assimileringseffektivitet. (Observera att detta inte är av vikt för den övergripande beräkningen av BMF, eftersom I-termerna upphävs mellan ekvation A7.1 och ekvation A7.4). Den genomsnittliga utfodringskonstanten korrigerad för utspädning på grund av tillväxt, Ig, kan härledas på flera sätt, men en direkt och noggrann metod är att använda den kända tillväxtkonstanten (kg) för att uppskatta testfiskens vikt vid olika tidpunkter under upptagningsfasen, dvs.

W f t W f,0 e k g t | [Ekvation A7.2]

där

På detta sätt kan (åtminstone) fiskens genomsnittliga vikt på den sista exponeringsdagen (Wf,end-of-uptake) uppskattas. Eftersom utfodringskonstanten fastställdes baserat på Wf,0 kan den effektiva utfodringskonstanten för varje upptagningsdag beräknas med användning av dessa två viktvärden. Den tillväxtkorrigerade utfodringskonstanten, Ig (g foder g– 1 fisk dag– 1), som används i stället för I vid snabb tillväxt under upptagningsfasen, kan då beräknas som

I g I W f,0 W f,end-of-uptake | [Ekvation A7.3]

När assimileringseffektiviteten har erhållits kan BMF beräknas genom att den multipliceras med utfodringskonstanten I (eller Ig, om det värdet använts för att beräkna α). Därefter divideras produkten med den totala utsöndringskonstanten k2:

BMF I α k 2 | [Ekvation A7.4]

Den tillväxtkorrigerade biomagnifikationsfaktorn bör också beräknas på samma sätt, med användning av den tillväxtkorrigerade utsöndringskonstanten (som härleds enligt avsnitt 7 i tillägg 5). Återigen, om Ig har använts för att beräkna α, bör den även användas här i stället för I:

BMF I α k 2g | [Ekvation A7.5]

där

Den tillväxtkorrigerade halveringstiden (t1/2) beräknas enligt följande:

t 1 2 0,693 k 2g | [Ekvation A7.6]

Ämnets assimileringseffektivitet från födan kan också uppskattas om vävnadsrester bestäms under den linjära fasen av upptagningsfasen (mellan dag 1 och 3). I detta fall kan ämnets assimileringseffektivitet (α) bestämmas enligt följande:

α C fish t I C food t | [Ekvation A7.7]

där

4. KORRIGERING FÖR FETTHALT

Om fetthalten mättes i samma fisk som den kemiska analysen för alla provtagningsintervall bör de individuella koncentrationerna korrigeras för fetthalt och ln(koncentrationen, korrigerad för fetthalt) avsättas mot utsöndring (dag) för att få fram C0,d och k2. Assimileringseffektiviteten (ekvation A7.1) kan därefter beräknas på grundval av fetthalt, med användning av Cfood baserat på fetthalt (dvs. Cfood multipliceras med fodrets genomsnittliga fettfraktion). Genom en beräkning med ekvationerna A7.4 och A7.5 får man därefter direkt fram BMF korrigerad för fetthalt (samt korrigerad för utspädning på grund av tillväxt).

I annat fall härleds den genomsnittliga fettfraktionen (massförhållande) i fisken och fodret både för behandlings- och kontrollgrupperna (för foder och fisken i kontrollgruppen görs detta vanligen från data som mäts i början och slutet av exponeringsperioden, för fisken i behandlingsgruppen görs det vanligen från data som mätts endast i slutet av exponeringsperioden). I vissa undersökningar kan fiskens fetthalt öka markant. I ett sådant fall är det lämpligare att använda en genomsnittlig fettkoncentration hos testfisken som beräknats från de uppmätta värdena i slutet av exponerings- och utsöndringsfaserna. Generellt bör endast data från behandlingsgruppen användas för att härleda båda fettfraktionerna.

Korrigeringsfaktorn för fetthalt (Lc) beräknas enligt följande:

L C L fish L food | [Ekvation A7.8]

där Lfish och Lfood är de genomsnittliga fettfraktionerna i fisken respektive fodret.

Korrigeringsfaktorn för fetthalt används för att beräkna biomagnifikationsfaktorn korrigerad för fetthalt (BMFL):

BMF L BMF L C | [Ekvation A7.9]

5. UTVÄRDERING AV SKILLNADER MELLAN UPPMÄTT KONCENTRATION VID TIDEN NOLL (C0, M) OCH HÄRLEDD KONCENTRATION VID TIDEN NOLL (C0, D)

Den uppmätta koncentrationen vid tiden noll (C0, m) och den härledda koncentrationen vid tiden noll (C0, d) bör jämföras. Om de är mycket lika stöder detta den modell för första ordningen som använts för att härleda utsöndringsparametrarna.

I vissa undersökningar kan det finnas en markerad skillnad mellan det härledda värdet vid tiden noll, C0,d, och den genomsnittliga uppmätta koncentrationen vid tiden noll. C0, m (se sista punktsatsen i punkt 159 i denna testmetod). Om C0,d är mycket lägre än C0,m (C0,d << C0,m) kan skillnaden tyda på förekomst av osmält behandlat foder i tarmen. Detta kan testas experimentellt genom att en separat analys utförs på den utskurna tarmen i det fall ytterligare prover (hel fisk) togs och lagrades i slutet av upptagningsfasen. Om ett statistiskt giltigt test för avvikande värden tillämpat på utsöndringsfasens linjära regression visar att den första provtagningspunkten i utsöndringsfasen är felaktigt förhöjd, kan en linjär regression för att härleda k2 vara lämplig, men utan den första utsöndringskoncentrationspunkten. Om osäkerheten i den linjära regressionen minskas starkt och det står klart att ungefärlig första ordningens kinetik för utsöndringen följdes, kan det vara lämpligt att använda de resulterande värdena C0,d och k2 i beräkningen av assimileringseffektivitet. Detta bör vederbörligen motiveras i rapporten. Det är också möjligt att kinetik som inte är av första ordningen var verksam i utsöndringsfasen. Om detta är sannolikt (dvs. de data som omvandlats till naturliga logaritmer förefaller följa en kurva jämfört med den linjära regressionens ritade raka linje) är beräkningarna av k2 och C0,d sannolikt ogiltiga och råd bör inhämtas från biostatistiker.

Om C0,d är mycket högre än det uppmätta värdet (C0,d >> C0,m) kan det tyda på följande: att ämnet utsöndrades mycket snabbt (dvs. provtagningspunkterna närmade sig den analytiska metodens kvantifieringsgräns i ett mycket tidigt skede i utsöndringsfasen, jfr avsnitt 6 nedan), att det finns en avvikelse från första ordningens kinetik, att den linjära regressionen för att härleda k2 och C0,d är felaktig eller att det uppstod problem med de uppmätta koncentrationerna i undersökningen vid några provtagningstidpunkter. I sådana fall bör diagrammet över den linjära regressionen kontrolleras för att se om det finns bevis för prover som ligger vid eller nära kvantifieringsgränsen, om avvikelser förekommer och om det finns en uppenbar kurva (vilket tyder på att första ordningens kinetik inte följs). Detta ska redovisas i rapporten. Eventuella senare omvärderingar av den linjära regressionen för att förbättra de uppskattade värdena ska beskrivas och motiveras. Om en markerad avvikelse från första ordningens kinetik observeras är beräkningarna av k2 och C0,d sannolikt ogiltiga och råd bör inhämtas från biostatistiker.

6. VÄGLEDNING FÖR MYCKET SNABBT UTSÖNDRANDE TESTÄMNEN

Såsom diskuteras i punkt 129 i testmetoden kan vissa ämnen utsöndras så snabbt att en tillförlitlig nollkoncentration i tid, C0,d, och k2 inte kan härledas. Detta beror på att det redan mycket tidigt i utsöndringsfasen (dvs. från det andra avsöndringsprovet och framåt) inte längre är möjligt att mäta proverna (koncentrationerna rapporteras vid kvantifieringsgränsen). Denna situation observerades för benso[a]pyren i den provningsjämförelse som utfördes som underlag för denna testmetod, och har dokumenterats i metodens valideringsrapport. I sådana fall är det inte möjligt att göra en tillförlitlig linjär regression. Den ger sannolikt en orealistiskt hög uppskattning av C0,d, vilket leder till en skenbar assimileringseffekt som är mycket högre än 1. I dessa fall är det möjligt att beräkna en konservativ uppskattning av k2 och en BMF med en övre gräns.

De datapunkter från utsöndringsfasen där en koncentration mättes, fram till och inklusive den första koncentration som inte detekteras (koncentration vid kvantifieringsgränsen), ger en linjär regression (med användning av koncentrationsdata som omvandlats med en naturlig logaritm mot tiden) en uppskattning av k2. I dessa fall kommer sannolikt endast två datapunkter att vara aktuella (t.ex. provdagarna 1 och 2 i utsöndringsfasen). Därefter kan k2 beräknas med hjälp av ekvation A5.22 i tillägg 5. Denna k2-uppskattning kan användas för att uppskatta assimileringseffektiviteten enligt ekvation A7.1, genom att ersätta C0,d-värdet i ekvationen med uppmätt nollkoncentration i tiden (C0,m) i fall där det står klart att C0,d uppskattas vara mycket högre än det värde som skulle kunna uppnås i testet. Om C0, m inte var mätbart bör detektionsgränsen i fiskvävnad användas. Om detta i vissa fall ger ett värde på α > 1 antas assimileringseffektiviteten vara 1 som ett värsta scenario.

Därefter kan högsta BMFK uppskattas med hjälp av ekvation A7.4, och bör anges som mycket mindre än (<<) värdet. I en undersökning som har utförts med ett foderintervall på 3 %, en halveringstid för utsöndringen som är kortare än tre dagar och ett värsta scenario α på 1, kommer BMFK t.ex. sannolikt vara lägre än cirka 0,13. Med tanke på syftet med denna uppskattning och det faktum att värdena kommer att vara konservativa behöver de inte korrigeras för utspädning på grund av tillväxt eller fetthalt i fisk eller foder.

1 I vissa regioner kan det endast vara möjligt att erhålla fiskfoder med en fettkoncentration som ligger långt från denna övre gräns. I ett sådant fall bör undersökningen utföras med lägre fettkoncentration i fodret som det levereras och utfodringsintervallerna justeras på lämpligt sätt för att upprätthålla fiskens hälsa. Foderfettet bör inte ökas artificiellt med ett överskott av olja.

Tillägg 8

METODER FÖR ATT UPPSKATTA PRELIMINÄRA BCF FRÅN DATA SOM SAMLATS IN I STUDIEN MED EXPONERING VIA FÖDA

Den metod med exponering via föda som ingår i denna testmetod för testning av bioackumulering av ämnen som i praktiken inte kan testas med metoden med exponering via vatten. Vattenexponeringsmetoden ger en biokoncentrationsfaktor, medan födoexponeringsmetoden leder direkt till information om utfodringens biomagnifikationspotential. Information om biokoncentration i vatten krävs enligt många kemikaliesäkerhetssystem (t.ex. för riskbedömningar och det globalt harmoniserade systemet för klassificering och märkning av kemikalier). Därför finns det ett behov av att använda data som genereras i födostudier för att uppskatta en biokoncentrationsfaktor som är jämförbar med tester som utförs enligt vattenexponeringsmetoden. I detta avsnitt behandlas metoder för att göra detta samt de inneboende bristerna i uppskattningarna.

Födostudien mäter utsöndring för att ge en utsöndringskonstant, k2. Om en upptagningskonstant kan uppskattas på grundval av tillgängliga data i en situation där fisken har exponerats för testämnet via vatten kan också en kinetisk BCF uppskattas.

Uppskattningen av en upptagningskonstant för ett testämnes vattenexponering beror på många antaganden, som i sin tur gör uppskattningen osäker. I denna uppskattningsmetod för BCV antas också att den totala utsöndringen (inklusive bidragande faktorer som fördelning i kroppen och individuella utsöndringsprocesser) är oberoende i förhållande till den exponeringsmetod som används för att få fram en kroppsbelastning för testämnet.

Uppskattningsmetodens huvudsakliga antaganden kan sammanfattas enligt följande:

Utsöndringen efter upptagning via föda är densamma som utsöndringen efter exponering via vatten för ett givet ämne.

Upptagning från vatten följer första ordningens kinetik.

Beroende på vilken metod som används för att uppskatta upptagningen kan den korreleras

endast med fiskvikt,

endast med ämnets fördelningskoefficient oktanol/vatten,

med en kombination av fiskvikt och ämnets fördelningskoefficient oktanol/vatten.

Faktorer som kan påverka upptagningen i en vattenexponeringsundersökning i praktiken, såsom ämnets biotillgänglighet, adsorption till apparater, molekylärstorlek osv. har liten effekt.

Det viktigaste är att

den databas (övningsuppsättning) som har använts för att ta fram metoden för uppskattning av upptagning är representativ för ämnet i fråga.

I flera publikationer i den allmänt tillgängliga litteraturen har man härlett ekvationer som kopplar upptagningen från vatten i fisk via gälarna till ämnets fördelningskoefficient oktanol/vatten, fiskvikt (1) (2) (3) (4), volym och/eller fetthalt, genomträngning/diffusion i membranet (5) (6), fiskens ventilationsvolym (7) och genom en metod för flyktighet/massbalans (8) (9) (10). En detaljerad bedömning av sådana metoder ges i Crookes och Brooke (11). En publikation av Barber (12) som inriktas på modeller för bioackumulering genom upptagning via föda är också användbar i detta sammanhang eftersom den omfattar bidrag från modeller för upptagning via gälarna. En del av bakgrundsdokumentet till protokollet för exponering via föda från 2004 (13) ägnas också åt denna aspekt.

De flesta av dessa modeller verkar ha tagits fram med hjälp av begränsade databaser. För modeller där uppgifter från den databas som använts för att bygga upp modellen är tillgängliga verkar de typer av ämnen som används ofta ha en liknande struktur eller klass (funktionsmässigt, t.ex. klorerade kolväten). Detta gör det osäkert att använda en modell för att uppskatta upptagningskonstanten för en annan typ av ämne, förutom testspecifika överväganden som art, temperatur osv.

I en genomgång av tillgängliga tekniker (11) betonades att det inte finns en enda metod som är rätt. Därför bör en tydlig motivering ges för den modell som används. Om det finns flera modeller tillgängliga som det är motiverat att använda kan det vara lämpligt att presentera flera uppskattningar av k1 (och BCF) eller ett intervall av k1-värden (och BCF) enligt flera uppskattningsmetoder för upptagning. Med tanke på skillnaderna mellan modelltyperna och de datauppsättningar som har använts för att ta fram modellerna är det inte lämpligt att ta fram ett medelvärde för uppskattningar som härletts på olika sätt.

Vissa forskare har hävdat att BCF-uppskattningar av denna typ kräver en korrigering för biotillgänglighet för att ta hänsyn till ämnets adsorption till löst organiskt kol (DOC) under vattenexponeringsbetingelser. Syftet är att anpassa uppskattningen till resultaten från vattenexponeringsundersökningar (t.ex. (13) (14)). Denna korrigering är dock inte alltid lämplig med tanke på de låga nivåer av DOC som krävs i en vattenexponeringsundersökning för en uppskattning enligt det värsta scenariot (t.ex. förhållandet mellan ett biotillgängligt ämne och ett ämne uppmätt i lösning). För mycket hydrofoba ämnen kan upptagningen via gälarna begränsas på grund av nivån av passiv diffusion nära gälarnas yta. I detta fall kan korrigeringen ta hänsyn till denna effekt, och inte den effekt den utformades för.

I den födostudie som beskrivs här bör man fokusera på metoder som kräver indata för vilka det finns lätt tillgängliga uppgifter om de testade ämnena (dvs. log KOW, fiskvikt). Andra metoder som kräver mer komplexa indata kan användas, men kan kräva ytterligare mätningar i testet eller detaljerad kunskap om testämnet eller fiskarterna som kanske inte finns allmänt tillgänglig. Dessutom kan valet av modell påverkas av valideringsnivån och tillämpningsområdet (en översikt över och jämförelse av de olika metoderna ges i (11)).

Man bör tänka på att den resulterande k1-uppskattningen och uppskattad BCF är osäkra och kanske kräver en sammanvägd bedömning med härledd BMF och ämnesparametrar (t.ex. molekylstorlek) för en helhetsbild av ämnets bioackumuleringspotential. Tolkningen och användningen av dessa parametrar kan bero på regelverket.

LITTERATUR

1 Sijm D.T.H.M., Pärt P. and Opperhuizen A. (1993), The influence of temperature on the uptake rate constants of hydrophobic compounds determined by the isolated perfused gills of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquat. Toxicol. 25: 1-14.

2 Sijm D.T.H.M., Verberne M.E., Part P. and Opperhuizen A. (1994), Experimentally determined blood and water flow limitations for uptake of hydrophobic compounds using perfused gills of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): Allometric applications. Aquat. Toxicol. 30: 325-341.

3 Sijm D.T.H.M., Verberne M.E., de Jonge W.J., Pärt P. and Opperhuizen A. (1995), Allometry in the uptake of hydrophobic chemicals determined in vivo and in isolated perfused gills. Toxicol. Appl. Pharmacol. 131: 130-135.

4 Barber M.C. (2003), A review and comparison of models for predicting dynamic chemical bioconcentration in fish. Environ. Toxicol. Chem. 22: 1963-1992.

5 Opperhuizen A. (1986), Bioconcentration of hydrophobic chemicals in fish, in Aquatic Toxicology and Environmental Fate, STP 921, Poston, T.M. and Purdy, R., Editors. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, PA, USA: 304-315.

6 Arnot J.A. and Gobas F.A.P.C. (2004), A food web bioaccumulation model for organic chemicals in aquatic ecosystems. Environ. Toxicol. Chem. 23: 2343-2355.

7 Thomann R.V. (1989), Bioaccumulation model of organic chemical distribution in aquatic food chains. Environ. Sci. Technol. 23: 699-707.

8 Hendriks A.J., van der Linde A., Cornelissen G. and Sijm D.T.H.M. (2001). The power of size. 1. Rate constants and equilibrium ratios for accumulation of organic substances related to octanol-water partition ratio and species weight. Environ. Toxicol. Chem. 20: 1399-1420.

9 Campfens J. and Mackay D. (1997), Fugacity-based model of PCB bioaccumulation in complex aquatic food webs. Environ. Sci. Technol. 31: 577-583.

10 Arnot J.A. and Gobas F.A.P.C. (2003), A generic QSAR for assessing the bioaccumulation potential of organic chemicals in aquatic food webs. QSAR Comb. Sci. 22: 337-345.

11 Crookes M. and Brooke D. (2010), Estimation of fish bioconcentration factor (BCF) from depuration data. Draft Report. Environmental Agency, Bristol, UK.

12 Barber M.C. (2008), Dietary uptake models used for modelling the bioaccumulation of organic contaminants in fish. Environ. Toxicol. Chem. 27: 755-777

13 Anonymous (2004), Background document to the fish dietary study protocol, document submitted to the TC-NES WG on PBT.

14 Gobas F. and Morrison H. (2000), Bioconcentration and biomagnification in the aquatic environment, in Handbook of property estimation methods for chemicals, Boethling, R.S. and Mackay, D., Editors. Lewis Publishers, Boca Racton, FL, USA: 189-231.

1 För mycket hydrofoba ämnen är intag sannolikt den främsta exponeringsvägen i naturliga vattenmiljöer. En uppskattad BCF är därför inte helt representativ för ämnets bioackumulerande potential.

Tillägg 1

DEFINITIONER

I denna testmetod gäller följande definitioner:

LITTERATUR

1 Wilson, E.O. och Bossert, W.H. (1971). A Primer of Population Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.

2 Poole, R.W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. Mc Graw Hill Series in Population Biology, New York, s. 532.

3 Meyer, J. S., Ingersoll, C. G., McDonald, L.L. och Boyce, M.S. (1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, 1156–1166.

Tillägg 2

BEREDNING AV FULLSTÄNDIGT DEFINIERADE ELENDT M7- OCH M4-MEDIER

Acklimatisering till Elendt M7- och M4-medier

I vissa laboratorier har man stött på svårigheter vid direkt överföring av Daphnia till M4- (1) och M7-medier. En viss framgång har uppnåtts med gradvis acklimatisering, dvs. överflyttning från eget medium till 30 % Elendt, sedan till 60 % Elendt och slutligen till 100 % Elendt. Acklimatiseringsperioderna kan behöva vara upp till en månad långa.

Beredning

Spårelement

Separata stamlösningar (I) av enskilda spårelement bereds först i vatten av lämplig renhet, t.ex. avjoniserat, destillerat eller renat med omvänd osmos. Från dessa olika stamlösningar (I) bereds en andra stamlösning (II) som innehåller alla spårelement (kombinerad lösning), dvs.

Stamlösning I (enskilt ämne) | Mängd tillsatt vatten | Koncentration (relaterad till medium M4) | För beredning av den kombinerade stamlösningen II tillsätts följande mängd av stamlösning I till vattnet

mg/l | ml/l

M 4 | M 7

H3BO3 | 57190 | 20000-faldig | 1,0 | 0,25

MnCl2 · 4 H2O | 7210 | 20000-faldig | 1,0 | 0,25

LiCl | 6120 | 20000-faldig | 1,0 | 0,25

RbCl | 1420 | 20000-faldig | 1,0 | 0,25

SrCl2 · 6 H2O | 3040 | 20000-faldig | 1,0 | 0,25

NaBr | 320 | 20000-faldig | 1,0 | 0,25

Mo Na2O4 · 2 H2O | 1260 | 20000-faldig | 1,0 | 0,25

CuCl2 · 2 H2O | 335 | 20000-faldig | 1,0 | 0,25

ZnCl2 | 260 | 20000-faldig | 1,0 | 1,0

CoCl2 · 6 H2O | 200 | 20000-faldig | 1,0 | 1,0

KI | 65 | 20000-faldig | 1,0 | 1,0

Na2SeO3 | 43,8 | 20000-faldig | 1,0 | 1,0

NH4VO3 | 11,5 | 20000-faldig | 1,0 | 1,0

Na2EDTA · 2 H2O | 5000 | 2000-faldig | — | —

FeSO4 · 7 H2O | 1991 | 2000-faldig | — | —

Både Na2EDTA- och FeSO4-lösningarna bereds separat, hälls samman och sätts omedelbart i autoklav. Detta ger:

Fe-EDTA-lösning | 1000-faldig | 20,0 | 5,0

M4- och M7-medier

M4- och M7-medier bereds med användning av stamlösning II, makronäringsämnen och vitaminer, enligt tabellen nedan.

Mängd tillsatt vatten | Koncentration (relaterad till medium M4) | Mängd stamlösning som tillsätts för beredning av medium

mg/l | ml/l

M 4 | M 7

Stamlösning II (kombinerade spårämnen) | 20-faldig | 50 | 50

Stamlösningar för makronäringsämnen (enskilt ämne)

CaCl2 · 2 H2O | 293800 | 1000-faldig | 1,0 | 1,0

MgSO4 · 7 H2O | 246600 | 2000-faldig | 0,5 | 0,5

KCl | 58000 | 10000-faldig | 0,1 | 0,1

NaHCO3 | 64800 | 1000-faldig | 1,0 | 1,0

Na2SiO3 · 9 H2O | 50000 | 5000-faldig | 0,2 | 0,2

NaNO3 | 2740 | 10000-faldig | 0,1 | 0,1

KH2PO4 | 1430 | 10000-faldig | 0,1 | 0,1

K2HPO4 | 1840 | 10000-faldig | 0,1 | 0,1

Kombinerad vitaminstamlösning | — | 10000-faldig | 0,1 | 0,1

Den kombinerade vitaminstamlösningen bereds genom att sätta till de tre vitaminerna till en liter vatten enligt nedan.

mg/l

Tiaminhydroklorid | 750 | 10000-faldig

Cyanokobalamin (B12) | 10 | 10000-faldig

Biotin | 7,5 | 10000-faldig

Den kombinerade vitaminstamlösningen lagras fryst i små alikvoter. Vitaminerna sätts till medierna strax före användningen.

OBS: För att undvika utfällning av salter vid beredning av det kombinerade mediet ska man tillsätta stamlösningsalikvoterna till cirka 500–800 ml avjoniserat vatten och därefter fylla upp till en liter.

OBS: Den första offentliggjorda informationen om M4-medium finns i Elendt, B.P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, 25–33.

Tillägg 3

ANALYS AV TOTALT ORGANISKT KOL (TOC) OCH UPPRÄTTANDE AV NOMOGRAM FÖR TOC I ALGFODER

Det är allmänt känt att kolhalten i algfodret i regel inte mäts direkt utan fås genom korrelationer (nomogram) med surrogatmätningar av t.ex. antalet algceller eller ljusabsorbans.

För mätning av TOC är högtemperaturoxidation att föredra framför UV- eller persulfatmetoder. (För råd se The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Determinands 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB).

Före mätningarna för nomogrammet separeras algerna från tillväxtmediet genom centrifugering med påföljande återsuspension i destillerat vatten. För varje prov mäts surrogatparametern och TOC tre gånger. Blindprov med destillerat vatten bör analyseras och TOC-värdet härledas från det TOC-värde som erhållits för algprovet.

Nomogrammen bör vara linjära över det avsedda kolhaltområdet. Nedan visas några exempel.

OBS: Bör inte användas för omvandlingar, det är viktigt att laboratorierna tar fram egna nomogram.

Chlorella vulgaris, var. viridis (CCAP 211/12).

Regression av mg/l torrvikt på mg C/1. Data från koncentrerade suspensioner av celler odlade i semistatisk sats, återuppslammade i destillerat vatten.

x-axel: mg C/1 koncentrerat algfoder

y-axel: mg/1 torrvikt koncentrerat algfoder

Korrigeringskoefficient – 0,980

Chlorella vulgaris, var. viridis (CCAP 211/12).

Regression av mg/l torrvikt på mg C/1. Data från koncentrerade suspensioner av celler odlade i semistatisk sats, återuppslammade i destillerat vatten.

x-axel: mg C/1 koncentrerat algfoder

y-axel: Antal celler/1 koncentrerat algfoder

Korrigeringskoefficient -0,926

Chlorella vulgaris, var. viridis (CCAP 211/12).

Regression av absorbans mg C/1 (1 cm väglängd). Data från koncentrerade suspensioner av celler odlade i semistatisk sats, återuppslammade i destillerat vatten.

x-axel: mg C/1 koncentrerat algfoder

y-axel: Absorbansen vid 440 mm hos en 1:10-utspädning av koncentrerat algfoder

Korrigeringskoefficient – 0,998

Tillägg 4

PROVTAGNINGSSCHEMAN FÖR TEST MED EXPONERING VIA VATTEN OCH FÖDA

Dag | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21

Mediumförnyelse (bocka för)

pH | ny

gammal

O2 (mg/l) | ny

gammal

Temp (°C) | ny

gammal

Utfordring (bocka för)

Antal levande avkommor | Totalt

Kärl 1

Totalt

Kumulativ föräldramortalitet

1 Ange vilket kärl som användes för försöket.

2 Markera aborterade satser med AB i relevant ruta.

3 Markera varje dött föräldraexemplar med M i relevant ruta.

Tillägg 5

EXEMPEL PÅ BLANKETT FÖR REGISTRERING AV RESULTAT FRÅN KEMISK ANALYS

a) Uppmätta koncentrationer

Nominell konc. | Prov från vecka 1 | Prov från vecka 2 | Prov från vecka 3

b) Uppmätta koncentrationer uttryckta som procent av nominella koncentrationer

Nominell konc. | Prov från vecka 1 | Prov från vecka 2 | Prov från vecka 3

Tillägg 6

BERÄKNING AV TIDSVÄGT MEDEL VÄRDE

Tidsvägt medelvärde

Utifrån det faktum att testkemikaliens koncentration kan sjunka under perioderna mellan mediumförnyelse är det nödvändigt att överväga vilken koncentration man ska anse utgöra representativ koncentration för det koncentrationsområde som föräldragenerationen av Daphnia exponeras för. Valet ska basera sig på både biologiska och statistiska faktorer. Om man t.ex. tror att fortplantningen mest påverkas av den högsta koncentrationen som förekommer ska den koncentrationen användas som representativ koncentration. Om däremot ackumulerade verkningar eller långtidsverkningar av den toxiska kemikalien anses vara viktigare ska medelkoncentrationen användas. I det fallet är det lämpligt att använda tidsvägd medelkoncentration eftersom den beräknas med beaktande av de variationer som den momentana koncentrationen genomgår över tiden.

Figur 1 Exempel på tidsvägt medelvärde

Dagar

I figur 1 visas ett exempel på ett (förenklat) test som omfattar 7 dagar och där mediumförnyelse görs dag 0, 2 och 4.

Den tunna linjen som går upp och ned representerar momentana koncentrationer. Den minskade koncentrationen antas följa en exponentiell sönderfallsprocess.

De 6 avsatta punkterna representerar observerade koncentrationer som har uppmätts vid början och slutet av varje förnyelseperiod.

Den tjocka horisontella linjen indikerar nivån för det tidsvägda medelvärdet.

Det tidsvägda medelvärdet beräknas så, att arean under det tidsvägda medelvärdet är lika stor som arean under koncentrationskurvan. Beräkningen för exemplet i figuren ovan illustreras i tabell 1.

Dagar avser antalet dagar i förnyelseperioden.

Konc 0 är den uppmätta koncentrationen vid varje förnyelseperiods början.

Konc 1 är den uppmätta koncentrationen vid varje förnyelseperiods slut.

Ln(konc 0) är den naturliga logaritmen av Konc 0

Ln(konc 1) är den naturliga logaritmen av Konc 1

1 | 2 | 10,000 | 4,493 | 2,303 | 1,503 | 13,767

2 | 2 | 11,000 | 6,037 | 2,398 | 1,798 | 16,544

3 | 3 | 10,000 | 4,066 | 2,303 | 1,403 | 19,781

Totalt antal dagar: | 7 | Totalarea: | 50,092

Tidsvägt medeltal: | 7,156

Area är arean under den exponentiella kurvan för varje förnyelseperiod. Den beräknas enligt följande:

Det tidsvägda medelvärdet (TW Mean) är värdet för Totalarea dividerat med värdet för Dagar totalt.

För Daphnia-reproduktionstest bör tabellen utökas så att den sträcker sig över 21 dagar.

När observationer görs endast i början och slutet av varje förnyelseperiod är det uppenbart att det inte ar möjligt att bekräfta att sönderfallsprocessen verkligen är exponentiell. En annorlunda kurva skulle resultera i en annorlunda beräkning av värdet för Area. Det är dock inte osannolikt att sönderfallsprocessen är exponentiell och därför är en sådan kurva troligen det bästa alternativet, i brist på annan information.

Däremot finns det anledning att se upp om man genom den kemiska analysen vid förnyelseperiodens slut inte lyckas få fram någon halt av kemikalien. Om det inte är möjligt att uppskatta hur snabbt kemikalien har försvunnit ur lösningen är det inte möjligt att få en realistisk area under kurvan, och följaktligen inte heller möjligt att få ett meningsfullt tidsvägt medelvärde.

Tillägg 7

RIKTLINJER FÖR IDENTIFIERING AV KÖN PÅ NYFÖDDA DJUR

Produktion av nyfödda hanar kan uppstå under föränderliga miljöförhållanden, t.ex. förkortade fotoperioder, temperatur, minskande foderkoncentration och ökad populationstäthet (Hobaek och Larson, 1990, Kleiven m.fl., 1992). Produktion av nyfödda hanar är också en känd respons på vissa insektsmedel (Oda m.fl., 2005). Under förhållanden där kemiska stressfaktorer ger upphov till en minskning av reproduktiv avkomma från partenogenetiska honor kan ett ökat antal hanar förväntas (OECD, 2008). Enligt tillgänglig information är det inte möjligt att förutsäga vilket förhållande mellan könen eller vilken endpoint för reproduktion som är känsligast. Det finns dock vissa indikationer (se valideringsrapporten, del 1) på att en ökning av antalet hanar kan vara mindre känslig än minskad avkomma. Eftersom det primära syftet med testmetoden är att bedöma antalet producerad avkomma är förekomsten av hanar en valfri observation. Om denna alternativa endpoint utvärderas i en undersökning bör ett ytterligare testvalideringskriterium på högst 5 % hanar användas.

Det mest praktiska och enklaste sättet att skilja mellan könen hos Daphnia är att använda deras fenotypiska egenskaper, eftersom hanar och honor är genetiskt identiska och könet är miljöbestämt. Hanar och honor skiljer sig åt i längd och när det gäller morfologin hos den första antennen, som är längre hos hanar än honor (fig.1). Denna skillnad är igenkännbar direkt efter födseln, även om andra sekundära könsegenskaper utvecklas när de växer (se t.ex. fig. 2 i Olmstead och LeBlanc, 2000).

För att observera morfologiskt kön bör nyfödda som producerats av varje testdjur överföras med pipett och placeras i en petriskål med testmediet. Mediet hålls till ett minimum för att begränsa djurens rörelser. Observation av den första antennen kan göras med stereomikroskop (× 10–60).

Figur 1: 24-timmar gammal hane (till vänster) och hona (höger) D. magna. Hanar kan särskiljas från honor genom längden och morfologin hos det första sprötet enligt cirklarna (Tatarazako m.fl., 2004).

LITTERATUR

Hobaek A och Larson P. 1990. Sex determination in Daphnia magna. Ecology 71: 2255–2268.

Kleiven O.T., Larsson P., Hobaek A. 1992. Sexual reproduction in Daphnia magna requires three stimuli. Oikos 65, 197–206.

Oda S., Tatarazako N, Watanabe H., Morita M., och Iguchi T. 2005. Production of male neonates in Daphnia magna (Cladocera, Crustacea) exposed to juvenile hormones and their analogs. Chemosphere 61:1168–1174.

OECD, 2008. Validation report for an enhancement of OECD TG 211 Daphnia magna reproduction test. OECD Series on Testing and Assessment, Number 88. Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD), Paris.

Olmstead, A.W., LeBlanc, G.A., 2000. Effects of endocrine-active chemicals on the development characteristics of Daphnia magna. Environmental Toxicology and Chemistry 19:2107–2113.

Tatarazako, N., Oda, S., Abe, R., Morita M. and Iguchi T., 2004. Development of a screening method for endocrine disruptors in crustaceans using Daphnia magna (Cladocera, Crustacea). Environmental Science 17, 439–449.

Tillägg 1

DEFINITIONER

total längd, längd från nosspetsen till slutet av stjärtfenans längre flik, mäts vanligen med flikarna komprimerade längs mittlinjen. Detta är ett linjärt mått, som inte mäter kroppskurvan (www.fishbase.org)

Figur 1 Beskrivning av de olika längder som används

Standardlängd

FL Fork length

Total längd

Tillägg 2

TESTBETINGELSER, TESTPERIOD OCH ÖVERLEVNADSKRITERIER FÖR REKOMMENDERADE ARTER

ARTER | TESTBETINGELSER | REKOMMENDERAD LÄNGD FÖR TESTPERIODEN | Normal minsta genomsnittliga totallängd för kontrollfisk i slutet av undersökningen (mm) | ÖVERLEVNAD I KONTROLLER (minimum)

Temperatur (°C) | Salthalt (0/00) | Fotoperiod (timmar) | Kläckningsframgång | Framgång efter kläckning

Oncorhynchus mykiss Regnbåge | 10 ± 1,5 | 12–16 | 2 veckor efter det att kontrollerna börjar födosöka (eller 60 dagar efter kläckning) | 40 | 75 % | 75 %

Pimephales promelas Knölskallelöja | 25 ± 1,5 | 16 | 32 dagar från testets början (eller 28 dagar efter kläckning) | 18 | 70 % | 75 %

Danio rerio Sebrafisk | 26 ± 1,5 | 12–16 | 30 dagar efter kläckning | 11 | 70 % | 75 %

Oryzias latipes Medaka (japansk risfisk) | 25 ± 2 | 12–16 | 30 dagar efter kläckning | 17 | 80 % | 80 %

Cyprinodon variegatus Sheepshead minnow (art av tandkarp) | 25 ± 1,5 | 15–35 | 12–16 | 32 dagar från testets början (eller 28 dagar efter kläckning) | 17 | 75 % | 80 %

Menidia sp. Silverlax | 22–25 | 15–35 | 13 | 28 dagar | 20 | 80 % | 60 %

1 Minsta genomsnittliga totallängd är vanligen inte ett giltighetskriterium, men avvikelser under den angivna siffran bör undersökas noggrant när det gäller testets sensitivitet. Den minsta genomsnittliga totallängden härleds från ett urval av uppgifter som finns tillgängliga vid den aktuella tidpunkten.

2 Den särskilda stam av regnbåge som testas kan kräva andra temperaturer. Avelsbestånd måste hållas vid samma temperatur som ska användas för äggen. När ägg mottas från kommersiella uppfödare krävs en kort anpassningsperiod (t.ex. 1–2 timmar) för att testa temperaturen efter ankomst.

3 Mörker för yngel tills det gått en vecka efter kläckning, utom när de inspekteras. Därefter dämpad belysning under hela testet (12–16 timmars ljusperiod) (4).

4 Ljusregimen bör vara konstant för varje testningsförhållande.

5 Salthalten ska hållas inom ± 2 0/00 för varje test.

Tillägg 3

VÄGLEDNING OM UTFODRING OCH HANTERING AV FISKYNGEL OCH TESTDJUR FRÅN REKOMMENDERADE ARTER

ARTER | FODER | ÖVERFÖRINGSTIDPUNKT EFTER KLÄCKNING | TID TILL FÖRSTA UTFODRING

Fiskyngel | Nyligen kläckta yngel | Ungfisk

Typ | Frekvens

1 Mat bör ges till mättnadstillstånd. Vid behov bör överbliven mat och avföring avlägsnas för att undvika ackumulering av avfall.

2 yngel i gulesäcken behöver inget foder

3 filtreras från blandad kultur

4 granulat från jäsningsprocessen

Tillägg 4

NÅGRA KEMISKA EGENSKAPER FÖR GODTAGBART UTSPÄDNINGSVATTEN

Komponent | Koncentrationsgränsvärde

Partiklar | 5 mg/l

Halt av organiskt kol | 2 mg/l

Icke-joniserad ammoniak | 1 μg/l

Resterande mängd klor | 10 μg/l

Total mängd bekämpningsmedel som innehåller organiska fosforföreningar | < 50 ng/l

Total mängd bekämpningsmedel som innehåller organiska klorföreningar plus polyklorerade bifenyler | < 50 ng/l

Total mängd organiskt klor | < 25 ng/l

Aluminium | 1 μg/l

Arsenik | 1 μg/l

Krom | 1 μg/l

Kobolt | 1 μg/l

Koppar | 1 μg/l

Järn | 1 μg/l

Bly | 1 μg/l

Nickel | 1 μg/l

Zink | 1 μg/l

Kadmium | < 100 ng/l

Kvicksilver | < 100 ng/l

Silver | < 100 ng/l

Tillägg 5

STATISTISK VÄGLEDNING FÖR BESTÄMNING AV NOEC

Allmänt

Analysenheten är replikatkärlet. För kontinuerliga mätningar, såsom storlek, bör medel- eller medianvärdet för replikatet räknas ut och dessa replikatvärden utgör de data som ska analyseras. Styrkan hos det test som används bör påvisas, företrädesvis baserat på en lämplig historisk databas för varje laboratorium. Den storlekseffekt som kan upptäckas med 75–80 % styrka bör anges för varje endpoint med de statistiska test som ska användas.

De databaser som finns tillgängliga när testmetoden utvecklas avgör den styrka som är möjlig med de rekommenderade statistiska förfarandena. Enskilda laboratorier ska visa att de kan uppnå denna styrka genom att utföra egna styrkeanalyser eller genom att visa att variationskoefficienten (VC) för varje respons inte överstiger den 90:e percentilen för de variationskoefficienter som används för att utveckla testriktlinjen. Variationskoefficienterna anges i tabell 1. Om endast medel- eller medianvärden finns tillgängliga för replikatet kan variationskoefficienten inom replikatet ignoreras.

Art | Respons | VC_mellan replikat | VC_inom replikat

Regnbåge | Längd | 17,4 | 9,8

Vikt | 10,1 | 28

Knölskallelöja | Längd | 16,9 | 13,5

Vikt | 11,7 | 38,7

Sebrafisk | Längd | 43,7 | 11,7

Vikt | 11,9 | 32,8

För nästan alla statistiska tester som används för att utvärdera toxikologiska laboratorieundersökningar är det jämförelserna mellan behandlings- och kontrollgrupperna som är intressanta. Därför är det inte lämpligt att kräva ett signifikanstest enligt ANOVA F innan man använder Dunnetts eller Williams test eller kräva ett signifikanstest enligt Kruskal-Wallis innan man använder Jonckheere-Terpstra-, Mann-Whitney- eller Dunn-testet (Hochberg och Tamhane 1987, Hsu 1996, Dunnett 1955, 1964, Williams 1971, 1972, 1975, 1977, Robertson m.fl. 1988, Jonckheere 1954, Dunn 1964).

Dunnetts test har en inbyggd multiplicitetsjustering och dess falska positiva och negativa värden påverkas negativt om F-testet används som grindvakt. På samma sätt erhålls en negativ påverkan av Williams och Jonckheere-Terpstras tester av step-down-typ med användning av en signifikansnivå på 0,05 vid varje steg med bevarande av ett totalt falskt värde på 5 % samt det värdet och testets styrka om F-testet eller Kruskal-Wallis test används som grindvakt. Mann-Whitneys och Dunns tester måste justeras för multiplicitet, och här rekommenderas justeringen enligt Bonferroni-Holm.

En ingående diskussion av de flesta av rekommendationerna om hypotesprövning och verifiering av underliggande antaganden för dessa tester återfinns i OECD (2006), som även innehåller en omfattande litteraturförteckning.

Behandling av kontroller när lösningsmedel används

Om lösningsmedel används bör både en kontroll av utspädningsvattnet och lösningsmedlet ingå i förfarandet. De två kontrollerna bör jämföras för varje respons och kombineras för statistisk analys om ingen signifikant skillnad påvisas mellan kontrollerna. I annat fall bör lösningsmedelskontrollen användas för NOEC-bestämningen eller skattningen av ECx. Då används ingen vattenkontroll. Se begränsning av giltighetskriterier (punkt 7).

För längd, vikt, andelen kläckta ägg, dödlighet hos yngel eller onormala yngel samt första och sista dagen för kläckning eller uppsimning bör T-testet eller Mann-Whitneys test användas för att jämföra kontrollen av utspädningsvatten och av lösningsmedel vid en signifikansnivå på 0,05. I detta fall ignoreras alla behandlingsgrupper. Resultaten av dessa tester bör rapporteras.

Storleksmätningar (längd och vikt)

Individuella fiskars längd- och viktvärden kan ha en normal eller log-normalfördelning. I båda fallen brukar replikatens medelvärden vara normalt fördelade enligt den centrala gränsvärdessatsen och bekräftas av data från över 100 ELS-studier av tre sötvattensarter. Om data eller historiska databaser tyder på en log-normalfördelning för individuella fiskars storleksvärden kan medelvärdet av replikatets logaritmer för de individuella värdena beräknas och analysdata kan då vara antiloggar för dessa medelvärden av replikatets logaritmer.

Data bör utvärderas för överensstämmelse med en normalfördelning och variansens homogenitet. Residualer från ANOVA-modellen med koncentration som enda förklarande klassvariabel bör användas för detta ändamål. Visuell bestämning med hjälp av punktdiagram och histogram eller stam-blad-diagram kan användas. Alternativt kan ett formellt test som Shapiro-Wilk eller Anderson-Darling användas. Överensstämmelse med variansens homogenitet kan bedömas med hjälp av en visuell undersökning av samma punktdiagram eller formellt genom Levenes test. Endast parametriska tester (Williams, Dunnett) behöver utvärderas för normalitet eller variansens homogenitet.

Eventuella avvikande värden och deras inverkan på analysen bör uppmärksammas. Tukeys test för avvikande värden samt visuell inspektion av samma residualdiagram som beskrivs ovan kan användas. Det är viktigt att tänka på att observationerna rör hela replikaten och avvikande värden bör därför utelämnas från analysen först efter noggrant övervägande.

De statistiska tester som använder inslag av experimentell design och biologiska förväntningar är trendtester av step-down-typ, som Williams och Jonckheere-Terpstra. Dessa tester förutsätter en monoton koncentrationsrespons och data bör bedömas för överensstämmelse med detta antagande. Detta kan ske visuellt genom ett punktdiagram för replikatets medelvärden mot testkoncentrationen. Det kan vara till hjälp att täcka punktdiagrammet med ett punktvis linjärt diagram som kopplar koncentrationens medelvärden viktade med samma provstorlek för replikatet. Om det punktvisa linjära diagrammet visar en kraftig avvikelse från monotonicitet är det eventuellt nödvändigt att använda icke-trendtester. Alternativt kan formella tester användas. Ett enkelt formellt test är att beräkna linjära och kvadratiska kontraster i koncentrationens medelvärden. Om den kvadratiska kontrasten är betydande och den linjära kontrasten är icke-betydande tyder detta på ett eventuellt problem med monotonicitet, som bör utvärderas ytterligare med hjälp av diagrammen. Om normaliteten eller variansens homogenitet är problematiska kan dessa kontraster konstrueras från transformerade rangordnade data. Alternativa förfaranden såsom Bartholomews test för monotonicitet kan användas, men då måste komplexitet läggas till.

Figur 2 NOEC-flödesdiagram för storleksmätningar (längd och vikt)

Variansstabiliserande omvandling?

Nej

Dunns eller Mann-

Whitneys test

Nej

Är replikatens medelvärden normala?

Är replikatens medelvärden normala och enhetliga?

Om %-effekten vid NOEC är stor eller

%-effekten vid LOEC är liten, försök

med ECx.

Normaliseringsomvandling?

Tamhane-Dunnett test

Dunnett test

Omvandlas till normalt,

enhetligt?

Williams step-down

eller Jonckheere

Överensstämmer data med monoton koncentrationsrespons?

Varianserna lika?

Step-down Jonckherre

Nej

De streckade figurerna är vägar för första och sista dagens kläckning eller uppsimning (*) eller abnorma yngel.

(*) Dessa responser tillfredsställer aldrig antaganden från parametriska analyser eller modeller.

Om data inte överensstämmer med kraven för dessa tester bestäms NOEC genom ett Williams- eller Jonckheere-Terpstra-test av step-down-typ. Information om dessa förfaranden ges i OECD (2006). För data som inte överensstämmer med kraven för ett trendtest av step-down-typ kan Dunnetts eller Tamhane-Dunnetts (T3) test användas, eftersom båda testerna har inbyggda justeringar för multiplicitet. Dessa tester förutsätter normalitet och, när det gäller Dunnett, variansens homogenitet. Om dessa villkor inte är uppfyllda kan Dunns icke-parametriska test användas. OECD (2006) innehåller information om alla dessa tester. I figur 2 ges en översikt av hur man väljer test.

Kläckta ägg och överlevande yngel

Data är andelen kläckta ägg eller yngel som överlever i de individuella replikaten. Dessa andelar bör bedömas för extrabinomial varians, som är vanligt men inte generellt för sådana mätningar. Flödesschemat i figur 3 ger vägledning om hur man väljer test, se texten för detaljerade beskrivningar.

Två tester används ofta, nämligen Tarones C(α)-test (Tarone, 1979) och chi-två-test, varje test tillämpas separat för varje testkoncentration. Om extrabinomial varians påträffas i en testkoncentration bör metoder som omfattar detta användas.

Formel 1: Tarones C (α)-test (Tarone 1979)

där ̂ är den genomsnittliga andelen för en given koncentration, m är antalet replikatkärl nj är antalet ämnen i replikat j, och xj är antalet djur i replikatet som svarar, t.ex. ej kläckta djur eller döda djur. Detta test ska tillämpas separat på varje koncentration. Testet kan betraktas som ett justerat chi-två-test, men begränsade kraftsimulationer som har utförts av Tarone har visat att det är mer kraftfullt än ett chi-två-test.

Figur 3 NOEC-flödesschema för kläckta ägg och dödlighet hos yngel

Rao-Scott Cochran-Armitagetestet av stepdown-typ eller Jonckheeres test eller, efter arcsinkvadratrotomvandling, Williams test

Dunns test eller Mann-Whitneys test

Nej

Jas

Överensstämmer data (*) med monoton koncentrationsrespons?

Cochran-Armitagetestet av step-down-typ eller Jonckheeres test eller, efter arcsinkvadratrotomvandling, Williams test

Dunnett test

Data normalt fördelade, enhetliga efter arcsin-kvadratrotomvandling?

Är C(α)- eller chi-två-testet för extra binomial varians signifikant?

(*) Uppgifterna motsvarar replikatets andel.

Om det inte finns några tydliga tecken på extrabinomial varians kan ett Cochran-Armitage-test av step-down-typ användas. Detta test ignorerar replikaten, så när det finns sådana belägg beaktar Rao-Scott-justeringen av Cochran-Armitages test (RSCA) replikaten, replikatens storlekar och den extrabinomiala variansen, och rekommenderas därför. Alternativa tester är Williams- och Jonckheere-Terpstra-tester av step-down-typ och Dunnetts test, enligt beskrivningen av storleksmätningar. Dessa tester är tillämpliga vare sig extrabinomial varians förekommer eller ej, men har något mindre kraft (Agresti 2002, Morgan 1992, Rao och Scott 1992, 1999, Fung m.fl. (1994, 1996).

Första eller sista dagen för kläckning eller uppsimning

Responsen är ett heltal, som anger den testdag då den angivna observationen iakttas för ett visst replikatkärl. Urvalet av värden är i regel mycket begränsat och det förekommer ofta en hög andel bundna värden, t.ex. att samma första kläckningsdag observeras i alla kontrollreplikat och kanske i en eller två låga testkoncentrationer. Parametriska tester såsom Williams och Dunnett är inte lämpliga för sådana data. Om det inte finns bevis på allvarlig icke-monotonicitet är ett Jonckheere-Terpstra-test av step-down-typ mycket kraftfullt för att upptäcka effekter av testkemikalien. Annars kan Dunns test användas.

Abnormiteter hos yngel

Responsen är antalet yngel som befunnits vara onormala på något sätt. Denna respons har ofta låg incidens och kan uppvisa samma problem som första kläckningsdatumet. Oregelbunden koncentrationsrespons kan också förekomma. Om data åtminstone grovt liknar en monoton koncentrationsform är ett Jonckheere-Terpstra-test av step-down typ kraftfullt för att upptäcka effekter. Annars kan Dunns test användas.

LITTERATURHÄNVISNINGAR

Agresti, A. (2002), Categorical Data Analysis, second edition, Wiley, Hoboken.

Dunnett, C. W. (1955), A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control, J. American Statistical Association 50, 1096–1121.

Dunn O.J. (1964 ), Multiple Comparisons Using Rank Sums, Technometrics 6, 241–252.

Dunnett, C. W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics 20, 482–491.

Fung, KY, D. Krewski, J.N.K. Rao, A.J. Scott (1994), Tests for Trend in Developmental Toxicity Experiments with Correlated Binary Data, Risk Analysis 14, 639–648.

Fung, K.Y., D. Krewski, R.T. Smythe (1996), A comparison of tests for trend with historical controls in carcinogen bioassay, Canadian Journal of Statistics 24, 431–454.

Hochberg, Y. och A.C. Tamhane (1987), Multiple Comparison Procedures, Wiley, New York.

Hsu, J.C. (1996), Multiple Comparisons: Theory and Methods, Chapman and Hall/CRC Press, Boca Raton.

Jonckheere, A. R. (1954), A distribution-free k-sample test against ordered alternatives, Biometrika 41, 133.

Morgan, B.J.T. (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London.

OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series on Testing and Assessment. nr 54. Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD), Paris.

Rao J.N.K. och Scott A.J. (1992) – A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577–585.

Rao J.N.K. och Scott A.J. (1999) – A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373–1385.

Robertson, T., Wright F.T. och Dykstra R.L. (1988), Order restricted statistical inference, Wiley.

Tarone, R.E. (1979), Testing the goodness of fit of the Binomial distribution, Biometrika 66, 585–590.

Williams, D. A. (1971), A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics 27, 103–117.

Williams, D. A. (1972), The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics 28, 519–531.

Williams, D. A. (1975), The Analysis of Binary Responses from Toxicological Experiments Involving Reproduction and Teratotlogy, Biometrics 31, 949–952.

Williams, D. A. (1977), Some inference procedures for monotonically ordered normal means, Biometrika 64, 9–14.

Tillägg 6

STATISTISK VÄGLEDNING FÖR REGRESSIONUPPSKATTNINGAR

Allmänt

De observationer som används för att anpassa modellen är replikatets medelvärden (längd och vikt) eller replikatets proportioner (kläckta ägg och dödlighet hos yngel) (OECD 2006).

Viktad regression med användning av replikatets urvalsstorlek som vikt rekommenderas allmänt. Andra viktningssystem är dock möjliga, såsom viktning genom förutsagd genomsnittlig respons eller en kombination av detta och replikatets urvalsstorlek. Viktning genom ömsesidig urvalsvarians inom koncentrationen rekommenderas inte (Bunke m.fl. 1999, Seber och Wild, 2003, Motulsky och Christopoulos 2004, Huet m.fl. 2003).

Oberoende observationer bör bevaras vid eventuell transformation av responser före analys, och ECx och dess konfidensgränser bör uttryckas i de ursprungliga mätenheterna, inte i transformerade enheter. En förändring på 20 % i logaritmen för längd motsvarar t.ex. inte en förändring på 20 % i längd (Lyles m.fl. 2008, Draper och Smith 1999).

Flödesdiagrammet i figur 4 ger en översikt av ECx-uppskattningar. Detaljerna beskrivs i texten nedan.

Figur 4 Flödesschema för ECx-uppskattning av replikatets genomsnittliga längd, vikt eller andelen kläckta ägg eller dödlighet hos yngel, se texten för mer information

Utvärdera goodness of fit-modeller: a) visuellt, b) jämför förutsagd %-effekt med observerad %-effekt, c) jämför den genomsnittliga responsen för kontrollen med den förutsagda genomsnittliga responsen, d) jämför regressionsresidual SS med rena SS-fel genom Ftestet. Förkasta modeller som inte passar.

Om det inte finns indikationer på extra-binomial varians kan probitmodellen vara lämplig för andelsdata.

Passar även OECD 4 och 5, Hill, Michaelis-Menton eller andra 3-5-parm-modeller.

6 eller 7 koncentrationer plus kontroll

Välj ett större värde för x eller en annan modell.

Ligger a) den förutsagda responsen på ECx inom KI för kontroll eller b) den förutsagda kontrollresponsen inom KI för förutsagd respons vid ECx, eller c) är CI för ECx för bred?

Beräkna 95 % KI för förutsagd respons vid kontroll och ECx. Beräkna 95 % KI för ECx.

Jämför modellerna med hjälp av AICC-kriterier eller en fackmässig bedömning och välj den modell som passar bäst.

8 eller fler koncentrationer plus kontroll

5 koncentrationer plus kontroll

Rapportmodell, ECx och dess CI

Om ingen modell och godtagbara x kan påvisas, rapportera NOEC.

Nej

Passar även Brain-Cousins hormetiska modell.

För Bruce-Versteeg, enkel exponentiell

(OECD2), enkel exponentiell w/formparameter (OECD3) eller annan 2-3-parm-modell.

Överväganden rörande antalet kläckta ägg och dödlighet hos yngel

För kläckta ägg och dödlighet hos yngel är det i regel bäst att anpassa en minskande modell om man inte anpassar en probitmodell såsom beskrivs nedan. Det innebär att man bör modellera andelen ägg som inte kläcks eller andelen döda yngel. Anledningen till detta är att ECx avser en koncentration vid vilken det finns en förändring som motsvarar x % av kontrollens responsmedelvärde. Om 5 % av kontrolläggen inte kläcks och man modellerar antalet misslyckade kläckningar, avser EC20 en koncentration vid vilken det sker en förändring som motsvarar 20 % ej kläckta ägg och 5 % kläckta ägg i kontrollen, vilket i sin tur motsvarar en förändring på 0,2 × 0,05 = 0,01 eller 1 procentenhet mot 6 % ej kläckta ägg. En sådan liten förändring kan inte beräknas på något meningsfullt sätt från tillgängliga data och är inte biologiskt viktig. Om man däremot modellerar andelen kläckta ägg skulle kontrollandelen i detta exempel motsvara 95 % och en minskning på 20 % av kontrollmedelvärdet skulle motsvara en förändring på 0,95 × 0,2 = 0,18, dvs. 95 % kläckta ägg till 77 % (= 95-18) kläckta ägg. Denna effektkoncentration kan uppskattas och är förmodligen av större intresse. Detta problem förekommer inte i storleksmätningar, men negativa effekter på storleken innebär i regel minskad storlek.

Modeller för storlek (längd eller vikt) och kläckta ägg eller överlevande yngel.

Med undantag för Brain-Cousins hormetiska modell beskrivs och rekommenderas alla dessa modeller i OECD (2006). Den så kallade OECD 2-5 diskuteras också i samband med ekotoxicitetsförsök i Slob (2002). Det finns naturligtvis många andra modeller som kan vara användbara. Bunke, m.fl. (1999) anger ett antal modeller som inte ingår här och det finns många hänvisningar till andra modeller. De metoder som anges nedan anses vara särskilt lämpliga för ekotoxicitetsförsök och är allmänt vedertagna.

Metod med fem testkoncentrationer plus kontroll.

Bruce-Versteeg.

Enkel exponentiell metod (OECD 2).

Exponentiell metod med formparameter (OECD 3).

Enkel exponentiell metod med nedre gräns (OECD 4).

Metod med sex eller fler testkoncentrationer plus kontroll.

Exponentiell metod med formparameter och nedre gräns (OECD 5).

Michaelis-Menton.

Hill.

Om det finns synliga tecken på hormesis (osannolikt vad gäller kläckningsframgång och yngelöverlevnad, men förekommer ibland i storleksobservationer).

Brain-Cousins Hormetic, Brain and Cousens (1989).

Alternativa modeller för misslyckade kläckningar och dödlighet hos yngel

Ökande modeller för dessa responser kan anpassas med hjälp av probitmodeller (eller logistiska modeller) om det inte finns några belägg för extrabinomial varians och kontrollincidensen uppskattas i modellanpassningen. Denna metod är dock inte att föredra eftersom den behandlar individen, inte replikaten, som analysenheter (Morgan 1992, O'Hara Hines och Lawless 1993, Collett 2002, 2003).

Anpassningsgraden (goodness of fit) för en enskild modell

Gör en visuell jämförelse av observerade och förutsagda procentuella minskningar för varje testkoncentration (Motulsky och Christopoulos 2004, Draper och Smith 1999).

Jämför regressionens medelkvadratsumma och den rena medelkvadratsumman genom användning av F-test (Draper och Smith 1999).

Kontrollera att varje term i modellen avviker nämnvärt från 0 (fastställ om alla modelltermer är viktiga) (Motulsky och Christopoulos 2004).

Residualdiagram från regressionen mot testkoncentrationen, möjligen enligt en log(konc.)skala. Diagrammet bör inte ha något mönster, utan punkterna bör vara slumpmässigt utspridda längs en horisontell linje vid nollhöjd.

Uppgifterna bör utvärderas för normalitet och variansens homogenitet på samma sätt som anges i tillägg 5.

Dessutom bör residualernas normalitet i regressionsmodellen bedömas med hjälp av samma metoder som anges i tillägg 5 för residualer från ANOVA.

Jämför modellerna.

Använd Akiakes AICC-kriterier. Mindre AICC värden anger bättre anpassningar. Om AICc(B)-AICc(A)≥10 är modell A nästan säkert bättre än modell B (Motulsky och Christopoulos (2004).

Jämför de två modellerna visuellt genom att titta på hur väl de uppfyller det enskilda modellkriteriet ovan.

Sparsamhetsprincipen rekommenderas, vilket innebär att den enklaste modellen som passar uppgifterna rimligt väl används (Ratkowsky 1993, m.fl. Lyles 2008).

ECx-skattningens kvalitet

Konfidensintervallet (KI) för ECx bör inte vara för brett. Det krävs en statistisk bedömning för att avgöra hur stort konfidensintervallet får vara för att ECx fortfarande ska vara användbart. Simuleringar för regressionsmodeller som är anpassade till antal kläckta ägg och storleksdata visar att ett konfidensintervall på cirka 75 % för ECx (X = 10, 20 eller 30) inte sträcker sig över fler än två testkoncentrationer. Detta ger allmän vägledning om vad som är acceptabelt och praktiska råd om vad som är möjligt. Ett flertal författare hävdar att det är nödvändigt att rapportera konfidensintervall för alla modellparametrar och att breda konfidensintervall för modellparametrar tyder på att modellen är oacceptabel (Ott och Longnecker 2008, Alvord och Rossio 1993 Motulsky och Christopoulos 2004, Lyles m.fl. 2008, Seber och Wild 2003, Bunke m.fl. 1999, Environment Canada 2005).

KI för ECx (eller någon annan modellparameter) får inte innehålla noll (Motulsky och Christopoulos 2004). Detta är motsvarigheten i regressionsmodeller till den minsta signifikanta skillnad som ofta citeras i hypotestestmetoder (t.ex. Wang m.fl. 2000). Det motsvarar också konfidensintervallet för de genomsnittliga LOEC-responser som inte innehåller kontrollmedelvärdet. Man bör fråga sig om parameterskattningarna är vetenskapligt trovärdiga. Om konfidensintervallet för y0 är ± 20 % är t.ex. ingen EC10-skattning rimlig. Om modellen förutsäger en effekt på 20 % vid koncentration C och den maximala observerade effekten vid C och lägre koncentrationer är 10 %, är EC20 inte rimlig (Motulsky och Christopoulos 2004, Wang m.fl. 2000, Environment Canada 2005).

ECx bör inte kräva extrapolering utanför positiva koncentrationer (Draper och Smith 1999, OECD 2006). En allmän vägledning kan t.ex. vara att ECx inte är mer än omkring 25 % lägre än den lägsta testade koncentrationen eller över den högsta testade koncentrationen.

LITTERATURHÄNVISNINGAR

Alvord, W.G., Rossio, J.L. (1993), Determining confidence limits for drug potency in immunoassay, Journal of Immunological Methods 157, 155–163.

Brain, P. och Cousens, R. (1989), An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed res. 29: 93–96.

Bunke, O., Droge, B. och Polzehl, J. (1999). Model selection, transformations and variance estimation in nonlinear regression. Statistics 33, 197–240.

Collett, D. (2002), Modelling Binary Data, andra upplagan, Chapman and Hall, London.

Collett, D. (2003), Modelling Survival Data in Medical Research, andra upplagan, Chapman and Hall, London.

Draper, N. R. och Smith, H. (1999), Applied Regression Analysis, tredje upplagan. New York: John Wiley & Sons.

Environment Canada (2005), Guidance Document on Statistical Methods for Environmental Toxicity Tests, Report EPS 1/RM/46

Huet, S., A. Bouvier, M.-A. Poursat, E. Jolivet (2003), Statistical Tools for Nonlinear Regression: A Practical Guide with S-PLUS and R Examples, Springer Series in Statistics, New York.

Lyles, R. H., C. Poindexter, A. Evans, M. Brown, och C.R. Cooper (2008), Nonlinear Model-Based Estimates of IC50 for Studies Involving Continuous Therapeutic Dose-Response Data, Contemp Clin Trials. 29 november 2008, 29 (6): 878–886

Morgan, B.J.T. (1992), Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London.

Motulsky, H., A. Christopoulos (2004), Fitting Models to Biological Data Using Linear and Nonlinear Regression: A Practical Guide to Curve Fitting, Oxford University Press, USA.

O'Hara Hines, R. J. och J. F. Lawless (1993), Modelling Overdispersion in Toxicological Mortality Data Grouped over Time, Biometrics Vol. 49, s. 107–121

OECD (2006), Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series Testing and Assessment, nr 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris.

Ott, R.L., M.T. Longnecker, An Introduction to Statistical Methods and Data Analysis, sjätte upplagan, 2008, Brooks-Cole, Belmont, CA.

Ratkowsky, D.A. (1993), Principles of nonlinear regression, Journal of Industrial Microbiology 12, 195–199.

Seber, G.A.F., C.J. Wild, Nonlinear Regression, Wiley, 2003

Slob W. (2002), Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci., 66, 298–312

Wang, Q., D.L. Denton, och R. Shukla (2000), Applications and Statistical Properties Of Minimum Significant Difference-Based Criterion Testing In a Toxicity Testing Program, Environmental Toxicology and Chemistry, vol. 19, s. 113–117, 2000.

Tillägg 1

FÖRKORTNINGAR OCH DEFINITIONER

Tillägg 2

FÖRSÖKSBETINGELSER FÖR ENDOKRINT SCREENINGTEST PÅ FISK

1. Rekommenderade arter | Knölskallelöja (Pimephales promelas) | Medaka (Oryzias latipes) | Sebrafisk (Danio rerio)

2. Testtyp | Genomflödestest | Genomflödestest | Genomflödestest

3. Vattentemperatur | 25 ± 2 °C | 25 ± 2 °C | 26 ± 2 °C

4. Belysningstyp | Fluorescerande lampor (brett spektrum) | Fluorescerande lampor (brett spektrum) | Fluorescerande lampor (brett spektrum)

5. Ljusintensitet | 10–20 μE/m2/s, 540–1000 lux, eller 50–100 ft-c (omgivande ljusnivåer i laboratoriet) | 10–20 μE/m2/s, 540–1000 lux, eller 50–100 ft-c (omgivande ljusnivåer i laboratoriet) | 10–20 μE/m2/s, 540–1000 lux, eller 50–100 ft-c (omgivande ljusnivåer i laboratoriet)

6. Ljusperiod (övergångar mellan gryning och skymning är frivilliga, men anses inte vara nödvändiga) | 16 timmar ljus, 8 timmar mörker | 12–16 timmar ljus, 12–8 timmar mörker | 12–16 timmar ljus, 12–8 timmar mörker

7. Fisktäthet | < 5 g/l | < 5 g/l | < 5 g/l

8. Testbehållarens storlek | Minst 10 l | Minst 2 l | Minst 5 l

9. Testlösningens volym | Minst 8 l | Minst 1,5 l | Minst 4 l

10. Volymutbyte av testlösningar | Minst 6 per dag | Minst 5 per dag | Minst 5 per dag

11. Testorganismernas ålder | Se punkt 21 | Se punkt 21 | Se punkt 21

12. Ungefärlig våtvikt för en vuxen fisk (g) | Honor: 1,5 ± 20 % Hanar: 2,5 ± 20 % | Honor: 0,35 ± 20 % Hanar: 0,35 ± 20 % | Honor: 0,65 ± 20 % Hanar: 0,4 ± 20 %

13. Antal fiskar per testkärl | 6 (2 hanar och 4 honor) | 6 (3 hanar och 3 honor) | 10 (5 hanar och 5 honor)

14. Antal behandlingar | = 3 (plus lämpliga kontroller) | = 3 (plus lämpliga kontroller) | = 3 (plus lämpliga kontroller)

15. Antal kärl per behandling | Minst 4 | Minst 4 | Minst 2

16. Antal fiskar per testkoncentration | 16 vuxna honor och 8 hanar (4 honor och 2 hanar i varje replikatkärl) | 12 vuxna honor och 12 hanar (3 honor och 3 hanar i varje replikatkärl) | 10 vuxna honor och 10 hanar (5 honor och 5 hanar i varje replikatkärl)

17. Utfodring | Levande eller frysta vuxna eller nauplier av Artemia två eller tre gånger dagligen (ad libitum), kommersiellt tillgängligt foder eller en blandning av dessa | Artemia-nauplier två eller tre gånger dagligen (ad libitum), kommersiellt tillgängligt foder eller en blandning av dessa | Artemia-nauplier två eller tre gånger dagligen (ad libitum), kommersiellt tillgängligt foder eller en blandning av dessa

18. Luftning | Ingen såvida inte koncentrationen löst syre sjunker under 60 % luftmättnad | Ingen såvida inte koncentrationen löst syre sjunker under 60 % luftmättnad | Ingen såvida inte koncentrationen löst syre sjunker under 60 % luftmättnad

19. Utspädningsvatten | Rent yt- eller brunnsvatten, rekonstituerat vatten eller avklorerat kranvatten | Rent yt- eller brunnsvatten, rekonstituerat vatten eller avklorerat kranvatten | Rent yt- eller brunnsvatten, rekonstituerat vatten eller avklorerat kranvatten

20. Förexponeringstid | 7–14 dagar rekommenderas | 7–14 dagar rekommenderas | 7–14 dagar rekommenderas

21. Den kemiska exponeringens varaktighet | 21-d | 21-d | 21-d

22. Biologiska endpoints | överlevnad beteende fruktsamhet sekundära könskaraktärer VTG eventuellt histopatologi av könskörtlarna | överlevnad beteende fruktsamhet sekundära könskaraktärer VTG eventuellt histopatologi av könskörtlarna | överlevnad beteende fruktsamhet VTG eventuellt histopatologi av könskörtlarna

23. Testets godkännandekriterier | Löst syre ≥ 60 % av luftmättnadsvärdet, medeltemperatur 25 ± 2 °C, 90 % överlevnad i kontrollerna, uppmätta testkoncentrationer inom 20 % av medelvärdet för de uppmätta värdena per behandlingsnivå. | Löst syre ≥ 60 % av luftmättnadsvärdet, medeltemperatur 25 ± 2 °C, 90 % överlevnad i kontrollerna, uppmätta testkoncentrationer inom 20 % av medelvärdet för de uppmätta värdena per behandlingsnivå. | Löst syre ≥ 60 % av luftmättnadsvärdet, medeltemperatur 26 ± 2 °C, 90 % överlevnad i kontrollerna, uppmätta testkoncentrationer inom 20 % av medelvärdet för de uppmätta värdena per behandlingsnivå.

Tillägg 3

NÅGRA KEMISKA EGENSKAPER FÖR GODTAGBART UTSPÄDNINGSVATTEN

KOMPONENT | KONCENTRATIONER

Partiklar | < 20 mg/l

Halt av organiskt kol | < 2 mg/l

Icke-joniserad ammoniak | < 1 μg/l

Resterande mängd klor | < 10 μg/l

Total mängd bekämpningsmedel som innehåller organiska fosforföreningar | < 50 ng/l

Total mängd bekämpningsmedel som innehåller organiska klorföreningar plus polyklorerade bifenyler | < 50 ng/l

Total mängd organiskt klor | < 25 ng/l

Tillägg 4A

LEKSUBSTRAT FÖR SEBRAFISK

På gallret bör man fästa ett leksubstrat. Det ger fiskarna en struktur som de kan simma in i. Konstgjorda akvarieväxter av grön plast är till exempel lämpliga (Obs! man bör beakta möjligheten att testkemikalien adsorberas till plastmaterialet). Plastmaterialet bör lakas ut i en tillräcklig volym med varmt vatten under tillräckligt lång tid för att säkerställa att inga kemikalier läcker ut i testvattnet. Vid användning av material av glas bör man se till att fiskarna varken skadas eller trängs under sina energiska aktiviteter.

Avståndet mellan skålen och glasrutorna bör vara minst 3 cm för att säkerställa att fiskarna inte leker utanför skålen. Den rom som läggs på uppsamlingsbrickan faller ner genom gallret och kan samlas in 45–60 minuter efter att belysningen tänts. De genomskinliga äggen är inte vidhäftande och kan lätt räknas i transversellt ljus. Om man använder fem honor per kärl kan äggantal på under 20 per dag räknas som ett lågt, upp till 100 som ett genomsnittligt och mer än 100 som ett högt antal. Lekskålen bör tas bort, äggen samlas in och lekskålen återinföras i testkärlet antingen så sent som möjligt på kvällen eller mycket tidigt på morgonen. Tiden fram till återinförandet bör inte överstiga en timme. I annat fall kan leksubstratet som trigger framkalla individuell parning och lek på ovanliga tider. Om situationen kräver ett senare införande av lekskålen bör detta göras tidigast nio timmar efter att belysningen har tänts. Vid denna sena tidpunkt på dagen framkallas inte lekbeteendet längre.

Tillägg 4B

LEKSUBSTRAT FÖR KNÖLSKALLELÖJA

Två eller tre kombinerade lekplattor och -skålar av keramik/plast/glas eller rostfritt stål placeras i varje testbehållare (t.ex. en 80 mm lång grå halvcirkelformad ränna i en 130 mm lång skål med uppvikt kant) (se bilden). Korrekt härdad PVC eller keramiska plattor har visat sig vara lämpliga som leksubstrat (Thorpe m.fl., 2007).

Det rekommenderas att plattorna är nötta för att förbättra vidhäftningen. Skålen bör också avskärmas för att förhindra fiskarna från att komma åt de lagda äggen såvida inte äggens vidhäftningsförmåga har påvisats för det leksubstrat som används.

Basen är utformad för att samla upp alla ägg som inte fastnar på plattans yta och därför annars skulle falla till akvariets botten (eller de ägg som läggs direkt på den platta plastbasen). Alla leksubstrat bör lakas ur i utspädningsvatten under minst tolv timmar före användning.

Thorpe, K. L, Benstead, R., Hutchinson, T.H och Tyler C. R. (2007). An optimised experimental test procedure for measuring chemical effects on reproduction in the fathead minnow, Pimephales promelas. Aquatic Toxicology 81, 90–98.

Tillägg 5A

BEDÖMNING AV SEKUNDÄRA KÖNSKARAKTÄRER HOS KNÖLSKALLELÖJA FÖR PÅVISANDE AV VISSA ENDOKRINT AKTIVA KEMIKALIER

Översikt

Potentiellt viktiga kännetecken för det fysiska utseendet hos vuxna knölskallelöjor i tester av hormonstörande ämnen omfattar kroppsfärgen (dvs. ljus/mörk), färgmönster (dvs. förekomst eller avsaknad av vertikala strimmor), kroppsformen (dvs. formen på huvudet och det pektorala området, uttänjd buk), och särskilda sekundära könskaraktärer (dvs. parningstuberklernas antal och storlek, storleken på nackvalken och äggläggningsröret).

Parningstuberklerna återfinns på huvudet (nackvalken) på reproduktivt aktiva hanar av knölskallelöja, och sitter normalt i ett bilateralt symmetriskt mönster (Jensen m.fl., 2001). Kontrollhonor och unga hanar och honor utvecklar inte några tuberkler (Jensen m.fl., 2001). Det kan förekomma upp till åtta enskilda tuberkler runt ögonen och mellan hanarnas luktgropar. Det flesta och största tuberklerna är belägna i två parallella linjer omedelbart under luktgroparna och ovanför munnen. Många fiskar har grupper av tuberkler under underkäken. De som sitter närmast munnen förekommer i regel som ett enda par, medan de som är belägna mer ventralt kan bestå av upp till fyra tuberkler. Det faktiska antalet tuberkler är sällan mer än 30 (intervall 18–28, Jensen m.fl., 2001). De mest framträdande tuberklerna (mätt i antal) utgörs av en enda, relativt rund struktur med en höjd som ungefär motsvarar radien. De flesta reproduktivt aktiva hanar har också åtminstone några tuberkler som är förstorade och framträdande på ett sådant sätt att de inte kan särskiljas som enskilda strukturer.

Vissa typer av endokrinstörande kemikalier kan förorsaka abnorma förekomster av vissa sekundära könskaraktärer hos det motsatta könet. Agonister som påverkar androgenreceptorer, såsom 17α-metyltestosteron eller 17β-trenbolon, kan göra så att honor av knölskallelöja utvecklar tydliga parningstuberkler (Smith 1974, Ankley m.fl., 2001, 2003), medan agonister som påverkar östrogenreceptorer kan minska parningstuberklernas antal eller storlek hos hanar (Miles-Richardson m.fl., 1999, Harries m.fl., 2000).

Nedan följer en redogörelse av karakteriseringen av parningstuberkler hos knölskallelöja på grundval av de förfaranden som används vid USA:s Environmental Protection Agency i Duluth, Minnesota. Särskilda produkter och/eller utrustning kan ersättas med tillgängliga jämförbara material.

Fiskarna kan bäst observeras med hjälp av ett belyst förstoringsglas eller i ett belyst dissekeringsmikroskop med 3x förstoring. Observera fiskarna dorsalt och med den främre delen framåt (huvudet mot betraktaren).

Placera fisken i liten petriskål (t.ex. 100 mm i diameter), med främre delen framåt och buksidan nedåt. Fokusera sökaren för att göra det möjligt att identifiera tuberklerna. Rulla långsamt och försiktigt fisken från sida till sida för att identifiera tuberkelområdena. Räkna och klassificera tuberklerna.

Upprepa observationen på den ventrala huvudytan genom att placera fisken på ryggen med huvudet framåt i petriskålen.

Observationerna bör göras inom två minuter för varje fisk.

Tuberkelräkning och klassificering

Sex särskilda områden har fastställts för bedömning av förekomsten och utvecklingen av tuberkler hos vuxna knölskallelöjor. En mall har utarbetats för att kartlägga var och i vilket antal tuberklerna förekommer (se slutet av detta tillägg). Antalet tuberkler registreras och deras storlek rangordnas kvantitativt enligt följande: 0–saknas, 1–förekommer, 2–förstorad och 3–framträdande, för varje organism (figur 1).

Klassificering 0–saknas: avsaknad av tuberkler. Klassificering 1–förekommer: definieras som alla tuberkler som har en enda punkt vars höjd är nästan lika med dess radie. Klassificering 2–förstorad: definieras som en vävnad som liknar en asterisk, vanligtvis med en stor radial bas med räfflor eller fåror som utgår från medelpunkten. På höjden är tuberkeln ofta mer taggig men kan ibland vara något avrundad. Klassificering 3–framträdande: refererar till vanligtvis ganska stora och rundade tuberkler med mindre avgränsad struktur. Ibland växer dessa tuberkler ihop och utgör en enda massa längs ett enskilt område eller en kombination av områden (B, C och D enligt beskrivning nedan). Färgen och utformningen liknar dem för klassificering 2 men är ibland ganska godtyckliga. Med hjälp av detta klassificeringssystem får man i allmänhet ett totalt tuberkelpoängvärde på < 50 för en normal kontrollhane som har 18–20 tuberkler (Jensen m.fl., 2001).

Figur 1

Det faktiska antalet tuberkler hos vissa fiskar kan vara större än antalet mallrutor för ett visst klassificeringsområde. Om detta är fallet kan ytterligare klassificeringsnummer läggas till inom, till höger eller till vänster om rutan. Mallen måste därför inte vara symmetrisk. Ytterligare en metod för kartläggning av tuberklerna som sitter ihop två och två eller vertikalt längs munnens horisontalplan är att dubbelmarkera två tuberkelklassificeringspoäng i en enda ruta.

Kartläggningsregioner:

A – Tuberkler belägna runt ögat. Kartläggs från rygg till buk runt främre kanten på ögat. Vanligtvis i flertal hos fullt utvecklade kontrollhanar, saknas hos kontrollhonor, vanligtvis parvis (en nära varje öga) eller i ental hos honor som exponerats för androgener.

B – Tuberkler belägna mellan luktgroparna (sinneskanalporer). Vanligtvis parvis hos kontrollhanar vid mer förhöjda utvecklingsnivåer (2–förstorad eller 3–framträdande). Saknas hos kontrollhonor med viss förekomst och utveckling hos honor som exponerats för androgener.

C – Tuberkler belägna omedelbart framför luktgroparna, parallellt med munnen. I allmänhet förstorade eller framträdande hos fullt utvecklade kontrollhanar. Förekommer eller förstorade hos mindre utvecklade hanar eller androgenbehandlade honor.

D – Tuberkler belägna parallellt med munlinjen. I allmänhet klassificeras dessa som utvecklade hos kontrollhanar. Saknas hos kontrollhonor men förekommer hos androgenexponerade honor.

E – Tuberkler belägna på underkäken, nära munnen, vanligtvis små och vanligen i par. Varierar hos kontrollhanar och behandlade hanar samt behandlade honor.

F – Tuberkler belägna ventralt jämfört med E. Vanligen små och i par. Förekommer hos kontrollhanar och androgenexponerade honor.

LITTERATURHÄNVISNINGAR

1 Ankley, G. T., Jensen, K. M., Kahl, M. D., Korte, J. J. och Makynen, M. E. 2001. Description and evaluation of a short-term reproduction test with the fathead minnow (Pimephales promelas). Environ Toxicol Chem 20, 1276–1290.

2 Ankley, G. T., Jensen, K. M., Makynen, E. A., Kahl, M. D., Korte, J. J., Hornung, M. W., Henry, T. R., Denny, J. S., Leino, R. L., Wilson, V. S., Cardon, M. C., Hartig, P. C. och Gray, E. L. 2003. Effects of the androgenic growth promoter 17-β trenbolone on fecundity and reproductive endocrinology of the fathead minnow. Environ Toxicol Chem 22, 1350–1360.

3 Harries, J. E., Runnalls, T., Hill, E., Harris, C. A.,Maddix, S., Sumpter, J. P. och Tyler, C. R. 2000. Development of a reproductive performance test for endocrine disrupting chemicals using pair-breeding fathead minnows (Pimephales promelas). Environ Sci Technol 34, 3003–3011.

4 Jensen, K. M., Korte, J. J., Kahl, M. D., Pasha, M. S. och Ankley, G. T. 2001. Aspects of basic reproductive biology and endocrinology in the fathead minnow (Pimephales promelas). Comp Biochem Physiol C 128, 127–141.

5 Kahl, M. D., Jensen, K. M., Korte, J. J. och Ankley, G. T. 2001. Effects of handling on endocrinology and reproductive performance of the fathead minnow. J Fish Biol 59, 515–523.

6 Miles-Richardson, S. R., Kramer, V. J., Fitzgerald, S. D., Render, J. A., Yamini, B., Barbee, S. J. och Giesy. J. P. (1999). Effects of waterborne exposure of 17-estradiol on secondary sex characteristics and gonads of fathead minnows (Pimephales promelas). Aquat Toxicol 47, 129–145.

7 Smith, R. J. F. 1974. Effects of 17α-methyltestosterone on the dorsal pad and tubercles of fathead minnows (Pimephales promelas). Can J Zool 52, 1031–1038.

Tuberkelmall:

Klassificering

Date

1- förekommer

Poäng totalt

2- förstorad

3- framträdande

Tillägg 5B

BEDÖMNING AV SEKUNDÄRA KÖNSKARAKTÄRER HOS MEDAKA FÖR PÅVISANDE AV VISSA ENDOKRINT AKTIVA KEMIKALIER

Nedan följer en redogörelse av mätningen av de papillära utväxter som utgör de sekundära könskaraktärerna hos medaka (Oryzias latipes).

(1) Efter avlägsnandet av levern (tillägg 6) ska kroppen placeras i en konisk tub innehållande ca 10 ml 10 % neutralt buffrat formalin (huvudet uppåt, stjärten nedåt). Om könskörteln fixeras i en annan lösning än 10 % neutralt buffrat formalin lägger man ett transversellt snitt över kroppen mellan den främre delen av analfenan och anus med ett rakblad, samtidigt som man undviker att skada gonoporen och könskörteln i sig (figur 3). Placera den kraniala delen av fiskkroppen i fixeringslösningen för att bevara könskörteln, och stjärtdelen av fiskkroppen i 10 % neutralt buffrat formalin enligt beskrivning ovan.

(2) Efter att fiskkroppen placerats i 10 % neutralt buffrat formalin fattar man tag i analfenans främre del med en pincett och viker den i ca 30 sekunder så att analfenan hålls utspänd. När man lyfter upp analfenan med pincetten bör man försiktigt fatta tag i den främre delen så att man inte skadar de papillära utväxterna.

(3) Efter att anafenan hållits utspänd i ca 30 sekunder bevaras fiskkroppen i 10 % neutralt buffrat formalin vid rumstemperatur fram till mätningen av de papillära utväxterna (mätningen ska utföras efter fixering i minst 24 timmar).

Mätning

(1) Fiskkroppen fixeras i 24 % neutralt buffrat formalin i minst 24 timmar. Ta därefter upp fiskkroppen ur den koniska tuben och torka av formalinet på filterpapper (eller en pappersservett).

(2) Lägg fisken med buksidan upp. Skär sedan försiktigt av analfenan med en liten dissektionssax (det är lämpligt att skära av analfenan tillsammans med en liten bit vävnad från fenfästet (pterygiofor).

(3) Fatta tag i den främre delen av den avskurna analfenan med en pincett och lägg den på ett objektglas med flera droppar vatten. Täck därefter analfenan med ett täckglas. Var noga med att inte skada de papillära utväxterna när analfenan hålls fast med pincetten.

(4) Räkna antalet ledplattor med papillära utväxter med hjälp av räknaren under ett biologiskt mikroskop (upprätt eller inverterat mikroskop). De papillära utväxterna kan kännas igen på en liten bildning av utväxter som är synbar på den bakre kanten av fenstrålen. Skriv in antalet ledplattor med papillära utväxter på varje fenstråle i tabellen (t.ex. första fenstrålen: 0, andra fenstrålen: 10, tredje fenstrålen: 12 osv.), och skriv in summan av dessa antal i Excel-tabellen per enskild fisk. Vid behov kan man fotografera analfenan och räkna antalet ledplattor med papillära utväxter på fotot.

(5) Efter mätningen läggs analfenan i den koniska tuben som beskrivs i (1) och bevaras.

Fig.1. Diagram som visar könsskillnaden i analfenans storlek och form. A, hane, B, hona. Oka, T. B., 1931. On the processes on the fin rays of the male of Oryzias latipes and other sex characters of this fish. J. Fac. Sci., Tokyo Univ., IV, 2: 209–218.

Fig.2. A, Utväxter på fenstrålarnas ledplattor i analfenan. J.P. = ledplatta, A.S. = axelavstånd, P. = utväxt. B, Fenstrålens distala ände. Aktinotrikierna (Act.) sitter på spetsen. Oka, T. B., 1931. On the processes on the fin rays of the male of Oryzias latipes and other sex characters of this fish. J. Fac. Sci., Tokyo Univ., IV, 2: 209–218.

Fig.3. Fotografi av fiskkropp som visar var snittet ska läggas när könskörteln fixeras i en annan fixeringslösning än 10 % neutralt buffrat formalin. I detta fall ska den övriga kroppen skäras av mellan analfenans främre kant och analöppningen med ett rakblad (röd linje), och fiskkroppens huvudsida läggs sedan i samma fixeringslösning som könskörteln och stjärtsidan läggs i 10 % neutralt buffrat formalin.

1 Papillära utväxter förekommer normalt endast hos vuxna hanar och påträffas på den andra till den sjunde eller åttonde fenstrålen räknat från analfenans bakre kant (figur 1 och 2). Utväxterna förekommer sällan på den första fenstrålen från analfenans bakre kant. Detta standardförfarande omfattar mätning av utväxter på den första fenstrålen (fenstrålarna räknas i ordningsföljd från analfenans bakre kant i detta standardförfarande).

Tillägg 6

REKOMMENDERADE FÖRFARANDEN FÖR PROVTAGNING FÖR VITELLOGENINANALYS

Man bör vara noga med att undvika korskontaminering mellan VTG-prover från hanar och honor.

Förfarande 1A: Knölskallelöja, insamling av blod från stjärtvenen/-artären

Efter bedövning skärs stjärtspolen delvis av med en skalpell och blod insamlas från den kaudala venen/artären med ett hepariniserat mikrohematokrit-centrifugerat kapillärrör. Efter att blodet har samlats in isoleras plasman snabbt genom centrifugering vid 15000 g i 3 minuter (eller vid 15000 g i 10 minuter vid 4 °C). Om så önskas kan procentandelen hematokrit fastställas efter centrifugeringen. Plasmadelen avlägsnas sedan från mikrohematokritröret och lagras i ett centrifugrör med 0,13 enheter aprotinin (en proteashämmare) vid – 80 °C tills bestämningen av VTG kan göras. Beroende på knölskallelöjans storlek (som är könsbestämd) uppgår mängden blod som kan samlas in till 5–60 mikroliter per fisk (Jensen m.fl., 2001).

Förfarande 1B: Knölskallelöja, insamling av blod från hjärtat

Alternativt kan blod också samlas in genom hjärtpunktering med en hepariniserad spruta (1000 enheter heparin per ml). Blodet överförs till eppendorfrör (på is) och centrifugeras sedan (5 minuter, 7000 g, rumstemperatur). Plasman bör överföras till rena eppendorfrör (i alikvoter om plasmavolymen är tillräckligt stor) och omedelbart frysas vid –80 °C tills den kan analyseras (Panter m.fl., 1998).

Förfarande 2A: Medaka, utskärning av levern

Avlägsna testfisken från testbehållaren

(1) Testfisken bör avlägsnas ur testbehållaren med hjälp av en liten rund håv. Var noga med att inte tappa ner testfisken i de andra testbehållarna.

(2) I princip ska testfiskarna avlägsnas i följande ordning: kontroll, lösningsmedelskontroll (i förekommande fall), lägsta koncentrationen, mittersta koncentrationen, högsta koncentrationen och positiv kontroll. Dessutom bör alla hanar avlägsnas från en testbehållare innan de återstående honorna avlägsnas.

(3) Könet på varje testfisk fastställs på grundval av externa sekundära könskaraktärer (t.ex. formen på analfenan).

(4) Placera testfisken i en behållare för transport och för den till arbetsstationen där levern skärs ut. Kontrollera att etiketterna på testbehållaren och transportbehållaren stämmer och bekräfta att det antal fiskar som har avlägsnats från testbehållaren och den antal fiskar som återstår i behållaren stämmer överens med vad som förväntas.

(5) Om könet inte kan fastställas genom fiskens externa utseende avlägsnas alla fiskarna från testbehållaren. I detta fall bör könet identifieras genom granskning av könskörteln eller de sekundära könskaraktärerna under ett stereomikroskop.

Utskärning av levern

(1) Överför testfisken från transportbehållaren till bedövningslösningen med den lilla runda håven.

(2) Efter bedövning av testfisken överförs den till ett filterpapper (eller en pappersservett) med hjälp av en anatomisk pincett. När man lyfter upp testfisken bör man fatta tag med pincetten på sidorna av huvudet för att undvika att stjärten bryts av.

(3) Torka av vattnet på ytan av testfisken på filterpappret (eller pappersservetten).

(4) Lägg fisken med buksidan upp. Lägg därefter ett mindre tvärgående snitt halvvägs mellan den ventrala halsregionen och den mellersta abdominala regionen med hjälp av en dissektionssax.

(5) För in dissektionssaxen i det lilla snittet och öppna buken från en punkt som är belägen kaudalt från gälmanteln till den kraniala sidan av anus längs bukens mittlinje. Var noga med att inte föra in dissektionssaxen för djupt så att levern och könskörteln skadas.

(6) Utför följande steg under ett stereomikroskop.

(7) Placera testfisken med buksidan upp på pappersservetten (en petriskål av glas eller ett objektglas går också bra).

(8) Vik ut bukhålans väggar med en precisionspincett och blottlägg de inre organen. Det är även godtagbart att blottlägga de inre organen genom att vid behov avlägsna den ena sidan av bukhålans vägg.

(9) Blotta den del som förbinder levern med gallblåsan med hjälp av en annan precisionspincett. Tag därefter fatt i gallgången och skär av gallblåsan. Var noga med att inte skada gallblåsan.

(10) Tag fatt i matstrupen och skär loss mag-tarmkanalen från levern på samma sätt. Var försiktig så att inte tarminnehållet läcker ut. Skär loss den kaudala mag-tarmkanalen från anus och avlägsna den från bukhålan.

(11) Skär bort fettmassan och andra vävnader från leverns utsida. Var noga med att inte skada levern.

(12) Tag fatt i portasystemet med hjälp av en precisionspincett och avlägsna levern från bukhålan.

(13) Placera levern på objektglaset. Avlägsna om så behövs allt övrigt fett och all främmande vävnad (t.ex. bukhinna) från leverns yta med hjälp av precisionspincetten.

(14) Väg levern med ett 1,5 ml mikrorör som emballagevikt med en elektronisk analysvåg. Registrera värdet i en tabell (avläs: 0,1 mg). Bekräfta identifieringsinformationen på mikroröret som innehåller levern.

(15) Stäng mikrorörets lock. Förvara det i ett kylställ (eller ett isställ).

(16) När levern har avlägsnats diskas dissektionsinstrumenten eller ersätts med rena.

(17) Avlägsna levrarna från alla fiskar i transportbehållaren enligt beskrivning ovan.

(18) När levrarna har skurits ut från alla fiskarna i transportbehållaren (dvs. alla hanar och honor i en testbehållare) placeras alla leverprover i ett provrörsställ med en etikett för identifiering och förvaras i en frys. När levrarna förs vidare till förbehandlingen strax efter utskärningen bärs proverna till nästa arbetsstation i ett kylställ (eller isställ).

Efter utskärningen av levern kan en histologisk undersökning av könskörtlarna göras på fiskkroppen och sekundära könskaraktärer mätas.

Prov

Lagra leverproverna från testfiskarna vid ≤ – 70 °C om de inte ska användas i förbehandlingen kort efter utskärningen.

Fig-1 Ett snitt läggs precis framför bröstfenorna med en sax.

Fig-2 Buken öppnas längs mittlinjen med en sax till en punkt ungefär 2 mm kranialt från anus.

Fig-3 Bukväggarna öppnas med en pincett för blottläggning av levern och andra interna organ. (Alternativt kan bukväggarna fästas lateralt). Pilen visar levern.

Fig-4 Levern friläggs och avlägsnas utan att skära med hjälp av en peang.

Fig-5 Tarmarna dras försiktigt ut med hjälp av peangen.

Fig-6 Båda ändarna av tarmarna och eventuellt vidhängande tarmkäx klipps av med en sax.

Fig-7 (hona) Förfarandet är exakt detsamma för honor.

Fig-8 Det avslutade förfarandet.

Förfarande 2B: Medaka (Oryzias latipes), förbehandling av levern för vitellogeninanalys

Ta fram flaskan med homogenatbuffert från ELISA-utrustningen och kyl den med krossad is (lösningens temperatur: ≤ 4° C). Om man använder homogenatbuffert från EnBio:s ELISA-system ska lösningen tinas vid rumstemperatur. Kyl sedan ner flaskan med krossad is.

Beräkna volymen av homogenatbuffert för levern på grundval av dess vikt (tillsätt 50 μl av homogenatbuffert per mg av levervikten). Om levern till exempel väger 4,5 mg är homogenatbuffertens volym för levern 225 μl. Gör upp en förteckning över homogenatbuffertens volym för alla levrarna.

Förberedelse av levern för förbehandling

(1) Ta ut det 1,5 ml mikrorör som innehåller levern ur frysen strax före förbehandlingen.

(2) Förbehandlingen av levrar från hanar bör genomföras före förbehandlingen av honornas levrar för att undvika kontaminering av vitellogenin. Förbehandlingen för testgrupperna bör dessutom utföras i följande ordning: kontroll, lösningsmedelskontroll (i förekommande fall), lägsta koncentrationen, mittersta koncentrationen, högsta koncentrationen och positiv kontroll.

(3) Antalet 1,5 ml mikrorör som innehåller leverprover som tagits ut ur frysen vid en viss tidpunkt bör inte överstiga det antal som kan centrifugeras vid den tidpunkten.

(4) Ordna 1,5 ml mikrorören som innehåller leverprover efter de nummer proven har i isstället (levern behöver inte tinas).

Utförandet av förbehandlingen

1) Tillsats av homogenatbuffert

Kontrollera på förteckningen vilken volym av homogenatbuffert som ska användas för ett visst leverprov och ställ in mikropipetten (volymintervall: 100–1000 μl) på den lämpliga volymen. Fäst en ren spets på mikropipetten.

Pipettera upp homogenatbuffert från reagensflaskan och tillsätt 1,5 ml buffert i det 1,5 ml mikrorör som innehåller levern.

Tillsätt homogenatbuffert i alla 1,5 ml mikrorör som innehåller levrar enligt det förfarande som beskrivs ovan. Det finns ingen anledning att byta ut mikropipettspetsen med en ny. Om spetsen har blivit kontaminerad eller misstänks vara kontaminerad bör den dock bytas ut.

2) Homogenisering av levern

Fäst en ny mortelstöt för homogenisering på mikrorörshomogenisatorn.

För in mortelstöten i 1,5 ml mikroröret. Håll mikrorörshomogenisatorn och pressa levern mellan mortelstötens yta och innerväggen på 1,5 ml mikroröret.

Kör mikrorörshomogenisatorn i 10–20 sekunder. Kyl ner 1,5 ml mikroröret med krossad is när detta görs.

Ta ut mortelstöten från 1,5 ml mikroröret och låt det stå i ca 10 sekunder. Kontrollera därefter suspensionen visuellt.

Om man kan se delar av lever i suspensionen ska steg (3) och (4) upprepas tills ett godtagbart leverhomogenat har beretts.

Kyl ner det suspenderade leverhomogenatet i isstället till dess att centrifugeringen utförs.

Byt ut mortelstöten mot en ny för varje homogenat.

Homogenisera alla levrar med homogenatbuffert enligt det förfarande som beskrivs ovan.

3) Centrifugering av det suspenderade leverhomogenatet

Bekräfta att temperaturen i kylcentrifugkammaren är ≤ 5 °C.

Ställ in 1,5 ml mikrorören som innehåller de suspenderade leverhomogenaten i kylcentrifugen (justera jämvikten vid behov).

Centrifugera de suspenderade leverhomogenaten vid 13000 g i 10 minuter vid ≤ 5 °C. Om supernatanterna är tillräckligt separerade kan dock centrifugalkraften och varaktigheten justeras efter behov.

Efter centrifugeringen kontrolleras att supernatanterna är tillräckligt separerade (yta: fett, mellanparti: supernatant, bottenskikt: levervävnad). Om skikten inte är tillräckligt separerade centrifugeras suspensionen igen under samma betingelser.

Avlägsna alla prov från kylcentrifugen och ordna dem efter de nummer proven har i isstället. Var noga med att inte återsuspendera de åtskilda skikten efter centrifugeringen.

4) Insamling av supernatanten

Placera fyra 0,5 ml mikrorör i provrörsstället för lagring av supernatanten.

Samla in 30 μl supernatant (separerad som det mellanliggande skiktet) med mikropipetten och tillsätt supernatanten till ett 0,5 ml mikrorör. Var noga med att inte få med fettet på ytan eller levervävnaden i det undre lagret.

Samla in supernatanten och tillsätt den till två andra 0,5 ml mikrorör på samma sätt som beskrivs ovan.

Samla in resten av supernatanten med mikropipetten (om möjligt: ≥ 100 μl). Tillsätt därefter supernatanten till de återstående 0,5 ml mikrorören. Var noga med att inte få med fettet på ytan eller levervävnaden i det undre lagret.

Stäng locket på 0,5 ml mikroröret och anteckna supernatantens volym på etiketten. Kyl därefter omedelbart ner mikrorören i isstället.

Byt ut spetsen på mikropipetten till en ny för varje supernatant. Om en stor mängd fett fäster sig vid spetsen bör den omedelbart bytas ut med en ny för att undvika kontaminering av leverextraktet med fett.

Fördela hela den centrifugerade supernatanten i 0,5 ml mikrorör enligt det förfarande som beskrivs ovan.

Efter att supernatanten har tillsatts till 0,5 ml mikrorör placeras de alla i provrörsstället med identifieringsetiketten och fryses sedan omedelbart ner i frysen. Om VTG-halterna ska mätas omedelbart efter förbehandlingen hålls ett 0,5 ml mikrorör (med 30 μl supernatant) kallt i provrörsstället och överförs sedan till arbetsstationen där ELISA-testet utförs. I ett sådant fall ska alla övriga mikrorör placeras i provrörsställen och frysas ner i frysen.

Efter insamling av supernatanten kasseras restprodukterna på lämpligt sätt.

Lagring av provet

Lagra 0,5 ml mikrorören som innehåller supernatanten av leverhomogenatet vid ≤ – 70 °C tills de används för ELISA-testet.

Förfarande 3A: Sebrafisk, insamling av blod från den kaudala venen/artären

Omedelbart efter bedövning skärs stjärtspolen av transversalt, och blodet insamlas från den kaudala artären/venen med ett hepariniserat mikrohematokrit-centrifugerat kapillärrör. Volymerna blod varierar mellan 5 och 15 mikroliter beroende på fiskens storlek. En lika stor mängd buffertlösning med aprotinin (6 mikrogram i fosfatbuffrad saltlösning (PBS)) tillsätts i mikrokapillärröret och plasman separeras från blodet genom centrifugering (5 minuter vid 600 g). Plasman samlas i provrören och lagras vid – 20 °C tills de analyseras med avseende på VTG eller andra proteiner av intresse.

Förfarande 3B: Sebrafisk, insamling av blod genom hjärtpunktering

För att undvika koagulering av blod och nedbrytning av proteiner tas proven i en buffertlösning bestående av fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som innehåller heparin (1000 enheter/ml) och proteashämmaren aprotinin (2 TIU/ml). Som ingredienser i buffertlösningen rekommenderas heparin, ammoniumsalt och frystorkad aprotinin. För blodprovstagning rekommenderas en spruta (1 ml) med en fast tunn nål (t.ex. Braun omnikan-F). Sprutan ska fyllas på förhand med en buffert (ca 100 mikroliter) för att helt eluera de små blodvolymerna från varje fisk. Blodproven tas genom hjärtpunktering. Till att börja med bör fisken bedövas med MS-222 (100 mg/l). En lämplig bedövningsnivå gör det möjligt för användaren att urskilja sebrafiskens hjärtslag. Medan hjärtpunkteringen utförs ska sprutans kolv hållas under svagt tryck. Samla in blodvolymer på mellan 20 och 40 ml. Efter hjärtpunkteringen ska blod/buffert-blandningen tillsättas i provröret. Plasman separeras från blodet genom centrifugering (20 min., 5000 g) och bör förvaras vid – 80 °C tills den behövs för analys.

Förfarande 3C: Standardförfarande: Sebrafisk, homogenisering av huvud och stjärt

1. Fiskarna bedövas eller avlivas i enlighet med testbeskrivningen.

2. Huvudet och stjärten skärs av i enlighet med figur 1. Obs: Alla dissektionsinstrument och skärbrädan bör sköljas och rengöras ordentligt (t.ex. med 96 % etanol) mellan hanteringen av varje enskild fisk för att förhindra vitellogenin-förorening från honor eller inducerade hanar till oinducerade hanar. Figur 1 För gonadhistologi Skär bakom Skär bakom ryggfenan För Vtg-analys För Vtg-analys

3. Den sammanlagda vikten av huvud och stjärt från varje fisk mäts till närmaste mg.

4. Efter vägning placeras delarna i lämpliga rör (t.ex. 1,5 ml eppendorfrör) och fryses vid – 80 °C tills homogeniseringen, eller homogeniseras direkt på is med två mortelstötar av plast. (Andra metoder kan användas om de utförs på is och resultatet är en homogen massa). Obs: Rören ska numreras noggrant så att fiskarnas huvud och stjärt kan hänföras till deras respektive kroppar, som används för histologisk undersökning av könskörtlarna.

5. När en homogen massa erhållits tillsätts iskall homogeniseringsbuffertlösning med en mängd på 4 gånger vävnadens vikt. Fortsätt att arbeta med mortelstötarna tills blandningen är homogen. Obs: Nya mortelstötar används för varje fisk.

6. Proven läggs på is tills centrifugeringen vid 4 °C och 50000 g i 30 minuter.

7. Använd en pipett för att dosera ut portioner på 20 μl supernatant i minst två rör genom att doppa pipettens spets under fettlagret på ytan och försiktigt suga upp supernatanten utan att få med fragment av fett eller små bitar.

8. Rören förvaras vid – 80 °C fram till användningen.

1 Buffertlösning för homogenisering 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 % proteashämmarblandning (Sigma): 12 ml Tris-HCl pH 7,4 + 120 μl proteashämmarblandning. TRIS: TRIS-ULTRA PURE (ICN), t.ex. från Bie & Berntsen, Danmark. Proteashämmarblandning: Från Sigma (för däggdjursvävnader), produkt nr P 8340. Anmärkning: Buffertlösningen för homogenisering bör användas samma dag som den beretts. Lägg den på is under användningen.

Tillägg 7

VITELLOGENINBERIKNINGSPROVER OCH REFERENSSTANDARD FÖR TESTER MELLAN LABORATORIER

Varje dag som VTG-tester utförs ska ett berikningsprov analyseras som beretts med en referensstandard för tester mellan laboratorier. VTG som används för beredning av referensstandarden för tester mellan laboratorier ska komma från en annan sats än den som används för att bereda kalibreringsstandarderna för det test som utförs.

Ett berikningsprov bereds genom att man tillsätter en känd mängd av referensstandarden för tester mellan laboratorier till ett prov med plasma från kontrollhanar. Provet berikas tills en VTG-koncentration på mellan 10 och 100 gånger den förväntade vitellogeninkoncentrationen i hanliga kontrollfiskar uppnås. Det berikade provet med hanlig kontrollplasma kan komma från en enda fisk eller vara en blandning av flera olika fiskar.

Ett delprov av den oberikade hanliga kontrollplasman analyseras i minst två duplikatbrunnar. Det berikade provet analyseras också i minst två duplikatbrunnar. Den genomsnittliga mängden vitellogenin i de två icke-berikade hanliga kontrollproven läggs till den beräknade mängden VTG som lagts till berikningsproverna i syfte att fastställa en förväntad koncentration. Förhållandet mellan denna förväntade koncentration och den uppmätta koncentrationen rapporteras tillsammans med resultaten från varje försöksomgång som utförs på samma dag.

Tillägg 8

FLÖDESSCHEMA ÖVER BESLUTSGÅNGEN FÖR DEN STATISTISKA ANALYSEN

Variansstabiliserande

omvandling?

Replikatmedelvärden normalfördelade

Dunns test på replikatmedel-värden

Dunnetts test på hierarkisk

ANOVA

Dunns eller Mann-

Whitneys test på

replikatmedelvärden

Replikatmedelvärden normala och homogena

Replikatmedelvärden ej normalfördelade

Jonckheeres eller Williams test (stepdown)

Normaliseringsomvandling?

Tamhane-Dunnetts test på

hierarkisk ANOVA

Yes

Nej

> = 4 repl. per

konc.

< = 3 repl. per konc.

Dunn eller Mann-Whitney test

Dunn test

< = 3 repl. per konc.

> = 4 repl. per konc.

Tamhane-Dunnetts test

Normaliserings-omvandling?

Hierarkisk ANOVA normal

Hierarkisk ANOVA ej normal

Nej

Variansstabiliserande omvandling?

Varianserna olika

Dunnett test

Varianserna

lika

Step-downgrundat Jonckheeres test

Replikatmedelvärden ej normala el. ej homogena

Step-downtrendtest på replikatmedelvärden

Ej monoton

Monoton

Avgör om dos-responsen är monoton

Tillägg 1

DEFINITIONER

Tillägg 2

UNDERHÅLL, UPPFÖDNING OCH TYPISKA FÖRHÅLLANDEN FÖR AKUT TOXICITETSTEST AV SEBRAFISKEMBRYON

Sebrafisk (Danio rerio)

Arternas ursprung | Indien, Burma, Malacka, Sumatra

Könsdimorfism | Honor: utskjutande mage när de bär ägg. Hanar: slankare, orange nyans mellan blå längsgående ränder (särskilt tydligt vid analfenan).

Utfodring | Torrflingfoder (max. 3 % fiskens vikt per dag) 3–5 gånger dagligen, dessutom naupliuslarver av saltkräftor (Artemia) och/eller små hinnkräftor (Daphnia) av lämplig storlek från en oförorenad källa. Utfodring med levande foder innebär en miljöberikning och levande foder bör därför ges när så är möjligt. För att garantera optimal vattenkvalitet bör matrester och avföring avlägsnas cirka en timme efter utfodring.

Ungefärlig vikt för en vuxen fisk | Honor: 0,65 ± 0,13 g Hanar: 0,5 ± 0,1 g

Underhåll av föräldrafiskar | Belysning | Fluorescerande lampor (brett spektrum), 10–20 μE/m2/s, 540–1080 lux, eller 50–100 ft-c (liknande ljuset i laboratoriet), 12–16 timmars ljusperiod.

Vattentemperatur | 26 ± 1 °C.

Vattenkvalitet | O2 ≥ 80 % mättnad, hårdhet: t.ex. ~30–300 mg/l CaCO3, NO3–: ≤ 48 mg/l, NH4+ och NO2–: < 0,001 mg/l, restklor < 10 μg/l, totalt organiskt klor < 25 ng/l, pH = 6,5–8,5.

Ytterligare kriterier för vattenkvalitet | Partiklar < 20 mg/l, totalt organiskt kol < 2 mg/l, total mängd bekämpningsmedel som innehåller organiska fosforföreningar < 50 ng/l, total mängd bekämpningsmedel som innehåller organiska klorföreningar plus polyklorerade bifenyler < 50 ng/l.

Tankstorlek för underhåll | t.ex. 180 liter, 1 fisk/l.

Vattenrening | Permanent (kolfiltrerad), andra möjligheter är kombinationer med semistatiskt förnyelseunderhåll eller genomflödessystem med kontinuerlig vattenförnyelse.

Rekommenderad kvot hanar/honor för uppfödning | 2:1 (eller masslek).

Lektankar | T.ex. 4-literstankar utrustade med stålnätbotten och konstgjorda växter som lekstimulans, externa värmemattor eller masslek i underhållstankar.

Äggens struktur och utseende | Stabil yttre fosterhinna (dvs. mycket transparent, ej klibbig, diameter ~ 0,8–1,5 mm).

Äggläggning | En enda mogen hona lägger minst 50–80 ägg per dag. Beroende på stam kan antalet ägg vara avsevärt högre. Befruktningsgraden bör vara ≥ 70 %. För fisk som leker första gången kan äggens befruktningsgrad vara lägre vid de första äggläggningstillfällena.

Testtyp | Statisk, semistatisk förnyelse, genomflöde, 26 ± 1 °C, 24-timmars konditionerade testbehållare (t.ex. 24-hålsplattor, 2,5–5 ml per hål).

Tillägg 3

NORMAL UTVECKLING AV SEBRAFISK VID 26 °C

Figur 1: Valda tidiga utvecklingsstadier för sebrafisk (Danio rerio): 0,2–1,75 timmar efter befruktning (från Kimmel m.fl., 1995 (35)). Tidssekvensen för normal utveckling kan användas för att fastställa både befruktning och äggens livskraft (se punkt 26: Urval av befruktade ägg).

Figur 2: Valda sena utvecklingsstadier för sebrafisk (Danio rerio) (embryona tas ur den yttre fosterhinnan för optimerad synlighet): 22–48 timmar efter befruktning (från Kimmel m.fl., 1995 (35)).

Figur 3: Normal utveckling för sebrafiskembryon (Danio rerio): 1) 0,75 tim., 2-cellstadiet, 2) 1 tim., 4-cellstadiet, 3) 1,2 tim., 8-cellstadiet, 4) 1,5 tim., 16-cellstadiet, 5) 4,7 tim. epiboli inleds, 6) 5,3 tim., cirka 50 % epiboli (från Braunbeck & Lammer 2006 (40)).

Tillägg 4

Figur 1 Utformning av 24-hålsplattor

Figur 2 Översikt av testförfarandet för akut toxicitet hos sebrafiskembryon (från vänster till höger): äggproduktion, insamling av ägg, förexponering omedelbart efter befruktning i glaskärl, urval av befruktade ägg med inverterat mikroskop eller kikare, samt fördelning av befruktade ägg till 24-hålsplattor som förberetts med respektive testkoncentrationer/kontroller, n = antal ägg som krävs per teskoncentration/kontroll (här 20), hpf = timmar efter befruktning.

Urval avbefruktade ägg och beastämning av fertiliseringsgrad

Glaskärl med respektive testkon- centrationer/kontroller i volymer som helt täcker äggen

Avfall

2n ägg per konc./ kontroll

Lekenhet

24-timmars för- konditionering

antal befruktade ägg per testkoncentra- tion/kontroll

≤ 3 hpf

≤ 1,5 hpf

0 hpf

Tillägg 5

ÖVERSIKT AV DÖDLIGA ENDPOINTS FÖR AKUT TOXICITETSTEST HOS SEBRAFISKEMBRYON.

Följande apikala endpoints indikerar akut toxicitet och därmed dödlighet för embryon: koagulering av embryot, ej lossad svans, avsaknad av somitbildning och avsaknad av hjärtslag. Följande mikroskopbilder har valts ut för att illustrera dessa endpoints:

Figur 1 Koagulering av embryot:

I ljusfältsbelysning visar koagulerade sebrafiskembryon en variation av ogenomskinliga inneslutningar.

Figur 2 Avsaknad av somitbildning:

Även om utvecklingen försenas med cirka 10 timmar visar det 24 timmar gamla sebrafiskembryot i a) välutvecklade somiter (→), medan embryot i b) inte visar några tecken på somitbildning (→). Även om det 48 timmar gamla sebrafiskembryot i c) har en uttalad blödning i gulesäcken (*) uppvisar det en annorlunda somitbildning (→), medan det 96 timmar gamla sebrafiskembryot som avbildas i d) inte visar några tecken på somitbildning (→). Notera också ryggradskrökningen (skolios) och blödningen i hjärtsäcken (*) hos det embryo som visas i d).

Figur 3 Ej avlossad svansknopp i sidovy

(a: →, 96 timmar gammalt sebrafiskembryo). Notera också avsaknaden av ögonknopp (*).

Figur 4 Avsaknad av hjärtslag

Avsaknad av hjärtslag är per definition svårt att illustrera i en mikroskopbild. Avsaknad av hjärtslag påvisas genom avsaknad av sammandragningar av hjärtat (dubbelpilen). Orörliga blodkroppar, t.ex. aorta abdominalis (→ insticksbilden) är inte en indikator på avsaknad av hjärtslag. Notera också avsaknaden av somitbildning hos detta embryo (*, homogent snarare än segmentellt utseende hos muskelvävnader). Observationstiden för att registrera avsaknad av hjärtslag bör vara minst en minut med en minsta förstoring på 80 x.

Tillägg 1

DEFINITIONER

Biomassa: färskvikt och/eller torrvikt av levande materia i en population. I detta test är biomassan summan av huvudskottet, alla sidogrenar och alla rötter.

Kemikalie: ett ämne eller en blandning.

Kloros: förändring hos testorganismens färg, från grön till gulfärgad, särskilt på kransarna.

ECx: den koncentration av testkemikalien upplöst i vatten som inom en fastställd exponeringsperiod leder till en minskning på x % (t.ex. 50 %) av tillväxten hos Myriophyllum spicatum (omnämns uttryckligen vid avvikelse från fullständig eller normal testperiod). För att entydigt ange om EC-värdet bygger på tillväxthastighet eller producerad mängd biomassa används beteckningen ErC för tillväxthastighet och EyC för producerad mängd biomassa, åtföljt av mätvariabeln, t.ex. ErC (huvudskottets längd).

Tillväxt: en ökning av mätvariabeln under testperioden, t.ex. huvudskottets längd, total längd för sidogrenar, total skottlängd, total rotlängd, färskvikt, torrvikt eller antal kransar.

Tillväxttakt (genomsnittlig specifik tillväxthastighet): logaritmisk ökning av mätvariabeln under exponeringstiden. Anmärkning: Responsvariabler som är relaterade till tillväxttakten är inte beroende av testets varaktighet så länge tillväxtmönstret för oexponerade kontrollmekanismer är exponentiellt.

Lägsta koncentration med observerad effekt (LOEC – Lowest Observed Effect Concentration): den lägsta testade koncentration vid vilken man kan fastställa att testkemikalien har en statistiskt signifikant hämmande effekt på tillväxten (vid p < 0,05) inom en given exponeringstid, jämfört med kontrollen. Alla testkoncentrationer ovanför LOEC bör ha skadliga verkningar som är lika stora som eller större än de verkningar som observeras vid LOEC. Om dessa två villkor inte är uppfyllda bör en fullständig förklaring ges till hur man har valt LOEC (och därmed NOEC).

Mätvariabler: alla slags variabler som mäts för att uttrycka testets endpoint med hjälp av en eller flera responsvariabler. I denna testmetod är mätvariablerna huvudutskottets längd, total längd för sidogrenar, total skottlängd, total rotlängd, färskvikt, torrvikt eller antal kransar.

Monokultur: kultur bestående av en enda art.

Nekros är död vävnad (dvs. vit eller mörkbrun) hos testorganismen.

Nolleffektkoncentration (NOEC – No Observed Effect Concentration): testkoncentrationen omedelbart under LOEC.

Responsvariabel: variabel för bestämning av toxicitet. Variabeln fås fram genom att olika beräkningsmetoder tillämpas på uppmätta parametrar för biomassa. I den aktuella metoden är tillväxthastighet och producerad mängd biomassa responsvariabler som beräknas med hjälp av mätvariabler såsom huvudskottets längd, total skottlängd, färskvikt, torrvikt eller antal kransar.

Semistatiskt testförfarande (med regelbunden förnyelse av testlösning): test där testlösningen byts med bestämda intervall under testet.

Statiskt testförfarande: testmetod utan regelbunden förnyelse av testlösningen under testet.

Testkemikalie: varje ämne eller blandning som testas med denna testmetod.

Endpoint: den allmänna faktor som genom inverkan av en testkemikalie förändras jämfört med ett kontrollprov utan testkemikalie. I det aktuella testet är endpointen tillväxthämning, som kan uttryckas med olika responsvariabler baserade på en eller flera mätvariabler.

Testmedium: syntetiskt odlingsmedium i vilket testplantorna växer när de exponeras för testkemikalien. Testkemikalien är vanligen löst i testmediet.

UVCB-ämne: ämne med okänd eller varierande sammansättning, komplexa reaktionsprodukter eller biologiskt material.

Producerad mängd biomassa: värdet på en mätvariabel i slutet av exponeringstiden minus motsvarande värde i början av exponeringstiden. Anmärkning: Om tillväxtmönstret för oexponerade organismer är exponentiellt minskar responsvariabler som är baserade på producerad mängd biomassa under testets varaktighet.

Tillägg 2

MODIFIERAT ANDREWSMEDIUM FÖR STAMKULTUR OCH FÖRKULTUR.

Det modifierade Andrewsmedium som behövs för stamkulturen och förkulturen fås fram med fem separat beredda näringsstamlösningar med tillsats av 3 % sackaros.

Produktion av näringsstamlösningar | Produktion av näringslösning

Stamlösning | Kemikalie | Initial vikt per 1000 ml | ml per 5 liter näringslösning

1 | KCl | 74,6 mg | 50

KNO3 | 8,08 g

Ca(NO3)2 × 4 H2O | 18,88 g

2 | MgSO4 × 7 H2O | 9,86 g | 50

3 | Se stamlösning 3.1 nedan | 50

4 | KH2PO4 | 2,72 g | 50

5 | FeSO4 × 7 H2O | 0,278 g | 50

Na2EDTA × 2 H2O | 0,372 g

Stamlösningar kan förvaras i kylskåp i sex månader (vid 5–10 °C). Endast stamlösning nr 5 har en reducerad hållbarhetstid (två månader).

Kemikalie | Initial vikt g/100 ml

MnSO4 × 4 H2O | 0,223

ZnSO4 × 7 H2O | 0,115

H3BO3 | 0,155

CuSO4 × 5 H2O | 0,0125

(NH4)6Mo7O24 × 4 H2O | 0,0037

När stamlösning 3.1 har producerats (tabell 2) djupfryses lösningen i portioner på cirka 11 ml (temperaturen får inte överstiga – 18 °C). De djupfrysta portionerna har en hållbarhetstid på fem år.

För att producera stamlösning 3, tina upp stamlösning 3.1, häll 10 ml av den i en enliters mätkolv och tillsätt ultrarent vatten upp till kolvens markering.

För att få fram det modifierade Andrewsmediet, häll cirka 2500 ml ultrarent vatten i en femliters mätkolv. När 50 ml av varje stamlösning har tillsatts, fyll 90 % av mätkolven med ultrarent vatten och ställ in pH på 5,8.

Tillsätt därefter 150 g upplöst sackaros (3 % per 5 l) och fyll mätkolven med ultrarent vatten upp till markeringen. Häll till sist näringsläsningen i enliters Schottkolvar och autoklavera vid 121 °C i 20 minuter.

Den näringslösning som fås fram på detta sätt kan hållas steril i kylskåp vid (5–10 °C) i tre månader.

Modifierat Andrewsmedium för toxicitetstest utan sediment

Det tiofaldigt koncentrerade modifierade Andrewsmedium som krävs för att få fram testlösningarna bereds av de fem näringsstamlösningar som anges i tabellerna 1 och 2, med tillsats av 30 % sackaros. Häll cirka 100 ml ultrarent vatten i en enliters mätkolv. Tillsätt 100 ml av var och en av stamlösningarna, ställ in pH på 5,8. Tillsätt därefter 30 % upplöst sackaros (300 g per 1000 l) och fyll mätkolven med ultrarent vatten upp till markeringen.

Häll till sist näringsläsningen i halvliters Schottkolvar och autoklavera vid 121 °C i 20 minuter.

Den tiofaldigt koncentrerade modifierade näringslösning som fås fram på detta sätt kan hållas steril i kylskåp vid (5–10 °C) i tre månader.

Tillägg 3

BEHANDLING AV STAMKULTURER

I tillägg 3 beskrivs stamkulturen av Myriophyllum spicatum L, en submers tvåhjärtbladig växt som hör till slingesläktet. Mellan juni och augusti sticker nästan omärkliga rosa-vita blommor upp ovanför vattenytan. Växterna är rotade i botten genom ett system av robusta jordstammar och förekommer på hela norra halvklotet i näringsrika, ej förorenade och kalkrika stillastående vatten med lerigt substrat. Axslinga föredrar sötvatten, men förekommer även i bräckt vatten.

För stamkulturer utan sediment under laboratorieförhållanden krävs sterila plantor. Sterila plantor kan erhållas från det toxikologiska laboratoriet vid tyska Umweltbundesamt (Tysklands federala miljöbyrå).

Alternativt kan testorganismer beredas av icke-sterila växter i enlighet med ASTM-beteckning E 1913-04. Se nedan – utdrag från ASTM Standard Guide – förfarande för odling av Myriophyllum sibiricum som hämtats från naturen:

Om icke-sterila plantor som hämtas från naturen används som utgångspunkt, samla in rotskott från M. sibiricum under hösten. Placera rotskotten i ett 20-litersakvarium med 5 cm sterilt sediment som är täckt med kvartssand eller t.ex. av Turface® och 18 liter reagensvatten. Lufta akvariet och upprätthåll en temperatur på 15 °C och en fluensgrad på 200–300 μmol m-2 s-1 under 16 timmar per dag. Växtkulturen i akvariet kan bevaras som en reservväxtkälla om de sterila växtkulturerna förstörs genom mekaniska fel i odlingskammaren, förorening eller av andra orsaker. De växter som odlas i akvariet är inte sterila och sterila kulturer kan inte bevaras i kulturens odlingssystem. För att sterilisera kulturen avlägsnas växterna från akvariet och sköljs under rinnande avjonat vatten i cirka en halvtimme. Växterna desinficeras under aseptiska förhållanden i ett dragskåp med laminärt luftflöde under mindre än 20 minuter (tills den största delen av växtvävnaden har blekts och endast den växande spetsen fortfarande är grön) i en lösning av 3 % (w/v) natriumhypoklorit som innehåller 0,01 % av ett lämpligt ytaktivt medel. Skaka desinfektionsmedlet och växtmaterialet. Segment med flera knutar överförs till sterila odlingsrör innehållande 45 ml steriliserat modifierat Andrewsmedium och tillsluts med vanliga lock för kulturer. Endast ett växtsegment placeras i varje testkärl. Laboratorieförseglingsfilm används för att se till att odlingskärlet är tillslutet. När en steril kultur har etablerats bör växtsegment som innehåller flera knutar överföras till nya testkärl som innehåller färska flytande näringsmedier varje tionde till tolfte dag. Genom odling på agarplattor ska det visas att växterna är sterila och förblir så i åtta veckor innan testningen inleds.

Eftersom det modifierade Andrewsmediet innehåller sackaros (som stimulerar tillväxten av svampar och bakterier) måste allt material och alla lösningar framställas och odlingen ske under sterila förhållanden. Alla vätskor samt utrustning steriliseras före användning. Sterilisering sker genom varmluftsbehandling (210 °C) i fyra timmar eller autoklavering i 20 minuter vid 121 °C. Dessutom ska alla kolvar, tallrikar, skålar osv. och annan utrustning genomgå flambehandling på en steril arbetsbänk strax före användning.

Stamkulturer kan förvaras vid reducerad belysning och låg temperatur (50 μE m-2 s-1, 20 ± 2 °C) under lång tid utan att de behöver startas på nytt. Odlingsmediet för Myriophyllum bör vara samma som det som används i testen, men för stamkulturer kan andra näringsrika medier användas.

Växtsegmenten fördelas axeniskt mellan flera 500 ml Erlenmeyerkolvar och/eller 2000 ml Fernbachkolvar. Varje kolv fylls med cirka 450 respektive 1000 ml modifierat Andrewsmedium. Därefter försluts kolvarna axeniskt med cellulosaproppar.

Dessutom är en grundlig flambehandling av utrustningen vid en steril arbetsbank precis före användning absolut nödvändig. Beroende på antal och storlek överförs växterna till en färsk näringslösning ungefär var tredje vecka.

Spetsar och segment av stammens mittdel kan användas för denna förnyade kultur. Antal och storlek på överförda växter (eller växtsegment) beror på hur många växter som behövs. Man kan t.ex. överföra fem skottsegment till en Fernbachkolv och tre skottsegment till en Erlenmeyerkolv, var och en med en längd på 5 cm. Rotade, blommande, döda eller på annat sätt iögonenfallande delar kasseras.

Figur 1 Klippning av plantor för stam- och förkulturen efter tre veckors odling.

avfall

förkultur

stamkultur

Växterna odlas i 500 ml Erlenmeyerkolvar och 2000 ml Fernbachkolvar kolvar i en kylinkubator vid 20 ± 2 oC med kontinuerligt ljus vid ungefär 100–150 μE m-2 s-1 eller 6000–9000 lux (testkärlets belysning med varmt vitt ljus).

Figur 2 Växtodling i en kylinkubator med belysning av testkärlen.

Använd kemiskt rena (syratvättade) och sterila odlingskärl av glas. Hanteringen ska ske med aseptiska metoder. Om stamkulturen förorenas av t.ex. alger, svamp och/eller bakterier bör man bereda en ny kultur eller använda en stamkultur från ett annat laboratorium för att ersätta den förorenade kulturen.

1 Carl von Linné (* 23 maj 1707 i Råshult/Älmhult, † 10 januari 1778 i Uppsala).

Tillägg 4

UNDERHÅLL AV FÖRKULTUR OCH BEREDNING AV TESTORGANISMEN FÖR TESTET

För att få fram en förkultur klipper man skott från stamkulturen i segment med två kransar var. Segmenten placeras i Fernbachkolvar fyllda med modifierat Andrewsmedium (med 3 % sackaros). Varje kolv kan innehålla upp till 50 skottsegment. Det är dock viktigt att se till att segmenten är livskraftiga och inte har rötter, sidogrenar eller knoppar (se figur 1 i tillägg 3).

Förkulturens organismer odlas under 14 till 21 dagar under sterila förhållanden i klimatodlingskammare med omväxlande 16-/8-timmars ljus-/mörkerfaser. Ljusintensiteten väljs från intervallet 100–150 μE m– 2 s– 1. Temperaturen i testkärlen bör vara 23 ± 2 °C.

Eftersom det modifierade Andrewsmediet innehåller sackaros (som stimulerar tillväxten av alger, svampar och bakterier) bör testkemikalielösningarna beredas och odlingen ske under sterila förhållanden. Alla vätskor samt utrustning steriliseras före användning. Sterilisering sker via varmluftsbehandling (210 °C) under fyra timmar eller autoklavering under 20 minuter vid 121 °C. Dessutom ska alla kolvar, tallrikar, skålar osv. och annan utrustning genomgå flambehandling på en steril arbetsbänk strax före användning.

Skotten avlägsnas axeniskt från förkulturkolvarna. Välj så homogent material som möjligt. Varje test kräver minst 60 testorganismer (testning sker med åtta koncentrationer av testkemikalien). För testningen tas färska sidogrenar från förkulturerna. Korta av dem till 2,5 cm från basen (mätt med linjal) och överför dem till en bägare med sterilt modifierat Andrewsmedium. De färska sidogrenarna kan användas för toxicitetstest på Myriophyllum spicatum utan sediment.

Figur 2: Klippning av plantor från förkulturen för toxicitetstest på Myriophyllum spicatum utan sediment.

avfall eller ytterligare odling

färska sidogrenar för testet

Tillägg 1

SAMMANSÄTTNING HOS SMART- OCH BARKO-MEDIER

Komponent | Mängd reagens som tillsätts vattnet (mg/l)

CaCl2 · 2 H2O | 91,7

MgSO4 · 7 H2O | 69,0

NaHCO3 | 58,4

KHCO3 | 15,4

pH (jämviktsläge luft) | 7,9

1 Demineraliserat (dvs destillerat eller avjoniserat) vatten